Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
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MBS riconosce il supporto di LABEX VALO GRAL ai sensi del contratto 2015. NJ riconosce il Programma internazionale di ricerca di dottorato (Irtelis) del CEA per la Borsa di dottorato. Gli autori riconoscono i finanziamenti del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie numero 722687. Gli autori sono anche grati al Dott. Esko Oksanen (ESS, Lund) e al Dott. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) per conversazioni e approfondimenti utili. IBS riconosce l'integrazione nell'Istituto di Ricerca Interdisciplinare di Grenoble (IRIG, CEA).

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	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diverse variabili fisiche, chimiche e biologiche influenzano la cristallizzazione proteica influenzando la solubilità proteica21. Tra queste variabili, la temperatura e la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione sono utilizzate qui in combinazione con la tecnica della dialisi per migliorare e far crescere grandi cristalli di alta qualità di biomacromolecole per studi di diffrazione neutronica. Utilizzando la conoscenza dei diagrammi di fase, la cristallizzazione è resa più prevedibile. Sebbene sia possibile anche lo screening di diverse condizioni di cristallizzazione in un approccio seriale, l'obiettivo principale dell'uso degli approcci razionali presentati è quello di separare e controllare la cinetica della nucleazione cristallina e della crescita.
Simili a tutti gli studi di cristallizzazione, campioni di proteine pure e omogenee di alta qualità e soluzioni di cristallizzazione senza polvere aumentano il tasso di successo dell'esperimento. La filtrazione e la centrifugazione delle soluzioni sono passaggi essenziali nei protocolli descritti. Conoscere le proprietà fisicochimiche delle proteine studiate come il peso molecolare (per scegliere la membrana di dialisi appropriata), il punto isoelettrico e la solubilità proteica sono cruciali per la progettazione di un esperimento ottimale di crescita cristallina. Inoltre, è necessario prendere in considerazione la stabilità delle proteine a temperature diverse o con sostanze chimiche diverse per prevenire la perdita del campione e aumentare la probabilità di successo. Considerando l'intervallo di temperatura di OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), un'ampia gamma di proteine può essere cristallizzata usandolo. Ma vale la pena sottolineare che le proteine che sono principalmente termo-stabili, come le proteine provenienti da fonti termofile, trarrebbero il massimo beneficio dagli esperimenti di crescita cristallina a grande volume a temperatura controllata offerti da questo strumento.
Utilizzando una camera di dialisi a basso volume (quando si utilizzano OptiCrys) o pulsanti di microdialisi e vagliando diverse temperature e condizioni di cristallizzazione (ad esempio, griglie di concentrazione precipitante o pH), è possibile ottenere informazioni sulla posizione del limite della zona metastabile (equilibrio cinetico tra nucleazione e zone metastabili). Questo è inestimabile quando si progetta un esperimento di crescita cristallina di successo soprattutto per i nuovi candidati proteici nella cristallizzazione. Senza queste informazioni gli esperimenti possono partire da un'area del diagramma di fase ad alta sovrasaturazione, troppo lontano dal limite della zona metastabile per controllare facilmente la nucleazione cristallina. Sebbene si possa tentare di dissoluzione del precipitato proteico, ad esempio aumentando la temperatura in caso di solubilità diretta, per proteine con ridotta termostabilità, mantenere il campione ad alta temperatura per un periodo di tempo più lungo può rendere irreversibile la precipitazione proteica. Pertanto, la strategia migliore consiste nell'utilizzare una condizione iniziale con una minore supersaturazione situata vicino al limite di metastabilità, dove la nucleazione può essere controllata ed evitare precipitazioni proteiche. In linea con ciò, il prescreening di cristallizzazione riduce la possibilità di avere un precipitato proteico nella camera di dialisi e aumenta il tasso di successo dell'esperimento.
Dopo aver progettato un esperimento, la preparazione di camere di dialisi (OptiCrys) o pulsanti di microdialisi è un altro passo importante. Prevenire la formazione di bolle d'aria nella camera/pulsante di dialisi aumenta la possibilità di una cristallizzazione riuscita soprattutto quando vengono utilizzati piccoli volumi. La presenza di bolle d'aria nella camera di dialisi può anche cambiare la cinetica del processo di cristallizzazione e ridurre la riproducibilità dell'esperimento (perché la superficie di contatto proteina/soluzione è stata modificata). Non solo la proteina ma anche la soluzione di cristallizzazione possono influenzare il successo dell'esperimento. L'utilizzo di nuovi tubi da 50 mL per il sistema di pompaggio ogni volta che si vuole iniziare un nuovo esperimento e lavare i tubi dopo ogni esperimento riduce la possibilità di contaminazione ed evita la creazione di cristalli di sale nell'apparato.
L'uso di pulsanti di microdialisi è un'alternativa quando OptiCrys non è disponibile. Le strategie per ottimizzare la cristallizzazione e monitorare la crescita cristallina sopra menzionate, devono essere eseguite manualmente. In genere ciò richiede di essere al di fuori di un incubatore termoregolato, che può essere problematico quando la regolazione della temperatura è un passaggio critico nella metodologia descritta. Ciò non facilita la modifica della composizione chimica delle soluzioni di cristallizzazione o il monitoraggio della crescita dei cristalli mediante imaging, quindi il processo di crescita dei cristalli non può essere controllato in tempo reale.
La conoscenza del diagramma di fase è alla base dell'utilizzo del banco di cristallizzazione, OptiCrys, per far crescere sistematicamente cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità in modo automatizzato. Il controllo di parametri fisicochimici come temperatura, concentrazione precipitante e pH durante la cristallizzazione sposta l'equilibrio proteina-soluzione in una traiettoria cinetica ben definita attraverso il diagramma di fase. Ciò è completato dall'uso di una membrana di dialisi per regolare il trasporto di massa e creare un gradiente controllato nella camera di cristallizzazione che influisce sulle dimensioni e sulla qualità dei cristalli. Pertanto, l'utilizzo sia di dati termodinamici che di traiettorie cinetiche è essenziale per controllare il processo di cristallizzazione al fine di far crescere cristalli di alta qualità. Grazie a OptiCrys, i diagrammi di fase sistematici in uno spazio multidimensionale possono essere studiati con un approccio seriale utilizzando molto meno materiale di prima. Per dimostrare questa metodologia, forniamo qui un caso di studio con una proteina modello, lisozima bianco uovo di gallina. Utilizzando e padroneggiando il protocollo qui presentato si può adattare per veri sistemiproteici 5,14,17,18.

Comprendere la relazione struttura-funzione delle proteine e il meccanismo delle vie fisiologiche spesso si basa sulla conoscenza delle posizioni degli atomi di idrogeno (H) e di come la carica viene trasferita all'interno di unaproteina 1,2. Poiché gli atomi di idrogeno disperdono debolmente i raggi X, le loro posizioni possono essere determinate solo con dati di diffrazione a raggi X ad altissima risoluzione (>1 Å)3,4. Al contrario, la cristallografia neutronica può essere utilizzata per ottenere una posizione accurata degli atomi di idrogeno nelle macromolecole biologiche come atomi di idrogeno e deuterio (H2, isotopo dell'idrogeno) hanno lunghezze di dispersione di magnitudine approssimativamente uguale a ossigeno, azoto e carbonio5. Tuttavia, il flusso neutronico proveniente dalle sorgenti di neutroni disponibili è più debole di quello dei fasci di raggi X, per cui questo deve spesso esserecompensato per 2,3. Ciò può essere ottenuto scambiando H con H2 e/o aumentando il volume dei cristalli per ridurre la dispersione incoerente degli idrogeno e aumentare il rapporto segnale-rumore delle immagini di diffrazione.
Esistono vari approcci di cristallizzazione (il corrispondente diagramma di fase schematico è mostrato nella figura 1) per ottenere cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità sia per la cristallografia bio-macromolecolare a raggi X che per quella neutronica6. Nella diffusione del vapore, una goccia preparata da una miscela di una proteina e una soluzione di cristallizzazione viene equilibrata nel tempo, per evaporazione dell'acqua o di altre specie volatili, contro un serbatoio contenente una maggiore concentrazione di precipitante della stessa soluzione di cristallizzazione. L'aumento della concentrazione di proteine e precipitanti nella goccia porta alla supersaturazione necessaria per la nucleazione spontanea seguita dalla crescita cristallina a questi nuclei6,7. Sebbene la diffusione del vapore sia la tecnica più frequentemente utilizzata per la coltivazionedei cristalli 4, il processo di cristallizzazione non può essere controllato conprecisione 8. Nel metodo di diffusione dell'interfaccia libera, la soluzione di cristallizzazione si diffonde in una soluzione proteica concentrata, indirizzando molto lentamente il sistema verso la supersaturazione. Questo metodo può essere considerato un metodo batch con una velocità di miscelazionelenta 6,9,10,11,12. Nel metodo batch, la proteina viene rapidamente miscelata con una soluzione di cristallizzazione che porta a una rapida supersaturazione e a sua volta nucleazioneuniforme con molti cristalli 3,7. Questo metodo rappresenta circa un terzo di tutte le strutture attualmente depositate nella Protein Data Bank. Il metodo della dialisi viene utilizzato anche per la coltivazione di cristalli proteici di alta qualità e ben diffratti. Nel metodo della dialisi, le molecole di precipitante si diffondono da un serbatoio attraverso una membrana semi-permeabile in una camera separata con la soluzione proteica. La cinetica dell'equilibrazione dipende da vari fattori, come la temperatura, la dimensione dei pori di membrana e il volume e la concentrazione di campioni proteici e agenti dicristallizzazione 6.
I diagrammi di fase di cristallizzazione possono essere usati per descrivere diversi stati di una proteina in funzione della diversa variabile fisica o chimica3. Come illustrato nella figura 1, ogni tecnica di cristallizzazione può essere vista come utilizzando una traiettoria cinetica diversa per raggiungere le zone nucleazione e metastabili di tale diagramma6,10,13. Ciò fornisce informazioni sulla solubilità proteica e sulla concentrazione proteica alla quale si osserva un equilibrio termodinamico tra cristallo e soluzione, trovando così le condizioni ottimali per la nucleazionee la crescita 3,14. In un diagramma di fase bidimensionale, la concentrazione proteica viene tracciata in funzione di una variabile e le altre variabili sono mantenute costanti15. In tale diagramma di fase, quando la concentrazione proteica è inferiore alla curva di solubilità, la soluzione si trova nella regione sottosatura e non si verifica nucleazione o crescita cristallina. Al di sopra di questa curva si trova la zona di supersaturazione in cui la concentrazione proteica è superiore al limite disolubilità 3,14. Questo è ulteriormente diviso in tre regioni: la zona metastabile, la zona di nucleazione spontanea e la zona di precipitazione. Nella zona metastabile, la supersaturazione non è sufficiente perché la nucleazione avvenga entro un tempo ragionevole, ma può avvenire la crescita dei cristalli seminati. Aggregazione e precipitazioni sono favorite nella zona di precipitazione, dove la supersaturazione ètroppo alta 14,15.
Quando si ottiene una supersaturazione sufficiente per la nucleazione spontanea, i primi nuclei appariranno10. La crescita dei cristalli porta ad una riduzione della concentrazione proteica fino al raggiungere il limite di solubilità. Finché la supersaturazione rimane in prossimità della curva di solubilità, non ci saranno cambiamenti significativi nelle dimensioni dei cristalli. Tuttavia, è stato dimostrato che le variazioni nella temperatura e nella composizione chimica della soluzione di cristallizzazione (ad esempio, la concentrazione del precipitante) influenzeranno la solubilità proteica e possono portare all'inizio di un'ulteriore crescitacristallina 8,13,16.
Poiché la dialisi è vantaggiosa per una buona crescita cristallina, il banco di cristallizzazione OptiCrys illustrato nella Figura 2,è stato progettato e sviluppato nel nostro laboratorio per controllare la cristallizzazione in modo completamenteautomatizzato 8. A tal fine, è stato scritto un software con LabVIEW che consente il controllo e il monitoraggio della temperatura di una configurazione di dialisi del serbatoio che scorre a contatto con elementi Peltier, tramite un controller elettronico e un refrigeratore. Lo stesso software regola automaticamente anche la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione (ad esempio lo scambio di agenti di cristallizzazione) utilizzando un sistema fluido multicanale. Inoltre, una fotocamera digitale e un microscopio invertito vengono utilizzati per visualizzare e registrare il processo di cristallizzazione. Due camere di cristallizzazione con volumi di 15 μL e 250 μL sono disponibili per la coltivazione di cristalli per scopi diversi. Poiché il processo di cristallizzazione è reversibile, lo screening per diverse condizioni è possibile con pochi microlitri della soluzione proteica purché il campione non siadanneggiato 8. Di conseguenza, l'utilizzo di questo metodo riduce al minimo la quantità di materiale proteico utilizzato.
Dal lavoro precedente8, è evidente che durante il processo di crescita del cristallo, le osservazioni in situ devono essere effettuate a intervalli di tempo regolari. Questi possono variare da pochi secondi a diversi giorni, a seconda dell'evento sotto osservazione (precipitazioni, nucleazione o crescita cristallina).
L'ottimizzazione della crescita cristallina con OptiCrys si basa su diagrammi di fase di concentrazione precipitanti di temperatura. Nel caso di proteine con solubilità in funzione diretta della temperatura, è possibile utilizzare il regime di salatura18. È qui che l'aumento della forza ionica della soluzione, che può essere visualizzato usando diagrammi di fase proteina-precipitante, diminuisce la solubilità della proteina. Allo stesso modo, le proteine con solubilità inversa possono fare uso del regime di salatura18. La nucleazione avviene nella zona di nucleazione, in prossimità della zona metastabile, e la crescita del cristallo avviene quindi nella zona metastabile del diagramma di fase fino a quando la concentrazione proteica raggiunge il limite di solubilità. Come mostrato nella figura 3A, con una temperatura di composizione chimica costante può essere ridotta per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile per prevenire nuove nucleazioni. I cristalli crescono fino a raggiungere il secondo equilibrio cristallo/soluzione e, successivamente, non si osserva un ulteriore aumento delle dimensioni dei cristalli. La temperatura viene ridotta più volte fino a quando i cristalli raggiungono la dimensione desiderata. Nella figura 3B, a temperatura costante, l'aumento della concentrazione del precipitante mantiene la soluzione nella zona metastabile. Questo processo può quindi essere ripetuto più volte per ottenere cristalli di grandi dimensioni. Cambiare la temperatura e manipolare le condizioni della soluzione di cristallizzazione, controllando i livelli di supersaturazione, sono due potenti strumenti per separare la nucleazione e la crescita di cristalli controllati con precisione e automaticamente da OptiCrys5,8,14.
Esempi di cristalli proteici coltivati mediante cristallizzazione controllata dalla concentrazione controllata dalla temperatura, o dalla temperatura e precipitante, così come i relativi dati di diffrazione ottenuti sono disponibili in letteratura e PDB. Tra questi ci sono γ-cristallina E umana, lectina PA-IIL, pirofosfatasi inorganica del lievito, urarato ossidasi, anidrasi carbonica umana II, YchB chinasi e lattato deidrogenasi5,14,17,18.
Sebbene OptiCrys sia stato commercializzato da NatX-ray, ci sono molti laboratori che non hanno accesso a questo strumento o all'approccio seriale che offre. L'alternativa a questa tecnica è utilizzare bottoni di microdialisi plastica disponibili in commercio con vari volumi. Utilizzando questi, la temperatura e la composizione chimica possono essere regolate e varie manualmente. L'ispezione dei pulsanti di microdialisi non può essere effettuata in situ e deve invece essere eseguita manualmente con un microscopio ottico. Il controllo della temperatura può essere ottenuto mantenendo il campione in un incubatore a temperatura controllata senza vibrazioni. È essenziale mantenere costante la temperatura per garantire che gli esperimenti di cristallizzazione siano riproducibili. Variazioni significative di temperatura possono anche portare a danni o distruzione di cristalli5.
Qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del campione e l'uso di software di controllo per la crescita di cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità adatti alla cristallografia delle proteine neutroni. Questa procedura passo-passo è stata progettata per sfruttare il diagramma della fase di cristallizzazione al fine di selezionare una posizione iniziale e un percorso cinetico per controllare le dimensioni e la qualità dei cristalli generati. Inoltre, viene presentato un protocollo dettagliato per la coltivazione di cristalli con pulsanti di microdialisi che utilizza la stessa logica per ottenere cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

L'uso della cristallografia macromolecolare neutronica (NMX) si sta espandendo rapidamente con la maggior parte delle strutture determinate nell'ultimo decennio grazie alla costruzione di nuove linee di fascio NMX e ad una maggiore disponibilità di software di perfezionamento della struttura. Tuttavia, le sorgenti di neutroni attualmente disponibili per nmx sono significativamente più deboli delle sorgenti equivalenti per la cristallografia a raggi X. Nonostante i progressi in questo campo, per gli studi di diffrazione neutronica saranno sempre necessari cristalli significativamente più grandi, in particolare con la tendenza a studiare macromolecole e complessi sempre più grandi. Ulteriori miglioramenti nei metodi e nella strumentazione adatti a far crescere cristalli più grandi sono quindi necessari per l'espansione dell'uso di NMX.
In questo lavoro, introduciamo strategie razionali e un banco di crescita dei cristalli (OptiCrys) sviluppato nel nostro laboratorio che combina l'osservazione in tempo reale attraverso una videocamera montata al microscopio con un preciso controllo automatizzato delle soluzioni di cristallizzazione (ad esempio, concentrazione precipitante, pH, additivo, temperatura). Dimostriamo quindi come questo controllo della temperatura e della composizione chimica faciliti la ricerca di condizioni ottimali di cristallizzazione utilizzando proteine solubili modello. Una conoscenza approfondita del diagramma della fase di cristallizzazione è fondamentale per selezionare la posizione iniziale e il percorso cinetico per qualsiasi esperimento di cristallizzazione. Mostriamo come un approccio razionale possa controllare le dimensioni e il numero di cristalli generati in base alla conoscenza dei diagrammi di fase multidimensionali.

Nelle sezioni 2.3 e 2.4 vengono presentati tre esempi di crescita ottimizzata dei cristalli, che mostrano l'uso dello strumento e un progetto sperimentale per la coltivazione di cristalli di grandi dimensioni. Per questa dimostrazione, abbiamo usato il lisozima come proteina modello, anche se gli esperimenti di crescita del cristallo sono stati eseguiti con successo con molti altri sistemi proteici utilizzando questo metodo (vedi sopra). Utilizzando e padroneggiando il protocollo qui presentato si può adattarlo ad altri candidati proteici.
Nella sezione 2.3 abbiamo dimostrato che le strategie di cristallizzazione razionale stabilite potrebbero essere utili nella coltivazione di cristalli con volumi di dispersione sufficienti per la cristallografia delle proteine neutroni. Qui dimostriamo che le strategie di ottimizzazione razionale proposte consentono anche la generazione di una popolazione uniforme di cristalli di qualsiasi dimensione specifica necessaria per approcci di determinazione della struttura a valle.
Questi due esperimenti sono progettati per sottolineare l'importanza dei diagrammi di fase nel controllo della nucleazione e della crescita dei cristalli. Qui, il controllo della temperatura e della composizione chimica delle soluzioni di cristallizzazione in combinazione con il monitoraggio del processo di cristallizzazione in tempo reale vengono utilizzati per studiare il diagramma di fase qualitativo. Utilizzando questo metodo, la nucleazione e la crescita del cristallo possono essere ottimizzate razionalmente in modo reversibile. L'uso di un tale approccio seriale riduce anche la quantità di proteine e il tempo necessario per controllare le dimensioni e la qualità dei cristalli.
Nel metodo della dialisi, unasoluzione proteica è separata da una soluzione di cristallizzazione da una membrana semi-permeabile 6 (Figura 5). Questa membrana di dialisi consente a piccole molecole come additivi, buffer e ioni di passare attraverso la membrana ma non macromolecole come proteine6,20. Questa funzione consente di modificare la soluzione di cristallizzazione nel corso dell'esperimento6. Lo scambio della soluzione può essere effettuato manualmente, ad esempio in pulsanti di microdialisi, o in modo automatizzato utilizzando uno strumento sviluppato a questo scopo, OptiCrys8.
Nella prima serie di esperimenti, i pulsanti di microdialisi sono stati utilizzati per la cristallizzazione del lysozima bianco uovo di gallina. I pulsanti di microdialisi sono stati immersi in soluzioni di cristallizzazione con diverse concentrazioni di sale. In questo semplice esperimento di griglia di cristallizzazione, l'unica variabile è la concentrazione precipitante mentre la temperatura è mantenuta costante (293 K). Come mostrato nella figura 4, lievi variazioni nella concentrazione di sale inducono una variazione delle dimensioni e del numero di cristalli osservati, consentendo di investigare il diagramma della fase di cristallizzazione. Nella figura 4, pannello 1, la soluzione di cristallizzazione contiene 0,7 M NaCl e un numero limitato di cristalli più grandi sono apparsi nei pulsanti. Aumentando la concentrazione di sale da 0,7 a 1,2 M, la supersaturazione aumenta e la soluzione nella zona di nucleazione si allontana dalla zona metastabile(Figura 4,pannelli da 1 a 6). Di conseguenza, il numero di cristalli aumenta e le loro dimensioni diminuiscono.
Nel primo esperimento con uno strumento completamente automatizzato che consente la cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata, OptiCrys (Figura 9), l'esperimento di crescita del cristallo è stato progettato per generare una grande crescita cristallina. L'esperimento è stato avviato ad una temperatura iniziale di 295 K con una soluzione di cristallizzazione contenente 0,75 M NaCl e 0,1 M Na acetato tampone pH 4. In queste condizioni sperimentali, la soluzione di cristallizzazione ha raggiunto la zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile del diagramma di fase(figura 9, freccia 1). Di conseguenza, solo pochi nuclei sono stati generati durante la prima fase dell'esperimento. Per far crescere ulteriormente cristalli selezionati (mostrato nella figura 9),il flusso di lavoro di ottimizzazione della crescita del cristallo è stato spinto verso la zona metastabile variando la temperatura non appena è stato raggiunto l'equilibrio cristallo-soluzione.
Ogni volta che è stato raggiunto l'equilibrio tra cristallo e soluzione, la temperatura è stata abbassata, prima a 291 K, poi a 288 K e infine a 275 K, per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile. Il risultato di questo esperimento è un singolo grande cristallo adatto sia per la radiografia macromolecolare che per la cristallografia neutronica.
Per la maggior parte delle proteine, il preciso diagramma di fase quantitativa (o solo un diagramma qualitativo) non è stato ancora ottenuto a causa della mancanza di dispositivi sperimentali in grado di misurare con precisione la concentrazione proteica (o semplicemente di osservare / rilevare il processo di cristallizzazione in tempo reale) durante gli esperimenti di cristallizzazione18. Di conseguenza, spesso non è possibile progettare l'esperimento in modo tale che la cristallizzazione inizi nell'area ottimale del diagramma di fase, in prossimità della zona metastabile.
Pertanto, uno studio di ottimizzazione della cristallizzazione deve avvenire prima che l'esperimento dedicato alla crescita di un cristallo di grande volume sia intrapreso. In questo studio, utilizzando variazioni di temperatura (a composizione chimica costante) da un lato e variazioni nella composizione chimica (a temperatura costante) dall'altro, sono necessari per identificare la zona metastabile e delineare le condizioni ottimali per l'avvio di un grande esperimento di crescita cristallina.
A tal fine, vengono presentati altri due esperimenti su misura per dimostrare la reversibilità degli esperimenti di cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata con OptiCrys per nucleazione, crescita cristallina, dissoluzione e ri-crescita. Il flusso di lavoro di ottimizzazione della crescita dei cristalli è stato controllato in modo da umentare una popolazione uniforme di meno cristalli di lisozima più grandi, utilizzando variazioni di temperatura o concentrazione precipitante.
Nel secondo esperimento con OptiCrys, la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione è stata mantenuta costante durante l'esperimento (0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4) a temperatura variabile. La temperatura iniziale è stata fissata a 291 K. I risultati di questo esperimento sono riassunti nella figura 10. A causa dell'elevata sovrasaturazione, un gran numero di piccoli cristalli apparve nella camera di cristallizzazione(Figura 10,pannelli 1 e 2). Secondo il concetto di solubilità diretta delle proteine, aumentando gradualmente la temperatura a 313 K, tutti i cristalli sono stati sciolti(figura 10,pannelli 3, 4 e 5). Infine, abbassando la temperatura a 295 K, la seconda nucleazione è stata avviata in prossimità della zona metastabile e ha permesso la formazione controllata di un numero inferiore di nuclei. Un'ulteriore crescita dei cristalli ha portato alla generazione uniforme di una popolazione di cristalli più grandi(figura 10, pannello 7).
Come mostrato nella figura 11, la variazione della composizione chimica della soluzione di cristallizzazione, ad una temperatura costante di 291 K, può anche essere utilizzata per ottenere una popolazione uniforme di cristalli più grandi. Simile all'esperimento precedente, la condizione iniziale era di 0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4. La concentrazione di NaCl è stata quindi gradualmente abbassata da 0,9 M a zero per sciogliere i cristalli(Figura 11,pannelli 4 e 5). A questo punto, NaCl è stato completamente sostituito da una soluzione tampone di 0,1 M CH3COONa pH 4. La riduzione della concentrazione di sale mantiene la soluzione nella zona sottosatura del diagramma di fase, che porta alla dissoluzione dei cristalli. Quindi, una nuova soluzione di cristallizzazione con minore resistenza ionica, a 0,75 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4, è stata iniettata nella camera del serbatoio. A questa concentrazione precipitante sono apparsi i primi nuclei(figura 11, pannello 6) dopo 90 minuti. Il numero di cristalli generati era inferiore e i cristalli raggiungono un volume maggiore(Figura 11, pannello 7) rispetto a prima.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figura 1: Diagramma di fase schematico. Le traiettorie cinetiche per tre tecniche di cristallizzazione sono rappresentate in un regime di salatura. Ogni metodo raggiunge la nucleazione e la cristallizzazione in modo diverso, visualizzato da una diversa via cinetica attraverso il diagramma di fase per raggiungere le zone nucleazione e metastabili. La curva di solubilità separa le regioni di sottosaturazione e supersaturazione. La supersaturazione è divisa in tre zone: metastabile, nucleazione e precipitazione. Nella zona di nucleazione, la nucleazione spontanea si verifica mentre nella zona metastabile avviene la crescita del cristallo. Questa figura è adattata da Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica del banco di cristallizzazione (OptiCrys). La sorgente luminosa a LED si trova sopra la cella di flusso della dialisi a temperatura controllata. Un microscopio invertito e la fotocamera digitale sono mostrati in alto a destra dell'immagine con la freccia rossa. Il cerchio rosso rappresenta la posizione del tubo del refrigeratore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figura 3: Schema schematico della fase di cristallizzazione delle proteine bidimensionali in funzione della temperatura (A) e della concentrazione precipitante (B). (A) Nel caso di una proteina con solubilità diretta, la diminuzione della temperatura mantiene la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile. La variazione di temperatura può essere ripetuta più volte per controllare il processo di crescita del cristallo fino a ottenere cristalli con il volume desiderato. (B) La modifica della concentrazione della soluzione precipitante può essere utilizzata anche per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile per la coltivazione dei cristalli. Questa figura è adattata da Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figura 4: Cristalli di lisozima ottenuti con il metodo della dialisi. Questo esperimento è stato eseguito ad una temperatura costante di 293 K in tampone di acetato di sodio 0,1 M pH 4. L'aumento della concentrazione di NaCl da 0,7 M a 1,2 M aumenta il tasso di nucleazione e si traduce in un maggior numero di cristalli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figura 5: Panoramica del processo di cristallizzazione delle proteine con il metodo della dialisi. (A) Aggiungendo la proteina alla camera del pulsante di dialisi, (B) sulla parte superiore della camera viene creata una forma a cupola. (C) Un applicatore viene utilizzato per trasferire l'O-ring alla scanalatura del pulsante di dialisi al fine di fissare la membrana di dialisi in posizione. (D) Il pulsante di dialisi è pronto per l'immersione nella soluzione del serbatoio. (E) La soluzione di cristallizzazione passa attraverso la membrana semipermeabile e i cristalli iniziano a formarsi all'interno della camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figura 6: Visione schematica dell'impostazione della dialisi fluida a temperatura controllata. (A) Il campione proteico viene aggiunto alla camera di dialisi. (B) La membrana di dialisi è fissata sulla sovracamera con un O-ring utilizzando un applicatore. (C) La sovracamera viene girata e fissata sulla parte superiore della camera di dialisi. Le frecce bianche indicano dove sono posizionate le viti sulla sovracamera. (D) La camera del serbatoio è girata in senso orario (E) e fissata sopra la sovracamera. (F) La camera del serbatoio è coperta da un tappo ermetico con connettori a un sistema di pompaggio e (G) la cella di flusso è posizionata nel supporto in ottone. Questa figura è adattata da Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figura 7: Preparazione e iniezione della soluzione di cristallizzazione nel serbatoio da parte del sistema fluido (A). I tubi contenenti sale e acqua sono collegati al regolatore pressione/vuoto (B) e alla valvola rotante (C). Utilizzando la pressione, il regolatore pressione/vuoto crea un flusso costante dei liquidi dai tubi alla valvola rotante. Ogni liquido che passa attraverso il misuratore di portata (D) e l'interruttore viene iniettato nel tubo di miscelazione (F). Una volta che tutti i liquidi sono stati aggiunti al tubo di miscelazione, l'interruttore con alcune modifiche inietta la soluzione finale dal tubo di miscelazione nel serbatoio (G). Il liquido scorre attraverso il sistema nella direzione delle frecce nel diagramma contrassegnato in ordine crescente (da 1 a 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figura 8: Visualizzazione della manutenzione del software di supervisione. Questa vista viene utilizzata per controllare diversi parametri come temperatura, luce, soluzione di cristallizzazione e zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figura 9: Diagramma di fase in funzione della temperatura (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). Un singolo grande cristallo di lysozima si ottiene cambiando sistematicamente la temperatura da 295 K a 275 K. Ad ogni passo, la crescita del cristallo viene interrotta al raggiungimento della curva di solubilità. La riduzione della temperatura mantenendo la soluzione nella zona metastabile riavvia la crescita del cristallo. Le immagini hanno diversi livelli di ingrandimento. Questa figura è adattata da Junius et al. 8,18 Cliccaqui per vedere una versione più grande di questa<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figura 10: Ottimizzazione della crescita dei cristalli a composizione chimica costante mediante controllo della temperatura (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). L'avvio del processo di nucleazione nella zona di nucleazione a 291 K, lontano dalla zona metastabile, si traduce nella formazione di numerosi cristalli. Aumentando la temperatura a 313 K quindi dissolve i cristalli fino a quando non si vedono nuclei visibili nella camera di dialisi. Infine, diminuendo la temperatura a 295 K si riavvia il processo di nucleazione per la seconda volta portando a un numero limitato di cristalli più grandi. Questa figura è adattata da Junius et al. 8,18 Cliccaqui per vedere una versione più grande di questa<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figura 11: Ottimizzazione della crescita dei cristalli a temperatura costante utilizzando variazioni della concentrazione precipitante (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). Diminuendo la concentrazione del precipitante da 0,9 M a 0 M si sciolgono i cristalli ottenuti durante il primo evento di nucleazione. Il processo di cristallizzazione viene riavviato dall'iniezione dello stesso precipitante ma a minore resistenza ionica, 0,75 M, che porta alla formazione di alcuni cristalli più grandi. Questa figura è adattata da Junius et al. 8,18 Cliccaqui per vedere una versione più grande di questa<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">figura.</a>

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Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Gli studi strutturali sulle biomacromolecole mediante cristallografia richiedono cristalli di alta qualità. Qui dimostriamo un protocollo che può essere utilizzato da OptiCrys (uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio) e/o pulsanti di microdialisi per la coltivazione di cristalli di grande qualità basati sulla conoscenza del diagramma di fase di cristallizzazione.

Ottimizzazione della crescita del cristallo per la cristallografia macromolecolare neutronica

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Esistono diversi approcci di cristallizzazione per ottenere cristalli di grande e alta qualità sia per la cristallografia a raggi X che per la cristallografia neutronica. Uno di questi approcci è l'uso del metodo della dialisi. In questa tecnica, la soluzione proteica è separata da una soluzione precipitante da una membrana semi-permeabile.Le molecole precipitanti si diffondono attraverso la membrana nella camera proteica. Quando si ottiene la corretta supersaturazione per una nucleazione spontanea, appariranno i primi nuclei. Qui dimostreremo un protocollo che può essere utilizzato da OptiCrys uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio che utilizza la cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata e i nostri pulsanti di micro dialisi per la coltivazione di cristalli di grande qualità per la cristallografia macromolecolare naturale basata sulla conoscenza del diagramma di fase di cristallizzazione.Per un pulsante di micro dialisi con alcuni microlitri volume pipetta 35 microlitri di soluzione di glisozima nella camera di dialisi. Questo volume extra crea una forma leggermente a cupola sopra la camera di dialisi e impedisce la formazione di bolle d'aria. Prendere un applicatore e posizionare l'elastico o l'anello all'estremità di esso.Posizionare la membrana sopra la camera e fissarla trasferendo l'elastico o l'anello dall'applicatore alla scanalatura del pulsante di dialisi. Trasferire il pulsante nel pozzo contenente la soluzione di cristallizzazione. Coprire il pozzo con un foglietto di copertura in vetro o un pezzo di nastro adesivo.Mantenere il campione a 293 Kelvin in un incubatore di regolatori termici privo di vibrazioni. Sapendo che la cristallizzazione della dialisi offre vantaggi dal punto di vista della crescita cristallina, il banco di cristallizzazione cosiddetto OptiCrys è stato progettato e sviluppato nel nostro laboratorio per offrire un controllo combinato completamente automatizzato della temperatura e della composizione chimica dell'esperimento di cristallizzazione biomolecolare. L'ottimizzazione della crescita del cristallo da parte di OptiCrys si basa sui diagrammi della fase di concentrazione precipitante della temperatura.La nucleazione avviene nella zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile e la crescita del cristallo avviene quindi nella zona metastabile dopo diagramma di fase, fino a quando la concentrazione proteica raggiunge la curva di solubilità che rappresenta l'equilibrio termodinamico tra soluzione e cristalli. Diminuendo la temperatura in caso di proteina con solubilità diretta o aumentando la concentrazione precipitante in caso di salatura, la soluzione di cristallizzazione rimane nella zona metastabile e non si verifica nucleazione. I cristalli crescono fino al raggiungimento del secondo equilibrio della soluzione cristallina e, successivamente, non si osserva un ulteriore aumento delle dimensioni dei cristalli.Diminuendo la temperatura o aumentando la concentrazione del precipitante si ripete più volte fino a quando i cristalli raggiungono la dimensione desiderata. Aggiungere la soluzione proteica alla camera di dialisi dell'insieme a flusso a temperatura controllata, coprire la sovracamera con la membrana di dialisi e fissare la membrana con l'elastico o l'anello. Capovolgere la camera sopra e metterla sopra la camera di dialisi.Premerlo delicatamente e lentamente per rimuovere tutta l'aria intrappolata tra due pezzi, fissare il serbatoio nella sua posizione avvitarlo delicatamente sopra la camera sopra. Aggiungere la soluzione di cristallizzazione alla camera del serbatoio e coprirla con il tappo ermetico. Trasferire questo assemblaggio e inserito nel supporto mammario del banco di cristallizzazione OptiCrys Crystal growth è un software di supervisione del Crystallization Bench OptiCrys.Include quattro diverse interfacce grafiche o viste. La visualizzazione Home contiene pulsanti per passare alle altre visualizzazioni. Lo scopo dell'interfaccia di installazione è definire uno scenario di esperimento che può essere eseguito automaticamente nella visualizzazione test.L'ultima vista è la vista di manutenzione. Per riavviare un esperimento, la vista di manutenzione deve essere aperta dove si trovano tutti i parametri essenziali per il buon funzionamento degli esperimenti di cristallizzazione. Aumentare la luminosità dalla sezione luminosa, la luce può aumentare da zero, nessuna luce a 100 luminosità massima.Per controllare e monitorare la temperatura, viene utilizzata la sezione del regolatore di temperatura. Clicca sul pulsante per accenderlo. Impostare la temperatura nella sezione del set point e premere INVIO.Sotto questo pulsante, ci sono due grafici. Quello rosso mostra il finale, la temperatura dell'ordine e il grafico giallo mostra la temperatura corrente. Mescolando una soluzione stock, un'iniezione della soluzione di cristallizzazione alla camera del serbatoio è controllata dalla sezione Palm.Aggiungere la concentrazione della soluzione stock nella prima fase. Quindi trovare la concentrazione finale di ogni nuova soluzione di gruppo e aggiungerle alla sezione di concentrazione finale. Dopo aver premuto il pulsante calcola, scopri che verrà calcolato il volume della soluzione stock e aggiungerà il pannello del volume davanti a ciascun pannello di concentrazione.Premere il pulsante di preparazione del lancio e attendere che la nuova soluzione premier sia pronta. Per lo scambio della soluzione di cristallizzazione, fare clic sul pulsante Voce soluzione. Per interrompere il processo, premere il pulsante Interrompi distribuzione.Sul lato destro della sezione del microscopio, Ci sono diversi pannelli per la registrazione di informazioni importanti da ogni esperimento di crescita del cristallo. Aggiungere il nome delle proteine corrispondenti, il peso molecolare e la condizione di cristallizzazione in questa sezione. Definire un nome per gli esperimenti semplicemente digitandolo sul nome della cartella.Dalla sezione immagini nb, selezionare il numero di immagini che devono essere scattate durante l'esperimento. Aggiungi il numero delle immagini e dal pannello a destra scegli la scala del timer. Fare clic sul pulsante della cartella per aprire la cartella.In questa cartella è presente un file di testo contenente tutte le informazioni definite in precedenza per l'esperimento. Anche le immagini pronte per qualsiasi ulteriore trattamento vengono salvate in questa cartella. Anche lo zoom al microscopio può essere variato automaticamente.Modifica lo zoom usando il pulsante più e meno sopra la sezione del microscopio per aumentare o diminuire rispettivamente l'ingrandimento. Esistono tre modi diversi per misurare la dimensione del cristallo. Per misurare la lunghezza o la larghezza utilizzare il vettore di larghezza.A seconda della forma cristallina, è possibile scegliere gli strumenti specifici della parte sinistra della sezione del microscopio. Ad esempio un poligono rettangolare o poligono. I valori verranno visualizzati nella sezione della misura.Nella prima serie di esperimenti, i pulsanti di microdialisi sono stati immersi nelle soluzioni di cristallizzazione con diverse concentrazioni di sale. In questo semplice esperimento della griglia di cristallizzazione, l'unica variabile è la concentrazione precipitante. mentre la temperatura è mantenuta costante.Lievi variazioni nella concentrazione di sale permettono di studiare il diagramma della fase di cristallizzazione aumentando la concentrazione di sale da 0,7 a 1,2 aumenti di supersaturazione molare e la soluzione nella zona di nucleazione si sta allontanando dalla zona metastabile. Di conseguenza, si osserva una variazione di dimensioni e numero di cristalli con il numero di cristalli che aumenta e le loro dimensioni diminuiscono. Nel primo esperimento con OptiCrys nella condizione sperimentale data, una volta raggiunto l'equilibrio nella camera di dialisi, la soluzione di cristallizzazione si trova nella zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile del diagramma di fase di cristallizzazione.Di conseguenza, solo pochi nuclei vengono generati durante la prima fase dell'esperimento. Al fine di mantenere la crescita dei cristalli nella zona metastabile e controllare il processo di crescita del cristallo, la temperatura è stata cambiata a diversi intervalli di tempo. Ogni volta che l'equilibrio della soluzione cristallina è stato completato, la temperatura è stata variata.Pertanto la temperatura è scesa a 291 Kelvin, 288 Kelvin e infine 275 Kelvin per mantenere la crescita del cristallo selezionato nella zona metastabile. Il risultato di questo esperimento è un singolo cristallo grande, con il volume richiesto per la cristallografia macromolecolare naturale. I due esperimenti successivi dimostrano la reversibilità degli esperimenti di dialisi a temperatura controllata per la nucleazione, la crescita cristallina, la dissoluzione e la ricrescita.Nel secondo esperimento con OptiCrys la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione è stata mantenuta costante attraverso l'esperimento e la temperatura variava. La temperatura iniziale fu fissata a 291 Kelvin. A causa dell'elevata supersaturazione, un gran numero di piccoli cristalli apparve nella camera di cristallizzazione.In accordo con il concetto di solubilità diretta delle proteine, aumentando gradualmente la temperatura a 313 Kelvin tutti i cristalli dovevano essere sciolti. Infine, abbassando la temperatura a 295 Kelvin, la seconda nucleazione iniziò in prossimità della zona metastabile e permise di controllare il processo di nucleazione con conseguente formazione di un numero inferiore di nuclei. Un'ulteriore crescita dei cristalli permise di generare la popolazione uniforme di cristalli più grandi.In questo esperimento, cambiare la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione a temperatura costante porta ad ottenere una popolazione uniforme di cristalli più grandi. La condizione di cristallizzazione era simile all'esperimento precedente. Lo scioglimento dei cristalli è stato ottenuto abbassando gradualmente la concentrazione di NaCl da 0,9 molare a zero.La riduzione della concentrazione di sale mantiene la soluzione nella zona sottosatura del diagramma di fase che porta alla dissoluzione dei cristalli. Quindi la nuova soluzione di cristallizzazione con una forza ionica inferiore rispetto al passato è stata iniettata nella camera del serbatoio. A questa concentrazione precipitante appare il minor numero di cristalli e i cristalli raggiungono un volume maggiore di prima.Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del campione e regola il software di controllo per la coltivazione di cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità per la cristallografia macromolecolare naturale utilizzando uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio. Questa procedura passo-passo è stata progettata e beneficia della conoscenza del diagramma della fase di cristallizzazione al fine di separare la nucleazione e la crescita dei cristalli. Inoltre, un protocollo per la coltivazione di cristalli con modelli di microcitosi viene presentato anche utilizzando i pulsanti di macrocitosi come alternativa quando OptiCrys non è disponibile.Oltre alle strategie che ho menzionato per OptiCrys cambiare la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione e della temperatura e scattare immagini dovrebbe essere fatto manualmente. È necessario utilizzare la vibrazione regolata termicamente per l'incubatore per mantenere costante la temperatura, che è un passaggio critico nella metodologia dimostrata.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

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L&#39;analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

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Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em&gt; E. coli</em&gt; Per la cristallografia a raggi X

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...