Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
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MBSは、契約2015の下でLABEX VALO GRALからのサポートを認めています。NJは、CEAの国際博士研究プログラム(イルテリス)の博士フェローシップを認めています。著者らは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金協定番号722687の下で、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムからの資金提供を認めている。著者はまた、Esko Oksanen博士(ESS、ルンド)とジャン=リュック・フェレール博士(IBS、グルノーブル)に有益な会話と洞察に感謝しています。IBSは、グルノーブル学際研究所(CEA)への統合を認めています。

<ol>
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著者らは開示するものは何もない。

異なる物理的、化学的および生物学的変数は、タンパク質の溶解度21に影響を与えることによってタンパク質の結晶化に影響を与える。これらの変数の中でも、結晶化溶液の温度と化学組成は、中性子回折研究のために生体高分子の大きな高品質結晶を改善し、成長させるために透析技術と組み合わせて使用されています。位相図の知識を用いることで、結晶化がより予測可能になります。連続的アプローチで異なる結晶化条件のスクリーニングも可能であるが、提示された合理的なアプローチを使用する主な目的は、結晶核化および成長の運動学を分離し、制御することである。
すべての結晶化研究と同様に、高品質の純粋で均質なタンパク質サンプル、およびダストフリーの結晶化溶液は、実験の成功率を高めます。溶液の濾過および遠心分離は、記載されたプロトコルにおいて不可欠なステップである。分子量(適切な透析膜を選択する)、等電点、タンパク質溶解度など、研究したタンパク質の物理化学的性質を知ることは、最適な結晶成長実験の設計に不可欠です。また、サンプルロスを防止し、成功の可能性を高めるために、異なる温度または異なる化学物質でのタンパク質安定性を考慮する必要があります。OptiCrys (233.0 ~353.0 ± 0.1 K) の温度範囲を考慮すると、幅広いタンパク質を使用して結晶化することができます。しかし、熱性源のタンパク質など、主に熱安定性の高いタンパク質は、この装置が提供する温度制御された大量結晶成長実験で最も利益を得ることを強調する価値があります。
少量透析チャンバー(OptiCrysを使用する場合)またはミクロ透析ボタンを使用して、いくつかの温度および結晶化条件(例えば、沈殿物濃度またはpHのグリッド)をスクリーニングすることによって、転移ゾーン(核形成と転移帯の間の運動平衡)の限界の位置に関する情報を得ることは可能である。これは、特に結晶化の新しいタンパク質候補に対して成功した結晶成長実験を設計する際に非常に貴重です。この情報がなければ、高い過飽和の位相図の領域から、結晶核形成を容易に制御するには、メタスタブルゾーンの限界から遠すぎるところから実験を開始できる。タンパク質沈殿の溶解は、例えば直接溶解性の場合には温度を上昇させることによって、より低い熱安定性を有するタンパク質に対して、より長い期間高温で試料を保ち、タンパク質沈殿を不可逆的に引き起こす可能性がある。したがって、最良の戦略は、核生成を制御し、タンパク質沈殿を回避することができる転移性の限界近くに位置する低い過飽和を持つ初期条件を使用することから成り立っている。これに伴い、結晶化前スクリーニングは透析チャンバーにタンパク質沈殿物を有する可能性を減少させ、実験の成功率を増加させる。
実験を設計した後、透析室(OptiCrys)またはマイクロ透析ボタンを準備することも重要なステップです。透析チャンバー/ボタン内の気泡の形成を防ぐことは、特に少量が使用されている場合に結晶化が成功する可能性を高めます。透析チャンバ内の気泡の存在はまた、結晶化プロセスの運動を変更し、実験の再現性を低下させる可能性があります(タンパク質/溶液接触面が改変されているため)。タンパク質だけでなく、結晶化溶液も実験の成功に影響を与える可能性があります。ポンプシステムに新しい50 mLチューブを使用するたびに、新しい実験を開始し、各実験の後にチューブを洗浄すると、汚染の可能性が減少し、装置内の塩結晶の作成を回避します。
微小透析ボタンの使用は、OptiCrysが使用できない場合の代替手段です。上記の結晶成長を最適化し、結晶成長を監視するための戦略は、手動で行う必要があります。通常、これは、温度調節が記載された方法論の重要なステップである場合に問題になる可能性があり、熱調節インキュベーターの外に存在する必要があります。これは、結晶化液の化学組成の変化や、イメージングによる結晶成長のモニタリングを促進しないため、結晶成長プロセスをリアルタイムで制御することはできません。
位相図の知識は、結晶化ベンチOptiCrysを使用して、大規模で高品質の結晶を自動で体系的に成長させることの基礎です。結晶化時の温度、沈殿物濃度、pHなどの物理化学的パラメータの制御は、相図全体にわたって明確に定義された運動軌道におけるタンパク質溶液平衡を移動させる。これは、透析膜を使用して質量輸送を調整し、結晶の大きさと品質に影響を与える結晶化チャンバー内に制御された勾配を作成することによって補完されます。したがって、熱力学データと運動軌道の両方を使用することは、高品質の結晶を成長させるために結晶化プロセスを制御するために不可欠です。OptiCrysのおかげで、多次元空間における系統的な位相図は、以前よりかなり少ない材料を使用してシリアルアプローチで研究することができます。この方法論を実証するために、ここではモデルタンパク質である鶏卵白リソザイムを用いたケーススタディを提供します。ここで紹介するプロトコルを使用してマスタリングすることで、実際のタンパク質システム5、14、17、18に適応することができます。

タンパク質の構造機能関係と生理的経路のメカニズムを理解することは、しばしば水素原子(H)の位置とタンパク質1,2内で電荷がどのように伝達されているかを知ることに依存する。水素原子はX線を弱く散乱するので、その位置は非常に高分解能のX線回折データ(>1Å)3,4でしか決定できない。逆に、中性子結晶学は、水素と重水素(H2、水素の同位体)原子が酸素、窒素および炭素5とほぼ等しい大きさの散乱長を有するように生体高分子における水素原子の正確な位置を得るために使用することができる。しかし、利用可能な中性子源からの中性子磁束はX線ビームのそれよりも弱いので、これはしばしば2、3を補わなければならない。HとHを交換したり、結晶の体積を増やしたりして、水素の支離滅裂な散乱を減らし、回折画像の信号対雑音比を高めることで実現できます。
X線および中性子生体高分子結晶学6の両方に対して大きく、高品質の結晶を得るための様々な結晶化アプローチ(図1に対応する模式相図を示す)がある。蒸気拡散では、タンパク質と結晶化溶液の混合物から調製された液滴は、水または他の揮発性種の蒸発を通じて、同じ結晶化溶液のより高い濃度の沈殿物を含む貯蔵所に対して、時間の経過とともに平衡化される。液滴中のタンパク質および沈殿物の濃度の増加は、これらの核6,7での結晶成長に続いて、自発的核形成に必要な過飽和をもたらす。水蒸気拡散は結晶4を成長する最も頻繁に使用される技術であるが、結晶化プロセスは正確に制御することができない8.自由界面拡散法では、結晶化溶液は濃縮タンパク質溶液に拡散し、システムを過飽和に向けて非常にゆっくりと導く。この方法は、遅い混合率6、9、10、11、12のバッチ方式と考えることができます。バッチ法では、タンパク質は急速に過飽和に至る結晶化溶液と混合され、多くの結晶3,7と共に均一な核形成を行う。この方法は、現在タンパク質データバンクに預け入れされているすべての構造の約3分の1を占めています。透析法は、高品質でよく拡散性の高いタンパク質結晶を成長させることにも使用されます。透析法では、沈殿物の分子が、半透過性膜を通って、タンパク質溶液を用いて別のチャンバーに貯蔵室から拡散する。平衡の動態は、温度、膜孔サイズ、タンパク質サンプルおよび結晶化剤6の体積および濃度などの様々な要因に依存する。
結晶化相図は、タンパク質の異なる状態を異なる物理変数または化学変数3の関数として記述するために使用することができる。図1に示すように、各結晶化技術は、異なる運動軌道を用いて、このような図6、10、13の核形成および転移性ゾーンに到達するように可視化することができる。結晶と溶液の熱力学的平衡が観察されるタンパク質溶解度およびタンパク質濃度に関する情報を提供し、それによって核生成および成長に最適な条件を見つける3,14。2次元相図では、タンパク質濃度は一つの変数の関数としてプロットされ、他の変数は一定の15に保たれます。このような相図では、タンパク質濃度が溶解性曲線を下回ると、溶液が不飽和領域にあり、核生成や結晶成長が生じない。この曲線の上には、タンパク質濃度が溶解限界3,14よりも高い過飽和帯がある。これはさらに3つの領域に分かれています:転移性ゾーン、自然核生成ゾーン、および降水域。転移性領域では、重飽和は、核形成が妥当な時間内に起こるには十分ではないが、種化された結晶の成長が起こり得る。凝集と降水量は、過飽和が高すぎる降水域で好まれ、14,15です。
自発的な核形成に十分な過飽和が達成されると、最初の核は10に現れる。結晶の成長は、溶解性の限界に達するまでタンパク質濃度の低下をもたらす。超飽和が溶解曲線の近傍にとどまっている限り、結晶の大きさに大きな変化はありません。しかしながら、結晶化液の温度および化学組成の変動(例えば、沈殿剤の濃度)がタンパク質溶解性に影響を及ぼし、さらに結晶成長8、13、16の開始を招く可能性が示されている。
透析は良質の結晶成長に有利であるとして、 図2に示されているOptiCrys結晶化ベンチは、完全に自動化された方法で結晶化を制御するために我々の研究室で設計され、開発された8。この目的のために、ソフトウェアは、電子コントローラとチラーを介して、ペルチェの要素と接触して流れる貯水池透析のセットアップの温度の制御と監視を可能にするLabVIEWで書かれました。同じソフトウェアは、多流流体システムを使用して、結晶化溶液の化学組成(例えば結晶化剤の交換)を自動的に調節します。さらに、デジタルカメラと反転顕微鏡を使用して、結晶化プロセスを可視化して記録します。15 μLおよび250 μLの容積の2つの結晶化の部屋は異なった目的のために成長する水晶のために利用できる。結晶化プロセスが可逆的であるため、サンプルが損傷していない限り、タンパク質溶液のほんの数マイクロリットルで異なる条件のスクリーニングが可能である8。その結果、この方法を用い、使用されるタンパク質物質の量を最小限に抑える。
前の研究8から、結晶成長過程の間、 その現場で の観察は一定の時間間隔で行う必要があることが明らかである。これらは、観察中の事象(沈殿、核生成、または結晶成長)に応じて、数秒から数日の範囲で行うことができます。
OptiCrysによる結晶成長の最適化は、温度沈殿物濃度相図に基づいています。温度の直接機能として溶解度を有するタンパク質の場合には、塩漬けレジーム18を利用することができる。このことは、タンパク質沈殿相図を用いて可視化できる溶液のイオン強度を高めることで、タンパク質の溶解度を低下させる。同様に、溶解性が逆のタンパク質は、塩漬けのレジーム18を利用することができる。核生成は、核形成領域において、メタスタブルゾーンの近傍で起こり、そして結晶成長は、タンパク質濃度が溶解限界に達するまで、相図の転移性ゾーンにおいて起こる。図3Aに示すように、一定の化学組成温度を有するとともに、新たな核生成を防止するために、結晶化液をメタスタブルゾーンに保つために低下させることができる。結晶は第2結晶/溶液平衡が達成されるまで成長し、その後、結晶のサイズのそれ以上の増加は見られません。結晶が所望の大きさに達するまで、温度は数回低下します。図3Bでは、一定温度で、沈殿物濃度を上げると、溶液がメタスタブルゾーンに保たれます。このプロセスは、大きな結晶を得るために数回繰り返すことができます。温度を変え、結晶化液条件を操作し、過飽和レベルを制御することにより、OptiCrys5,8,14によって正確かつ自動的に制御される結晶の核化と成長を分離するための2つの強力なツールである。
温度制御によって成長したタンパク質結晶の例としては、温度制御された、あるいは温度および沈殿物濃度制御結晶化、並びに得られる相対回折データが文献およびPDBに利用可能である。その中には、ヒトγ-結晶E、PA-IILレクチン、酵母無機ピロホスファターゼ、ウレートオキシダーゼ、ヒト炭酸脱水酵素II、YchBキナーゼ、乳酸脱水素酵素5、14、17、18が含まれる。
OptiCrysはNatX線によって製品化されましたが、この機器やシリアルアプローチにアクセスできない研究所が数多くあります。この技術の代替は、市販のプラスチック製のマイクロ透析ボタンを様々な容積で使用することです。これらを使用して、温度および化学組成を手動で調節し、変えることができる。マイクロ透析ボタンの検査 は、その場合 は行うことができず、光学顕微鏡で手動で行う必要があります。温度制御は、振動のない温度制御インキュベーターにサンプルを保持することによって達成することができる。結晶化実験を再現するためには温度を一定に保つことが不可欠です。温度の著しい変動は、結晶5の損傷または破壊を招く可能性もある。
ここでは、中性子タンパク質結晶学に適した大きな高品質の結晶の成長のためのサンプル調製と制御ソフトウェアの使用を説明する詳細なプロトコルを提供します。このステップバイステップの手順は、生成される結晶のサイズと品質を制御するために開始位置と運動経路を選択するために結晶化相図を利用するように設計されました。さらに、大きくて高品質な結晶を得るために同じ根拠を使用するマイクロ透析ボタンを備えた結晶を成長させる詳細なプロトコルが提示される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

新しいNMXビームラインが構築され、構造改良ソフトウェアの可用性が向上したおかげで、過去10年間に決定されたほとんどの構造で、中性子高分子結晶学(NMX)の使用は急速に拡大しています。しかし、現在NMXで利用可能な中性子源は、X線結晶学の同等の源よりも著しく弱い。この分野の進歩にもかかわらず、特にこれまで以上に大きな高分子や複合体を研究する傾向があり、中性子回折研究には常に大幅に大きな結晶が必要です。したがって、NMXの使用を拡大するためには、より大きな結晶の成長に適した方法と計装のさらなる改善が必要です。
本研究では、顕微鏡搭載型ビデオカメラを用いたリアルタイム観察と、結晶化液(例えば、沈殿物濃度、pH、添加剤、温度)を組み合わせた合理的な戦略と結晶成長ベンチ(OptiCrys)を紹介します。次に、この温度と化学組成の制御が、モデル可溶性タンパク質を用いた最適な結晶化条件の探索を促進する方法を示す。結晶化の実験の開始位置と運動経路を選択するには、結晶化相図の十分な知識が不可欠です。多次元相図の知識に基づいて、合理的なアプローチが生成される結晶の大きさと数を制御する方法を示す。

セクション2.3および2.4では、最適化された結晶成長の3つの例を示し、装置の使用と大きな結晶を成長するための実験設計を示す。このデモンストレーションでは、リソチームをモデルタンパク質として使用しましたが、結晶成長実験はこの方法を用いて他の多くのタンパク質システムで成功を収めています(上記参照)。ここで提示されるプロトコルを使用してマスタリングすることで、他のタンパク質候補に適応させることができます。
セクション2.3では、中性子タンパク質結晶学に十分な散乱量を持つ結晶を成長させる上で、確立された合理的結晶化戦略が有益であることを実証しました。ここでは、提案された合理的な最適化戦略により、下流構造決定アプローチに必要な特定のサイズの結晶の均一な集団の生成も可能であることを示す。
これら2つの実験は、結晶核化と成長を制御する際の相図の重要性を強調するように設計されています。ここで、結晶化過程をリアルタイムにモニタリングするとともに結晶化液の温度及び化学組成の制御が、定性的相図の研究に用いられる。この方法を用い、核形成および結晶成長を可逆的に合理的に最適化することができる。このような連続アプローチを使用すると、タンパク質の量と結晶のサイズと品質を制御するために必要な時間も削減されます。
透析法では、タンパク質溶液を半透膜6によって結晶化溶液から分離する(図5)。この透析膜は、添加剤、緩衝液、イオンなどの小分子が膜を通過することを可能にするが、タンパク質6,20のような高分子は通過しない。この機能により、実験6の過程で結晶化溶液を修正することができます。ソリューションの交換は、マイクロ透析ボタン、またはこの目的のために開発された機器を使用して自動化された方法で、手動で行うことができます, OptiCrys8.
実験の最初のセットでは、鶏卵白リソザイムの結晶化にマイクロ透析ボタンを使用しました。微小透析用ボタンを、異なる塩濃度の結晶化液に浸漬した。この単純な結晶化グリッド実験では、温度が一定に保たれている間、唯一の変数は沈殿物濃度(293 K)です。 図4に示すように、塩濃度のわずかな変動は、観察される結晶の大きさおよび数の変化を誘発し、結晶化相図の調査を可能にする。 図4では、パネル1において、結晶化溶液は0.7MNaClを含み、より大きな結晶の数が限られているボタンに現れた。塩濃度を0.7から1.2Mに増加させることで、重飽和が増加し、核形成領域内の溶液が、メタスタブルゾーンから遠ざかる(図4、パネル1~6)。その結果、結晶の数が増加し、そのサイズが小さくなります。
温度制御透析結晶化を可能にする完全自動化された機器を用いた最初の実験では、OptiCrys(図9)、結晶成長実験は、大きな結晶成長を生成するように調整されました。実験は、0.75 M NaClと0.1 M Naアセテート緩衝液pH4を含む結晶化溶液を用いて295Kの初期温度で開始した。これらの実験条件下では、結晶化液は、相図のメタスタブルゾーン付近の核形成帯に到達した(図9、矢印1)。その結果、実験の最初の段階で生成された核はわずかです。選択した結晶をさらに成長させるために( 図9参照)、結晶成長最適化ワークフローは、結晶水平衡に達するとすぐに温度を変化させることによって、メタスタブルゾーンに向かって駆動した。
結晶と溶液の平衡に達するたびに、温度を下げ、最初に291K、次に288K、そして最後に275Kにして、結晶化液をメタスタブルゾーンに保った。この実験の結果は、高分子X線と中性子結晶学の両方に適した単一の大きな結晶です。
ほとんどのタンパク質に関して、結晶化実験18の間にタンパク質濃度を正確に測定できる(または結晶化過程をリアルタイムで観察/検出するだけの)実験装置が不足しているため、正確な定量相図(または単に定性的な図)がまだ得られていない。その結果、多くの場合、結晶化が相図の最適な領域、メタスタブルゾーン付近で始まるような方法で実験を設計することができない。
したがって、大きな体積結晶の成長に特化した実験が行われる前に、結晶化最適化研究が行われなければなりません。本研究では、一方で温度変化(一定の化学組成)を用い、一方で化学組成(一定温度)の変動を用いて、メタスタブルゾーンを同定し、大きな結晶成長実験を開始するための最適条件を明示する必要がある。
この目的のために、他の2つの実験が、核化、結晶成長、溶解および再成長のためのOptiCrysによる温度制御透析結晶化実験の可逆性を実証するために調整された2つの実験を提示する。結晶成長最適化ワークフローは、温度または沈殿物濃度の変動を用いて、より少ない、より大きなリソチーム結晶の均一な集団が成長するように制御された。
OptiCrysの2回目の実験では、結晶化溶液の化学組成を可変温度で実験全体を通して一定(0.1 M CH3COONa pH4で0.9 M NaCl)を維持した。初期温度は291Kに設定した。この実験の結果を 図 10にまとめています。高過飽和のため、結晶化チャンバーに多数の小結晶が現れた(図10、パネル1、2)。直接タンパク質溶解性の概念に従って、温度を313Kに徐々に上昇させることで、全ての結晶が溶解した(図10、パネル3、4、5)。最後に、温度を295Kに下げることで、2番目の核形成をメタスタブルゾーン付近で開始し、より少ない数の核の形成を制御することができた。さらに結晶成長は、より大きな結晶の集団の均一な生成をもたらした(図10、パネル7)。
図11に示すように、結晶化液の化学組成の変動は、291Kの一定温度で、より大きな結晶の均一な集団を得るために同様に使用することができる。前の実験と同様に、初期条件は0.1 M CH3COONa pH 4において0.9 M NaClであった。次いで、NaCl濃度を0.9Mからゼロに徐々に低下させて結晶を溶解させた(図11、パネル4、5)。この時点で、NaClは0.1 M CH3COONa pH 4の緩衝液によって完全に置き換えられた。塩濃度を低下させることは、相図の不飽和ゾーンに溶液を保持し、結晶の溶解につながる。次いで、より低いイオン強度を有する新しい結晶化溶液を、0.1 MCH3COONa pH4の0.75 M NaClで、貯留室に注入した。この沈殿物濃度では、90分後に第1の核(図11、パネル6)が現れた。生成される結晶の数は少なく、結晶は以前よりも大きな体積(図11、パネル7)に達した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> 図 1: スケマティック フェーズ 図。3つの結晶化技術のための運動軌道は、塩漬けの体制で表される。各方法は、異なる方法で核化と結晶化を達成し、位相図を通して異なる運動経路によって視覚化され、核形成および転移領域に到達する。溶解性曲線は、不飽和領域と過飽和領域を分離します。過飽和は、3つのゾーンに分かれています:不安定、核形成および沈殿。核形成ゾーンでは、結晶成長が起こる中に自発的な核形成が起こる。この図は、ジュニウスらから適応 しています。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> 図2:結晶化ベンチ(OptiCrys)の模式図。LED光源は温度制御透析フローセルの上に位置しています。反転顕微鏡とデジタルカメラは、赤い矢印で画像の右上に表示されます。赤い円は、チラーチューブの位置を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> 図3:温度(A)および沈殿物濃度(B)の関数としての模式的な2次元タンパク質結晶化相図。(A)直接溶解性を有するタンパク質の場合、温度を下げると、結晶化液が転移領域に保たれます。温度変化は、目的の体積を有する結晶が得られるまで結晶成長過程を制御するために数回繰り返すことができる。(B)沈殿液の濃度を変化させて結晶成長のためのメタスタブルゾーンに結晶化液を保持するためにも使用できる。この図は、ジュニウスらから適応 しています。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> 図4:透析法を用いて得られたリソチームの結晶。本実験は、0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH4において293Kの一定温度で実施した。NaCl濃度を0.7 Mから1.2 Mに増加させることで、核生成速度が増加し、結晶の数が多くなります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> 図5:透析法によるタンパク質結晶化プロセスの概要(A)透析ボタンのチャンバにタンパク質を添加することにより、(B)チャンバの上部にドーム形状が作成される。(C) アプリケータは、透析膜を固定するためにOリングを透析ボタンの溝に移すために使用されます。(D)透析ボタンは、リザーバ溶液に浸漬する準備ができています。(E)結晶化液は半透膜を通過し、結晶がチャンバー内に形成され始める。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> 図6:温度制御流動透析セットアップの概略図。(A)タンパク質サンプルを透析チャンバーに添加する。(B) 透析膜は、アプリケータを使用してOリングで室内に固定されます。(C)室内は回され、透析チャンバーの上部に固定されます。白い矢印は、ねじが室外に置かれる場所を示します。(D)貯留室は時計回りに(E)回され、室の上に固定される。(F)貯留室はポンプシステムへのコネクターが付いた気密キャップで覆われ、(G)フローセルは真鍮の支持体に置かれる。この図は、ジュニウスらから適応 しています。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> 図7:流体系(A)によるリザーバ内の結晶化溶液の調製および注入。塩と水を含むチューブは、圧力/真空コントローラ(B)とロータリーバルブ(C)に接続されています。圧力/真空コントローラを使用することで、チューブからロータリーバルブへの液体の一定の流れを作成します。流量計(D)を通過する各液体は、混合管(F)に注入される。すべての液体が混合管に加えられたら、スイッチは、いくつかの変更によって、混合チューブ(G)に混合管から最終的な溶液を注入する。液体は、昇順(1から6)でマークされた図の矢印の方向にシステムを流れます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> 図 8: 監督ソフトウェアのメンテナンスビューこのビューは、温度、光、結晶化溶液、ズームなどのさまざまなパラメータを制御するために使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> 図9:温度の関数としての位相図(選択した画像は昇順で追跡する)。1つの大きなリソチーム結晶は、温度を295Kから275Kに体系的に変化させたものである。各工程において、溶解曲線に達すると結晶成長が止まる。メタスタブルゾーンに溶液を保つことによって温度を下げることで、結晶成長を再開します。画像の倍率は異なります。この図は、ジュニウスらから適応しています。8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> 図10:温度制御を用いた一定の化学組成における結晶成長の最適化(選択した画像は昇順で追跡される)。核形成域で核形成過程を291Kで開始し、その後、転移性帯から遠く離れて、多数の結晶が形成される。温度を313Kに上げると、透析チャンバに可視核が見えなくなるまで結晶を溶解する。最後に、温度を295Kに下げると、2度目の核生成プロセスが再開され、限られた数の大きな結晶が生じる。この図は、ジュニウスらから適応しています。8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> 図11:沈殿物濃度の変動を用いた一定温度での結晶成長の最適化(選択した画像は昇順で追跡される)。沈殿物濃度を0.9Mから0Mに減少させることで、最初の核生成イベント中に得られた結晶を溶解する。結晶化プロセスは、同じ沈殿物の注入によって再開されるが、より低いイオン強度では0.75 M、これはいくつかの大きな結晶の形成につながる。この図は、ジュニウスらから適応しています。8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

結晶学による生体高分子の構造研究では、高品質の結晶が必要です。ここでは、結晶化相図の知識に基づいて、大規模な高品質の結晶を成長させるためのOptiCrys(当社の研究室で開発された完全に自動化された機器)および/またはマイクロ透析ボタンで使用できるプロトコルを示しています。

中性子高分子結晶学における結晶成長の最適化

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

X線と中性子結晶学の両方に大きく、高品質の結晶を得るための異なる結晶化アプローチがあります。これらのアプローチの1つは、透析法を用いるというものです。この技術では、タンパク質溶液は半透過性膜によって沈殿液から分離される。沈殿分子は膜を横切ってタンパク質チャンバーに拡散する。自発的な核形成のための正しい過飽和が達成されると、最初の核が現れます。ここでは、温度制御透析結晶化を用いて開発した全自動機器であるOptiCrysが使用できるプロトコルと、結晶相図の知識に基づく天然高分子結晶学用の大きな高品質結晶を成長させるマイクロ透析ボタンを用いることを実演します。特定のマイクロリットルの容積ピペット35マイクロリットルのリソチーム溶液を透析チャンバーに付けたマイクロ透析ボタンのため。この余分な容積は透析の部屋の上にわずかにドームの形を作成し、気泡の形成を防ぐ。アプリケーターを取り、弾性またはリングをその先端に置きます。チャンバーの上に膜を置き、アプリケータから透析ボタンの溝に弾性またはリングを移すことによってそれを固定します。結晶化液を含むウェルにボタンを移します。ガラスカバースリップまたはテープで井戸を覆います。振動フリーの熱調整器インキュベーターで293ケルビンでサンプルを保ちます。透析結晶化が結晶成長の観点から利点を提供することを知って、いわゆるOptiCrys結晶化ベンチは、生体分子結晶化実験の温度と化学組成の完全に自動化された組み合わせ制御を提供するために私たちの研究室で設計され、開発されました。OptiCrysによる結晶成長の最適化は、温度沈殿物濃度相図に基づいています。核形成は、転移性領域付近の核形成ゾーンで起こり、次いで、タンパク質濃度が溶液と結晶の間の熱力学的平衡を表す溶解性曲線に達するまで、相図後の転移性領域で起こる。直接溶解性のあるタンパク質の場合には温度を下げるか、塩析が到達した場合の沈殿物濃度を上昇させることにより、結晶化溶液は、転移領域に残り、核形成は起こらない。結晶は平衡が達成するまで成長し、その後、結晶のサイズのそれ以上の増加は見られない。温度を下げるか、沈殿物濃度を増加させる結晶が所望のサイズに達するまで数回繰り返される。セットアップされた温度制御流れの透析チャンバーにタンパク質溶液を加え、透析膜で上の部屋を覆い、弾性またはリングで膜を固定します。オーバーチャンバーを反転し、透析チャンバーの上に置きます。2つの部分の間に閉じ込められたすべての空気を取り除くために穏やかにゆっくりと押し、上の部屋の上にそっとねじ込むことによって、その位置に貯水池を固定します。結晶化液を貯留槽に加え、気密キャップで覆います。このアセンブリを転送し、結晶化ベンチオプティクリスクリスタル成長の乳房サポートにそれを挿入結晶化ベンチOptiCrysの監督ソフトウェアです。これには、4 つの異なるグラフィカル インターフェイスまたはビューが含まれています。ホーム ビューには、他のビューに移動するためのボタンが含まれています。セットアップ インターフェイスの目的は、テスト ビューで自動的に実行できる実験シナリオを定義することです。最後のビューはメンテナンス ビューです。実験を再開するには、結晶化実験をスムーズに実行するための必須パラメータがすべて見つかるメンテナンスビューが開いている必要があります。光部から光度を上げると、光はゼロから、光が100の最大輝度に増加する可能性があります。温度の制御と監視には、温度調整部が使用されます。ボタンをクリックしてオンにします。設定点セクションの温度を設定し、Enterキーを押します。このボタンの下には、2 つのグラフがあります。赤いものは最終を示し、注文温度と黄色のグラフは現在の温度を示しています。ストック溶液を混合し、貯蔵室への結晶化溶液の注入は、Palmセクションによって制御される。最初の段階でストック溶液の濃度を追加します。次に、各新しいグルーパー溶液の最終濃度を見つけ、最終濃度セクションに追加します。計算ボタンを押した後、ストック溶液の量を見つけると計算され、各濃度パネルの前のボリュームパネルに追加されます。起動準備ボタンを押して、新しいプレミアソリューションの準備が整うまで待ちます。結晶化液を交換するには、溶液入力ボタンをクリックします。プロセスを停止するには、[配布の停止] ボタンを押します。顕微鏡部の右側には、各結晶成長実験から重要な情報を記録するためのパネルが複数ある。このセクションでは、対応するタンパク質名、分子量、結晶化条件を追加します。フォルダ名に入力するだけで、実験の名前を定義します。nb画像セクションから、実験中に撮影する画像の数を選択します。画像の番号を追加し、右側のパネルからタイマースケールを選択します。フォルダボタンをクリックしてフォルダを開きます。このフォルダには、実験用に以前に定義したすべての情報を含むテキスト ファイルがあります。これ以上の治療の準備ができている画像もこのフォルダに保存されます。顕微鏡をズームオフすることも自動的に変更することができます。顕微鏡セクションの上にあるプラスボタンとマイナスボタンを使用してズームを変更し、それぞれ倍率を増減します。結晶サイズを測定するには3つの異なる方法があります。長さまたは幅を測定するために幅ベクトルを使用してください。結晶形状に応じて、顕微鏡部の左部分から特定の工具を選ぶことができます。長方形や多角形など。値は、メジャー セクションに表示されます。実験の最初のセットでは、マイクロ透析ボタンは、異なる塩濃度の結晶化溶液に浸漬した。この単純な結晶化グリッド実験では、唯一の変数は沈殿物濃度です。温度が一定に保たれている間。塩濃度のわずかな変動は、塩濃度を0.7から1.2モルの過飽和度上昇に増加させ、核形成ゾーン内の溶液が転移性ゾーンから遠ざかることによって結晶化相図を調べることができるようになる。その結果、結晶の数や大きさの変化が見られ、結晶の数が増え、そのサイズが小さくなります。与えられた実験条件下でのOptiCrysを用いた最初の実験では、透析チャンバー内の平衡が到達すると、結晶化溶液は結晶化相図の転移領域付近の核形成帯内にある。その結果、実験の最初の段階で生成される核はわずかです。結晶の成長をメタスタブルゾーンに保ち、結晶成長過程を制御するために、温度は異なる時間間隔で変化した。結晶溶液平衡が完成する度に、温度を変化させた。したがって、温度は291ケルビン、288ケルビン、そして最後に275ケルビンに低下し、メタスタブルゾーン内で選択された結晶の成長を維持した。この実験の結果は、天然の高分子結晶学に必要な体積を持つ単一の大きな結晶です。次の2つの実験は、核化、結晶成長、溶解および再成長のための温度制御透析実験の可逆性を示す。OptiCrysを用いた2回目の実験では、結晶化溶液の化学組成を実験を通じて一定に保ち、温度を変化させた。初期温度は291ケルビンに設定されました。高過飽和のため、結晶化チャンバーに多数の小結晶が現れた。直接タンパク質溶解性の概念に従って、温度を313ケルビンに徐々に上昇させることで全ての結晶が溶解した。最後に、温度を295ケルビンに下げることによって、2番目の核形成をメタスタブルゾーン付近で開始し、より少ない数の核形成をもたらす核形成プロセスを制御することを許した。さらに結晶成長により、より大きな結晶の均一な集団を生成することができた。本実験では、結晶化液の化学組成を一定温度で変化させると、より大きな結晶の均一な集団を得る。結晶化条件は、前回の実験と同様であった。結晶を溶解し、NaCl濃度を0.9モルからゼロに徐々に低下させることで達成した。塩濃度を低下させることは、結晶の溶解につながる相図の不飽和ゾーン内の溶液を維持する。次いで、以前よりも低いイオン強度を有する新しい結晶化溶液を、貯留室に注入した。この沈殿物濃度では、結晶の数が少なく、結晶が以前よりも大きな体積に達します。ここでは、ラボで開発された完全に自動化された機器を使用して、天然の高分子結晶学用の大きくて高品質の結晶を成長させるサンプル調製と制御ソフトウェアの調整を説明する詳細なプロトコルを提供しました。このステップバイステップの手順は、核生成と結晶成長を分離するために結晶化相図の知識から設計され、利益を得た。さらに、微小細胞化パターンを持つ結晶を成長するためのプロトコルは、OptiCrysが利用できない場合の代替としてマクロサイトシスボタンを使用して提示されます。私がOptiCrysの結晶化溶液の化学組成と温度を変更し、画像を撮るために言及した戦略に加えて、手動で行う必要があります。温度を一定に保つためにインキュベーターの熱調節振動を使用することが必要であり、これは実証された方法論の重要なステップである。

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

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最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

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ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em&gt; E。大腸菌</em&gt; X線結晶用

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Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

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