Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS는 2015년 계약에 따라 LABEX VALO GRAL의 지원을 인정합니다. NJ는 CEA의 국제 박사 과정 연구 프로그램 (Irtelis)을 박사 학위 펠로우십에 대해 인정합니다. 저자는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 722687에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 인정합니다. 저자는 또한 에스코 옥사넨 박사 (ESS, 룬드)와 박사 장 - 루크 페러 (IBS, 그르노블) 도움이 대화와 통찰력에 감사드립니다. IBS는 그르노블의 학제 간 연구소 (IRIG, CEA)에 통합을 인정합니다.

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

상이한 물리적, 화학적 및 생물학적 변수는 단백질용해도(21)에영향을 줌으로써 단백질 결정화에 영향을 미친다. 이러한 변수 중, 결정화 용액의 온도 및 화학 조성은 중성자 회절 연구를 위한 생체 거대 분자의 큰 고품질 결정을 개선하고 성장시키기 위해 투석 기술과 함께 여기에 사용된다. 위상 다이어그램에 대한 지식을 사용하여 결정화는 더욱 예측 가능하게 됩니다. 직렬 접근법에서 다른 결정화 조건의 선별도 가능하지만, 제시된 합리적 접근법을 사용하는 주요 목적은 결정 핵형성 및 성장의 역학을 분리하고 제어하는 것이다.
모든 결정화 연구와 마찬가지로 고품질순수및 균일성 단백질 샘플및 먼지가 없는 결정화 솔루션은 실험성공률을 높입니다. 솔루션의 여과 및 원심분리는 설명된 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 분자량(적절한 투석막을 선택하기 위해), 동전점 및 단백질 용해도와 같이 연구된 단백질의 물리화학적 특성을 아는 것은 최적의 결정 성장 실험의 설계에 매우 중요합니다. 또한, 샘플 손실을 방지하고 성공 가능성을 높이기 위해 다른 온도 또는 다른 화학 물질에서 단백질 안정성을 고려해야합니다. OptiCrys의 온도 범위(233.0-353.0 ± 0.1 K)를 고려할 때, 이를 사용하여 광범위한 단백질을 결정화할 수 있습니다. 그러나 열성 성 공급원의 단백질과 같이 주로 열안정성 단백질이 이 기기에서 제공하는 온도 조절 대용량 결정 성장 실험에서 가장 큰 혜택을 누릴 수 있다는 점을 강조할 가치가 있습니다.
저용량 투석실(OptiCrys를 사용할 때) 또는 미세투석 버튼을 사용하고 여러 온도 및 결정화 조건(예: 침전제 농도 또는 pH의 그리드)을 사용하여, 대사구역(핵과 메타안정 구역 간의 역학 평형)의 한계에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이것은 결정화에 있는 새로운 단백질 후보에 대한 성공적인 결정 성장 실험을 디자인할 때 특히 귀중합니다. 이러한 정보 실험없이 는 고과포화를 가진 위상 다이어그램의 영역에서 시작하여, 메타스터블 영역의 한계로부터 너무 멀리 떨어져 결정 핵형성을 용이하게 제어할 수 있다. 단백질 침전물의 용해는 시도될 수 있지만, 예를 들어 직접적인 용해도의 경우 온도를 증가시킴으로써, 열안정성이 감소한 단백질의 경우, 샘플을 더 오랜 기간 동안 고온에서 유지하면 단백질 침전이 돌이킬 수 없게 될 수 있다. 따라서, 최선의 전략은 핵형성을 조절하고 단백질 강수량을 피할 수 있는 메타안정성의 한계 에 가까운 낮은 과포화를 가진 초기 상태를 사용하는 것으로 구성된다. 이에 따라, 결정화 전검사는 투석 챔버에서 단백질 침전을 가질 가능성을 감소시키고 실험의 성공률을 증가시킨다.
실험을 설계한 후 투석실(OptiCrys) 또는 미세투석 버튼을 준비하는 것이 또 다른 중요한 단계입니다. 투석 챔버/버튼에서 기포 형성을 방지하면 특히 소량이 사용될 때 성공적인 결정화의 가능성이 증가합니다. 투석챔버에 기포가 존재하면 결정화 과정의 운동성을 변화시키고 실험의 재현성을 감소시킬 수 있다(단백질/용액 접촉 표면이 변형되었기 때문). 단백질뿐만 아니라 결정화 용액은 실험의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 각 실험 후 새로운 실험을 시작하고 튜브를 세척하고자 할 때마다 펌핑 시스템에 새로운 50mL 튜브를 사용하면 오염 의 가능성이 감소하고 장치에 소금 결정의 생성을 방지합니다.
OptiCrys를 사용할 수 없을 때 마이크로 투석 버튼의 사용은 대안입니다. 위에서 언급한 결정화 및 모니터링 결정 성장을 최적화하기 위한 전략은 수동으로 수행해야 합니다. 일반적으로 이것은 온도 조절이 설명된 방법론에서 중요한 단계일 때 문제가 될 수 있는 열조절 인큐베이터 외부에 있어야 합니다. 이는 결정화 용액의 화학적 조성을 변화시키지 못하거나, 이미징에 의한 결정 성장을 모니터링하므로, 결정 성장 공정은 실시간으로 제어될 수 없다.
위상 다이어그램에 대한 지식은 결정화 벤치인 OptiCrys를 사용하여 자동화된 방식으로 크고 고품질의 결정을 체계적으로 성장시키는 기초입니다. 결정화 시 온도, 침전성 농도 및 pH와 같은 물리화학 적 파라미터의 제어는 위상 다이어그램을 통해 잘 정의 된 운동 궤적에서 단백질 용액 평형을 이동합니다. 이것은 질량 수송을 조정하고 결정의 크기 그리고 질에 영향을 미치는 결정화 챔버에 통제된 그라데이션을 만들기 위하여 투석 막의 사용에 의해 보완됩니다. 따라서, 열역학 데이터와 운동 궤적을 모두 사용하여 고품질의 결정을 성장시키기 위해 결정화 공정을 제어하는 데 필수적이다. OptiCrys 덕분에 다차원 공간의 체계적인 위상 다이어그램은 이전보다 훨씬 적은 재료를 사용하여 직렬 접근 방식으로 연구할 수 있습니다. 이 방법론을 보여주기 위해, 우리는 여기에 모델 단백질, 닭 계란 흰자 리소지메와 사례 연구를 제공합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하고 마스터함으로써 실제 단백질시스템에 적응할 수 있다5,14,17,18.

단백질의 구조 기능 관계와 생리적 경로의 메커니즘을 이해하는 것은 종종 수소 원자 (H)의 위치와 전하가 단백질1,2내에서 전달되는 방법을 아는 데 의존합니다. 수소 원자가 X선을 약하게 분산시키기 때문에, 그들의 위치는 매우 고해상도 X선 회절 데이터(>1 Å)3,4로만결정할 수 있다. 반대로, 중성자 결정예학은 수소 및 중수소(H2, 수소 의 동위원소) 원자가산소, 질소 및 탄소5와거의 동일한 크기의 분란 길이를 가지는 것과 같은 생물학적 거대 분자에서 수소 원자의 정확한 위치를 획득하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 사용 가능한 중성자 소스에서 중성자 플럭스는 X 선 빔의 것보다 약하므로 종종2,3에대해 보상해야합니다. 이는 H를H2와 교환하거나 결정의 부피를 증가시켜 수소의 일관되지 않은 산란을 줄이고 회절 이미지의 신호 대 잡음 비율을 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
X선 및 중성자 바이오-거대 분자 결정학6모두에 대해 크고 고품질의 결정을 얻기 위한 다양한 결정화 접근법(그림 1에해당 회로도 도면 다이어그램이 도시됨)이 있다. 증기 확산에서, 단백질과 결정화 용액의 혼합물로부터 제조된 액적물은 시간이 지남에 따라, 물 또는 다른 휘발성 종의 증발을 통해, 동일한 결정화 용액의 높은 농도를 포함하는 저수지에 대해 평형화된다. 액적에서 단백질과 침전제의 농도가 증가하면 이러한 핵6,7에서결정 성장을 거쳐 자발적인 핵형성에 필요한 대체성으로 이어집니다. 증기 확산은 결정4를성장시키는 데 가장 자주 사용되는 기술이지만 결정화 공정은 정확하게 제어할 수 없습니다8. 자유 인터페이스 확산 방법에서 결정화 용액은 농축 된 단백질 용액으로 확산되어 시스템을 매우 느리게 대체로 안내합니다. 이 방법은 느린 혼합 속도6,9,10,11,12를가진 배치 방법으로 간주 될 수있다. 배치 방법에서, 단백질은 빠르게 결정화 용액과 혼합되어 신속한 과포화를 초래하고 차례로 많은 결정3,7을가진 균일한 핵형성을 이끈다. 이 방법은 현재 단백질 데이터 뱅크에 증착된 모든 구조물의 약 1/3을 차지합니다. 투석 방법은 고품질의 잘 확산되는 단백질 결정을 재배하는 데도 사용됩니다. 투석 방법에서, 반 투과성 멤브레인을 통해 저수지로부터 침전제 확산의 분자는 단백질 용액을 가진 별도의 챔버로. 평형의 역학은 온도, 막 모공 크기 및 단백질 샘플 및 결정화 제의 부피 및 농도와 같은 다양한 요인에 의존한다6.
결정화 상 다이어그램은 단백질의 상이한 상태를 상이한 물리적 또는 화학적 가변3의함수로서 설명하기 위해 사용될 수 있다. 도 1에도시된 바와 같이, 각 결정화 기술은 이러한 다이어그램6,10,13의핵 및 메타스터블 영역에 도달하기 위해 상이한 운동 궤적을 사용하는 것으로 시각화될 수 있다. 이는 결정과 용액 사이의 열역학 평형이 관찰되는 단백질 용해도 및 단백질 농도에 대한 정보를 제공하여 핵형성 및 성장을 위한 최적의 조건을찾아3,14를제공한다. 2차원 상 다이어그램에서, 단백질 농도는 하나의 변수의 함수로 플롯되고 다른 변수는 상수15를유지한다. 이러한 위상 다이어그램에서, 단백질 농도가 용해도 곡선 이하일 때, 용액은 저포화 영역에 있으며 핵형성 이나 결정 성장이 발생하지 않는다. 이 곡선 위에는 단백질 농도가 용해도 제한3,14보다높은 미차 영역이 있다. 이것은 메타안정 영역, 자발적핵영역 및 강수영역의 세 가지 영역으로 더 나뉩니다. 메타스터블 영역에서, 중화는 핵형성이 적당한 시간 내에 발생하기에 충분하지 않지만 종자 결정의 성장이 일어날 수 있다. 집계 및 침전은 강수영역에서 선호되며, 과포화가14,15로너무 높다.
자발적인 핵형성에 대한 충분한 대체성이 달성되면, 제1핵은10이나타난다. 결정의 성장은 용해도의 한계에 도달할 때까지 단백질 농도의 감소로 이끌어 냅니다. 고용성 곡선 부근에 미숙성이 머무르는 한, 결정의 크기에 큰 변화가 없을 것입니다. 그러나 결정화 용액의 온도 및 화학 조성물의 변이(예를 들어, 침전제의 농도)는 단백질 용해도에 영향을 미치고 추가 결정 성장8,13,16의개시로 이어질 수 있음을 보여주었다.
투석이 양호한 품질의 결정 성장에 유리하기 때문에 그림 2에도시된 OptiCrys 결정화 벤치는 완전히 자동화된 방식으로 결정화를 제어하기 위해 실험실에서 설계 및 개발되었습니다8. 이를 위해 소프트웨어는 LabVIEW로 작성되어 전자 컨트롤러와 냉각기를 통해 펠티에 요소와 접촉하여 흐르는 저수지 투석 설정의 온도를 제어하고 모니터링할 수 있습니다. 동일한 소프트웨어는 또한 다중 채널 유체 시스템을 사용하여 결정화 용액(예: 결정화 제의 교환)의 화학 조성을 자동으로 조절합니다. 또한 디지털 카메라와 반전된 현미경을 사용하여 결정화 프로세스를 시각화하고 기록합니다. 15 μL 및 250 μL 부피를 가진 두 개의 결정 챔버는 다른 목적을 위해 크리스탈을 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 결정화 과정이 가역적이기 때문에, 샘플이 손상되지 않는 한 단백질 용액의 마이크로리터가 몇 개만 으로 상이한 조건에 대한 스크리닝이 가능하다8. 그 결과, 이 방법을 사용하면 사용되는 단백질 물질의 양을 최소화할 수 있습니다.
이전 작업8에서,결정 성장 과정에서, 현장에서 관찰을 정기적으로 수행 할 필요가 있음을 분명하다. 이들은 관찰하에 있는 사건 (강수량, 핵형성, 또는 결정 성장)에 따라 몇 초에서 며칠까지 다양할 수 있습니다.
OptiCrys를 통해 결정 성장의 최적화는 온도 침전성 농도 위상 다이어그램을 기반으로 합니다. 온도의 직접적인 기능으로서 용해도가 있는 단백질의 경우, 염염기(18)를 사용할수 있다. 이것은 단백질 침전물 상 다이어그램을 사용하여 시각화될 수 있는 용액의 이온 강도를 증가시켜 단백질의 용해도를 감소시키는 곳입니다. 마찬가지로, 역용성을 가진 단백질은 염염기18을사용할 수 있다. 핵형성은 핵형성 영역에서 발생하며, 메타안정 영역 부근에서 결정성장이 이루어지며, 단백질 농도가 용해도 한계에 도달할 때까지 위상 다이어그램의 메타안정 영역에서 결정성장이 일어난다. 도 3A에도시된 바와 같이, 일정한 화학 조성 온도로 새로운 핵형성을 방지하기 위해 메타안정 구역내결정화 용액을 유지할 수 있다. 결정은 제 2 크리스탈 /용액 평형이 달성 될 때까지 성장하고 그 후, 결정의 크기가 더 이상 증가관찰되지 않습니다. 결정이 원하는 크기에 도달할 때까지 온도가 여러 번 감소합니다. 도 3B에서,일정한 온도에서, 강수량 농도를 증가시켜 메타안정 구역내용을 유지한다. 이 과정은 큰 결정을 얻기 위해 여러 번 반복 될 수있다. 온도를 변경하고 결정화 용액 조건을 조작하여, 과포화 수준을 제어함으로써, OptiCrys5,8,14에의해 정확하고 자동으로 제어되는 결정의 핵 형성 및 성장을 분리하기위한 두 가지 강력한 도구이다.
온도 조절, 또는 온도 및 침전제 농도 제어 결정화에 의해 성장된 단백질 결정의 예뿐만 아니라 얻어진 상대적 회절 데이터는 문헌 및 PDB에서 사용할 수 있다. 그 중 인간 γ 결정린 E, PA-IIL 렉틴, 효모 무기 파이로포스파타제, 우레이트 산화효소, 인간 탄산 탄성 안수드라제 II, YchB 키나아제, 젖산 탈수소효소5,14,17,18이있다.
OptiCrys는 NatX-ray에 의해 상용화되었지만,이 악기 또는 제공하는 직렬 접근 방식에 액세스 할 수없는 많은 실험실이 있습니다. 이 기술의 대안은 다양한 볼륨으로 시판되는 플라스틱 미세 투석 버튼을 사용하는 것입니다. 이를 이용하여, 온도 및 화학 조성물은 수동으로 조정되고 변화할 수 있다. 미세 투석 버튼의 검사는 자리에서 수행 할 수 없으며 대신 광학 현미경으로 수동으로 수행해야합니다. 온도 제어는 진동이 없는 온도 제어 인큐베이터에 샘플을 유지함으로써 달성될 수 있습니다. 결정화 실험이 재현가능한지 확인하기 위해 온도를 일정하게 유지하는 것이 필수적입니다. 온도의 상당한 변화는 또한결정5의손상 또는 파괴로 이어질 수 있습니다.
여기서 우리는 중성자 단백질 결정학에 적합한 크고 고품질의 결정의 성장을 위한 시료 준비 및 제어 소프트웨어의 사용을 설명하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 절차는 생성된 결정의 크기와 품질을 제어하는 시작 위치 및 운동 경로를 선택하기 위해 결정화 상 다이어그램을 활용하도록 설계되었습니다. 또한 미세 투석 버튼이있는 커지는 결정을 위한 자세한 프로토콜이 제시되어 동일한 근거를 사용하여 크고 고품질의 결정을 얻습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

중성자 대분자 결정학(NMX)의 사용은 새로운 NMX 빔라인이 구축되고 구조 개선 소프트웨어의 가용성을 증가시키기 때문에 지난 10년 동안 결정된 대부분의 구조로 빠르게 확장되고 있습니다. 그러나, NMX에 현재 유효한 중성자 근원은 X 선 결정학을 위한 동등한 근원 보다는 현저하게 약합니다. 이 분야의 진보에도 불구하고, 중성자 회절 연구에는 항상 훨씬 더 큰 결정이 필요하며, 특히 거대 분자와 복합체를 연구하는 경향이 있습니다. 따라서 더 큰 결정 성장에 적합한 방법과 계측의 추가 개선이 필요하며, 따라서 NMX를 확장하려면 필요합니다.
이 작품에서는 현미경 장착 비디오 카메라를 통해 실시간 관찰을 결합한 합리적인 전략과 결정화 솔루션(예: 침전제 농도, pH, 첨가제, 온도)을 정밀하게 제어할 수 있는 합리적인 전략과 크리스탈 성장 벤치(OptiCrys)를 소개합니다. 그런 다음 온도 및 화학 조성의 이러한 제어가 모델 용해성 단백질을 사용하여 최적의 결정화 조건을 찾는 방법을 보여줍니다. 결정화 단계 다이어그램에 대한 철저한 지식은 결정화 실험에 대한 시작 위치 및 운동 경로를 선택하는 데 매우 중요합니다. 당사는 합리적인 접근 방식이 다차원 위상 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 생성된 결정의 크기와 수를 어떻게 제어할 수 있는지 보여줍니다.

섹션 2.3 및 2.4에서는 최적화된 결정 성장의 세 가지 예가 제시되어 계측기의 사용과 대형 결정 성장을 위한 실험 적 설계를 보여 주어 있습니다. 이 데모를 위해, 우리는 이 방법을 사용하여 많은 다른 단백질 시스템으로 결정 성장 실험이 성공적으로 수행되었지만 리소지메를 모델 단백질로 사용했습니다(위 참조). 여기에 제시된 프로토콜을 사용하고 마스터함으로써 다른 단백질 후보에 적응할 수 있다.
섹션 2.3에서 우리는 확립 된 합리적인 결정화 전략이 중성자 단백질 결정학을위한 충분한 산란 볼륨으로 결정 성장에 도움이 될 수 있음을 입증했습니다. 여기서, 제안된 합리적 최적화 전략은 또한 다운스트림 구조 결정 접근에 필요한 특정 크기의 결정의 균일한 인구의 생성을 허용한다는 것을 보여줍니다.
이 두 가지 실험은 결정 핵 형성 및 성장을 제어하는 위상 다이어그램의 중요성을 강조하기 위해 고안되었습니다. 여기서, 결정화 공정을 실시간으로 모니터링하는 조합으로 결정화 용액의 온도 및 화학조성의 제어는 질적 위상 다이어그램을 연구하는 데 사용된다. 이 방법을 사용하여 핵 형성 및 결정 성장은 가역적 인 방식으로 합리적으로 최적화 될 수 있습니다. 이러한 직렬 접근법을 사용하면 결정의 크기와 품질을 제어하는 데 필요한 단백질의 양과 시간이 줄어듭니다.
투석 방법에서, 단백질 용액은 반투과성 멤브레인6(도 5)에의해 결정화 용액으로부터 분리된다. 이 투석 막은 첨가제, 완충 및 이온과 같은 작은 분자가 단백질6,20과같은 거대 분자는 막을 통과하지만 막을 통과할 수 있게 한다. 이 기능을 사용하면 실험6을진행하는 동안 결정화 솔루션을 수정할 수 있습니다. 솔루션의 교환은 마이크로 투석 버튼, 또는 이러한 목적을 위해 개발 된 악기를 사용하여 자동화 된 방식으로 수동으로 수행 할 수 있습니다, OptiCrys8.
실험의 첫 번째 세트에서, 미세 투석 버튼은 닭 계란 - 흰자 리소지메의 결정화에 사용되었다. 미세 투석 버튼은 다른 염분 농도를 가진 결정화 솔루션에 침지되었습니다. 이 간단한 결정화 그리드 실험에서, 유일한 변수는 침전성 농도이며 온도는 일정하게 유지됩니다(293 K). 도 4에도시된 바와 같이, 염 농도의 약간의 변화는 관찰된 결정의 크기와 수의 변화를 유도하여 결정화 상 다이어그램의 조사를 가능하게 한다. 도 4에서,패널 1에서, 결정화 용액은 0.7 M NaCl을 포함하고 더 큰 결정의 제한된 수는 버튼에 나타났다. 염 농도를 0.7에서 1.2M로 증가시킴으로써, 핵형성 영역내의 과포화가 증가하고 용액이 메타스터블 존에서 멀리 이동한다(도4,패널 1 에서 6). 그 결과, 결정의 수가 증가하고 그 크기는 감소합니다.
온도 조절 투석 결정화를 가능하게 하는 완전 자동화된 계측기를 가진 첫번째 실험에서 OptiCrys(도 9)는, 결정 성장 실험은 큰 결정 성장을 생성하도록 조정되었다. 이 실험은 0.75 M NaCl 및 0.1 M Na 아세테이트 버퍼 pH 4를 포함하는 결정화 용액으로 295 K의 초기 온도에서 시작되었습니다. 이러한 실험 조건하에서, 결정화 용액은 위상 다이어그램의 메타안정 영역 부근의 핵형성 영역에 도달하였다(도9,화살표 1). 그 결과, 실험의 첫 번째 단계에서 는 몇 가지 핵만이 생성되었다. 선택된 결정을 더욱 성장시키기 위해(도 9에도시됨) 결정 성장 최적화 워크플로우가 결정용 평형에 도달하는 즉시 다양한 온도로 메타스터블 영역으로 구동되었다.
결정과 용액 사이의 평형에 도달할 때마다 온도가 먼저 291K로, 288K로, 마지막으로 275K로 낮아져 메타스터블 영역에서 결정화 용액을 유지했습니다. 이 실험의 결과는 거시분자 X선과 중성자 결정학 모두에 적합한 단일 대형 결정이다.
대부분의 단백질의 경우, 정확한 정량적 위상 다이어그램(또는 다만 질적 다이어그램)은 결정화 실험 동안 단백질 농도(또는 실시간으로 결정화 공정을 관찰/검출하는 것만으로) 단백질 농도를 정확하게 측정할 수 있는 실험 장치의 부족으로 인해 아직 얻어지지않았다. 그 결과, 메타스터블 영역 부근에서 위상 다이어그램의 최적 영역에서 결정화가 시작되는 방식으로 실험을 설계하는 것이 종종 불가능합니다.
따라서, 대용량 결정의 성장에 전념하는 실험이 착수되기 전에 결정화 최적화 연구가 이루어져야 한다. 본 연구에서는, 한편으로는 온도 변화(일정한 화학 조성물에서)를 사용하고 화학 조성물의 변화(일정한 온도)를 사용하여, 메타안정 영역을 식별하고 큰 결정 성장 실험을 시작하기 위한 최적의 조건을 묘사할 필요가 있다.
이를 위해, 핵형성, 결정 성장, 용해 및 재성장을 위한 OptiCrys를 사용하여 온도 제어 투석 결정화 실험의 가역성을 입증하기 위해 맞춤화된 두 가지 다른 실험이 제시되었다. 결정 성장 최적화 워크플로우는 온도 또는 침전성 농도의 변화를 사용하여 더 적은, 더 큰 리소지메 결정의 균일한 인구가 성장되도록 제어되었다.
OptiCrys를 가진 두 번째 실험에서, 결정화 용액의 화학 조성은 가변 온도를 가진 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었다(0.9 M NaCl in 0.1 MCH3COONa pH 4) 가변 온도를 가진. 초기 온도는 291 K로 설정되었습니다. 이 실험의 결과는 그림 10으로요약됩니다. 높은 과포화로 인해 결정화 챔버(도 10,패널 1 및 2)에 많은 수의 작은 결정이 나타났습니다. 직접 단백질 용해도의 개념에 따라, 온도를 313K로 점진적으로 증가시킴으로써, 모든 결정이 용해되었다(도10,패널 3, 4 및 5). 마지막으로, 온도를 295K로 낮추어, 제2 핵형성은 메타안정 영역 부근에서 개시되었고, 더 적은 수의 핵의 제어형성을 허용했다. 추가 결정 성장은 더 큰 결정의 인구의 균일 한 생성을 초래(도 10,패널 7).
도 11에도시된 바와 같이, 결정화 용액의 화학조성의 변화는, 291K의 일정한 온도에서, 마찬가지로 더 큰 결정의 균일한 집단을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이전 실험과 마찬가지로, 초기 조건은 0.1 M CH3COONa pH 4에서 0.9 M NaCl이었다. NaCl 농도는 0.9M에서 0으로 점진적으로 낮아져 결정을 용해시켰다(도11,패널 4 및 5). 이 시점에서 NaCl은 0.1 M CH3COONa pH 4의 버퍼 솔루션으로 완전히 대체되었습니다. 염 농도를 줄이면 해법의 저포화 영역에서 용액이 유지되어 결정의 용해로 이어집니다. 이어서, 0.75 M NaCl에서 0.1 M CH3COONa pH 4에서 이온 강도가 낮은 새로운 결정화 용액을 저수지 챔버에 주입되었다. 이 침전 농도에서, 첫 번째 핵이 나타났다(도 11,패널 6) 후 90 분. 생성된 결정의 수는 이전보다 낮았고 결정이 이전보다 더 큰 부피(도11,패널 7)에 도달하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> 그림 1: 회로도 상 다이어그램. 세 가지 결정화 기술에 대한 운동 궤적은 염질 아웃 정권으로 표현된다. 각 방법은 핵형성 및 결정화를 다르게 달성하며, 핵형성 및 메타안정 영역에 도달하기 위해 위상 다이어그램을 통해 상이 다른 운동 경로에 의해 시각화된다. 용해도 곡선은 저조도 및 과포화 영역을 구분합니다. 과포화는 세 가지 영역으로 나뉩니다: 메타스터마안정, 핵형성 및 침수. 핵형성 영역에서, 메타안정 구역 결정 성장이 일어나는 동안 자발적인 핵화가 발생한다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> 그림 2: 결정화 벤치(OptiCrys)의 회로도 표현. LED 광원은 온도 조절 투석 흐름 셀 위에 있습니다. 반전된 현미경과 디지털 카메라가 빨간색 화살표로 이미지의 오른쪽 상단에 표시됩니다. 빨간색 원은 냉각기 튜브의 위치를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> 도 3: 온도(A) 및 침전성 농도(B)의 함수로서 회로도 2차원 단백질 결정화 상 다이어그램. (A) 직접 용해도가 있는 단백질의 경우, 온도를 낮추면 메타스터마스터블 영역에서 결정화 용액을 유지합니다. 온도 변화는 원하는 부피를 가진 결정이 얻어질 때까지 결정 성장 과정을 제어하기 위해 여러 번 반복될 수 있다. (b) 침전액의 농도를 변경하면 결정화가 커지는 것을 위한 메타안정 구역에서 결정화 용액을 유지하는 데도 사용될 수 있다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> 도 4: 투석 방법을 사용하여 얻은 리소지메의 결정. 본 실험은 0.1M 아세테이트 버퍼 pH 4에서 293 K의 일정한 온도에서 수행하였다. NaCl 농도를 0.7M에서 1.2M로 증가시켜 핵형성 속도를 증가시키고 더 많은 수의 결정을 초래한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> 도 5: 투석 방법에 의한 단백질 결정화 공정의 개요. (A) 투석 버튼의 챔버에 단백질을 첨가함으로써, (B) 돔 형상이 챔버의 상단에 생성된다. (C) 어플리케이터는 투석 막을 제자리에 고정시키기 위해 투석 버튼의 홈으로 O-링을 전송하는 데 사용됩니다. (D) 투석 버튼은 저수지 용액에 침지 할 준비가되어 있습니다. (E) 결정화 용액은 반과성 멤브레인을 통과하고 결정은 챔버 내부로 형성되기 시작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> 그림 6: 온도 조절 투석 설정의 회로도. (A) 단백질 샘플은 투석 챔버에 첨가된다. (B) 투석막은 어플리케이터를 사용하여 O-링으로 실내로 고정된다. (C) 상공 챔버가 돌기및 투석 실의 상단에 고정됩니다. 흰색 화살표는 나사가 챔버에 배치되는 위치를 나타냅니다. (D) 저수지 챔버는 시계 방향으로 (E) 회전하고 상공 회의소 의 상단에 고정됩니다. (F) 저수지 챔버는 펌핑 시스템에 커넥터가 있는 밀폐 캡으로 덮여 있으며 (G) 유량 셀은 황동 지지체에 배치된다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> 도 7: 유체 계(A)에 의한 저수지내 결정화 용액의 제조 및 주입. 소금과 물을 포함하는 튜브는 압력/진공 컨트롤러(B)와 로터리 밸브(C)에 연결됩니다. 압력/진공 컨트롤러는 압력을 사용하여 튜브에서 로터리 밸브로 액체의 일정한 흐름을 생성합니다. 유량계(D)를 통과하는 각 액체와 스위치는 혼합 튜브(F)에 주입된다. 모든 액체가 혼합 튜브에 추가되면 일부 수정에 의한 스위치는 혼합 튜브에서 저수지 (G)로 최종 용액을 주입합니다. 액체는 오름차순으로 표시된 다이어그램의 화살표 방향으로 시스템을 통해 흐릅니다(1에서 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> 그림 8: 감독 소프트웨어의 유지 보수 보기입니다. 이 뷰는 온도, 빛, 결정화 솔루션 및 줌과 같은 다양한 매개 변수를 제어하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> 그림 9: 온도의 함수로서의 위상 다이어그램(선택한 이미지는 오름차순으로 추적되어야 합니다). 하나의 큰 리소지메 결정은 체계적으로 온도를 295 K에서 275 K로 변경하여 얻어진다. 각 단계에서 는 용해도 곡선에 도달하면 결정 성장이 중단됩니다. 메타스터블 존에 용액을 유지하여 온도를 감소시켜 결정 성장을 다시 시작합니다. 이미지는 배율의 다른 수준을 가지고있다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> 도 10: 온도 제어를 사용하여 일정한 화학 조성에서 결정 성장의 최적화(선택된 이미지는 오름차순으로 추적되어야 한다). 메타안정 영역에서 멀리 떨어진 291 K에서 핵형성 영역에서 핵형성 공정을 시작하면 수많은 결정의 형성이 초래한다. 온도를 313 K로 늘린 다음 투석 실에서 눈에 보이는 핵이 보이지 않게 될 때까지 결정을 용해시게 됩니다. 마지막으로, 온도를 295 K로 낮추면 핵형성 공정이 두 번째로 다시 시작하여 제한된 수의 더 큰 결정으로 이어진다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> 도 11: 침전 농도의 변화를 사용하여 일정한 온도에서 결정 성장의 최적화(선택된 이미지는 오름차순으로 추적되어야 한다). 침전수 농도를 0.9M에서 0M로 낮추면 제1 핵형성 이벤트 동안 얻어진 결정이 용해됩니다. 결정화 과정은 동일한 침전제의 주입에 의해 다시 시작되지만 낮은 이온 강도, 0.75 M로, 이는 몇 가지 더 큰 결정의 형성으로 이어진다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

X선과 중성자 결정학 모두에 대해 크고 고품질의 결정을 얻기 위한 다양한 결정화 접근법이 있습니다. 이러한 방법 중 하나는 투석 방법을 사용하는 것입니다. 이 기술에서, 단백질 용액은 반 투과성 막에 의해 침전성 용액으로부터 분리된다.침전성 분자는 단백질 챔버로 막을 가로질러 확산됩니다. 자발적인 핵형성에 대한 올바른 대체성이 달성되면 첫 번째 핵이 나타납니다. 여기에서는 온도 제어 투석 결정화를 사용하는 실험실에서 개발된 완전 자동화 기기인 OptiCrys에서 사용할 수 있는 프로토콜과 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 바탕으로 천연 거대 분자 결정예 촬영을 위한 고품질 의결을 성장시키는 마이크로 투석 버튼을 시연합니다.특정 마이크로리터 볼륨 파이펫35 마이크로리터용 리소지메 용액이 투석실에 있는 마이크로 투석 버튼의 경우. 이 여분의 볼륨은 투석 챔버 위에 약간 돔 모양을 생성하고 기포 형성을 방지합니다. 어플리케이터를 가지고 탄성 또는 링을 극단에 놓습니다.멤브레인을 챔버 위에 놓고 어플리케이터에서 투석 버튼의 홈으로 탄성 또는 링을 전송하여 고정합니다. 결정화 용액을 포함하는 우물로 버튼을 전송합니다. 유리 커버 슬립 또는 테이프 조각으로 우물을 덮습니다.진동 없는 열 레귤레이터 인큐베이터에 293 켈빈에 샘플을 보관하십시오. 투석 결정화가 결정화 관점에서 이점을 제공한다는 것을 알고 결정화 벤치 소위 OptiCrys는 생체 분자 결정화 실험의 온도 및 화학 조성의 완전 자동화된 결합 된 제어를 제공하기 위해 실험실에서 설계 및 개발되었다. OptiCrys에 의한 결정 성장의 최적화는 온도 침전성 농도 위상 다이어그램을 기반으로 합니다.핵화는 메타안정 영역 및 결정 성장 부근의 핵형성 영역에서 발생한 다음, 단백질 농도가 용액과 결정 사이의 열역학 평형을 나타내는 용해도 곡선에 도달할 때까지 위상 다이어그램 후 메타스터블 영역에서 일어난다. 직접 용해도를 가진 단백질의 경우 온도를 감소시킴으로써 또는 염질 아웃에 도달하는 경우 침전제 농도를 증가시킴으로써, 결정화 용액은 메타스터마귀 영역에 남아 핵화가 발생하지 않는다. 결정은 제 2 크리스탈 용액 평형이 달성 될 때까지 성장하고 그 후, 결정의 크기가 더 이상 증가관찰되지 않습니다.온도를 낮추거나 침전 농도를 증가시키는 것은 결정이 원하는 크기에 도달할 때까지 여러 번 반복된다. 온도 조절 된 흐르는 설정의 투석 챔버에 단백질 용액을 추가하고 투석 막을 통해 챔버를 덮고 탄성 또는 고리로 멤브레인을 고정하십시오. 상공 챔버를 뒤집어 투석 실 위에 놓습니다.두 조각 사이에 갇힌 모든 공기를 부드럽게 천천히 누르고, 오버 챔버 위에 부드럽게 나사로 고정하여 제자리에 있는 저장소를 고정합니다. 결정화 용액을 저수지 챔버에 추가하고 밀폐 캡으로 덮습니다. 이 어셈블리를 전송하고 결정화 벤치 OptiCrys 크리스탈 성장의 유방 지원에 삽입 결정 벤치 OptiCrys의 감독 소프트웨어입니다.여기에는 네 가지 그래픽 인터페이스 또는 뷰가 포함됩니다. 홈 뷰에는 다른 뷰로 이동할 수 있는 버튼이 포함되어 있습니다. 설치 인터페이스의 목적은 테스트 보기에서 자동으로 실행할 수 있는 실험 시나리오를 정의하는 것입니다.마지막 뷰는 유지 관리 보기입니다. 실험을 다시 시작하려면 결정화 실험을 원활하게 실행하기 위한 모든 필수 매개 변수가 발견되는 유지 보수 뷰를 열어야 합니다. 라이트 섹션에서 광도를 높이고 빛은 0에서 100 최대 밝기로 빛을 증가 시킬 수 있습니다.온도를 제어하고 모니터링하기 위해 온도 조절 구역이 사용됩니다. 버튼을 클릭하여 켭니다. 세트 점 섹션의 온도를 설정하고 enter기 누릅니다.이 단추 아래에는 두 개의 그래프가 있습니다. 빨간색 은 최종, 주문 온도 및 노란색 그래프가 현재 온도를 표시합니다. 스톡 용액을 혼합하여 결정화 용액을 저수지 챔버에 주입하여 팜 섹션에 의해 제어됩니다.첫 번째 단계에서 스톡 솔루션의 농도를 추가합니다. 그런 다음 각 새 그루퍼 솔루션의 최종 농도를 찾아 최종 농도 섹션에 추가합니다. 계산 버튼을 누른 후, 재고 솔루션의 볼륨이 계산되고 각 농도 패널 앞의 볼륨 패널에 추가됩니다.출시 준비 버튼을 누르고 새로운 프리미어 솔루션이 준비될 때까지 기다립니다. 결정화 솔루션 교환을 보려면 솔루션 입력 버튼을 클릭합니다. 프로세스를 중지하기 위해 배포 중지 버튼을 누릅니다.현미경 섹션의 오른쪽에는 각 결정 성장 실험에서 중요한 정보를 기록하기위한 여러 패널이 있습니다. 이 섹션에 해당 단백질 이름, 분자량 및 결정화 상태를 추가합니다. 단순히 폴더 이름에 입력하여 실험의 이름을 정의합니다.nb 이미지 섹션에서 실험 중에 수행해야 하는 이미지 수를 선택합니다. 이미지 의 수를 추가하고 오른쪽에있는 패널에서 타이머 규모를 선택합니다. 폴더 버튼을 클릭하여 폴더를 엽니다.이 폴더에는 실험에 대해 이전에 정의한 모든 정보가 포함된 텍스트 파일이 있습니다. 추가 처리를 위한 준비된 이미지도 이 폴더에 저장됩니다. 현미경을 확대하면 자동으로 달라질 수도 있습니다.현미경 섹션 위에 있는 플러스 및 마이너스 버튼을 사용하여 확대/축소를 변경하여 배율을 각각 늘리거나 줄입니다. 결정 크기를 측정하는 방법에는 세 가지가 있습니다. 길이 또는 너비를 측정하기 위해 너비 벡터를 사용합니다.결정 형상에 따라 현미경 섹션의 왼쪽 부분에서 특정 도구를 선택할 수 있습니다. 직사각형 또는 다각형과 같은. 값이 측정값 섹션에 나타납니다.실험의 첫 번째 세트에서, 미세 투석 버튼은 다른 염 농도와 결정화 솔루션에 침지되었다. 이 간단한 결정화 그리드 실험에서 유일한 변수는 침전성 농도입니다. 온도가 일정하게 유지되는 동안.염 농도의 약간의 변화는 염 농도를 0.7에서 1.2까지 증가시켜 결정화 위상 다이어그램을 조사할 수 있게 해주며 핵형성 영역내의 용액이 메타안정 구역에서 멀어지고 있다. 따라서 결정수가 증가하고 크기가 감소하면서 결정의 크기와 수의 변화가 관찰됩니다. 주어진 실험 조건 하에서 OptiCrys를 가진 첫 번째 실험에서, 투석 챔버의 평형이 도달하면, 결정화 용액은 결정화 상 다이어그램의 메타안정 영역 부근의 핵형성 영역에 있다.그 결과, 실험의 첫 번째 단계에서 는 몇 가지 핵만 생성된다. 메타안정 영역에서 결정의 성장을 유지하고 결정 성장 과정을 제어하기 위해, 온도는 다른 시간 간격으로 변경되었다. 결정용액 평형이 완성될 때마다 온도가 다양했다.따라서 온도는 291 켈빈, 288 켈빈과 마지막으로 275 켈빈으로 감소하여 메타스터블 영역에서 선택한 결정의 성장을 유지했습니다. 이 실험의 결과는 천연 거대 분자 결정예 촬영에 필요한 부피와 함께 단일 큰 결정입니다. 다음 두 가지 실험은 핵 형성, 결정 성장, 용해 및 재성장을 위한 온도 조절 투석 실험의 가역성을 보여줍니다.OptiCrys를 통한 두 번째 실험에서 결정화 용액의 화학 조성물은 실험을 통해 일정하게 유지되었고 온도가 다양하였다. 초기 온도는 291 켈빈으로 설정되었습니다. 높은 과포화 로 인해 결정화 챔버에 많은 수의 작은 결정이 나타났습니다.직접 단백질 용해도의 개념에 따라, 점차적으로 온도를 313 켈빈으로 증가시킴으로써 모든 결정이 용해되었다. 마지막으로, 온도를 295켈빈으로 낮추어, 두 번째 핵은 메타안정 영역 부근에서 시작하여 핵형성 과정을 조절하여 핵의 수가 적어지는 것을 허용했다. 추가 결정 성장은 더 큰 결정의 균일 한 인구를 생성 할 수 있었습니다.본 실험에서, 일정한 온도에서 결정화 용액의 화학 조성을 변경하면 더 큰 결정의 균일한 집단을 얻을 수 있다. 결정화 조건은 이전 실험과 유사하였다. 낙정을 용해시키는 것은 NaCl 농도를 0.9 어금니에서 0으로 점진적으로 낮추어 달성되었다.염 농도를 줄이면 결정의 용해로 이어지는 위상 다이어그램의 저포화 영역에서 용액을 유지합니다. 그런 다음 이전보다 이온 강도가 낮은 새로운 결정화 용액이 저수지 챔버에 주입되었다. 이 침전 농도에서 낮은 수의 결정이 나타나고 결정이 이전보다 더 큰 부피에 도달합니다.여기에서 는 실험실에서 개발된 완전 자동화 된 계측기를 사용하여 천연 거대 분자 결정학을위한 크고 고품질의 결정을 성장시키는 제어 소프트웨어를 시료 준비 및 조정하는 상세한 프로토콜을 제공했습니다. 이러한 단계별 절차는 핵형성과 결정성장을 분리하기 위해 결정화 상 다이어그램에 대한 지식으로부터 설계및 이점을 얻었다. 또한, OptiCrys를 사용할 수 없을 때 대안으로 거시성 식증 버튼을 사용하여 미세 세포증 패턴을 가진 커징 크리스탈을 위한 프로토콜도 제시됩니다.OptiCrys에 대해 언급한 전략 외에도 결정화 용액및 온도의 화학 적 조성을 변경하고 이미지를 촬영하는 것은 수동으로 수행해야합니다. 인큐베이터에 대한 열 조절 진동을 사용하여 온도를 일정하게 유지해야 하며, 이는 방법론에서 중요한 단계입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

연구

생물학

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...