Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS anerkjenner støtten fra LABEX VALO GRAL under kontrakten 2015. NJ anerkjenner CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. Forfattere anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Program under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. Forfatterne er også takknemlige til Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) og Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) for nyttige samtaler og innsikt. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Ulike fysiske, kjemiske og biologiske variabler påvirker proteinkrystallisering ved å påvirke proteinløselighet21. Blant disse variablene brukes temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsningen her i kombinasjon med dialyseteknikk for å forbedre og vokse store krystaller av høy kvalitet av biomacromolecules for nøytrondiffraksjonsstudier. Ved å bruke kunnskap om fasediagrammer, er krystallisering gjort mer forutsigbar. Selv om screening av ulike krystalliseringsforhold i en seriell tilnærming også er mulig, er hovedmålet med å bruke de rasjonelle tilnærmingene som presenteres å skille og kontrollere kinetikken til krystallkjerner og vekst.
I likhet med alle krystalliseringsstudier øker rene og homogene proteinprøver av høy kvalitet og støvfrie krystalliseringsløsninger suksessraten for eksperimentet. Filtrering og sentrifugering av løsninger er viktige trinn i de beskrevne protokollene. Å kjenne de fysikalske egenskapene til proteinene studert som molekylvekt (for å velge riktig dialysemembran), isoelektrisk punkt, og proteinløselighet er avgjørende for utformingen av et optimalt krystallveksteksperiment. Det må også vurderes for proteinstabilitet ved forskjellige temperaturer eller med forskjellige kjemikalier for å forhindre prøvetap og øke sannsynligheten for suksess. Med tanke på temperaturområdet til OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K), kan et bredt spekter av proteiner krystalliseres ved hjelp av det. Men det er verdt å understreke at proteiner som primært er termo-stabile, som proteiner fra termofile kilder, vil ha mest nytte i temperaturkontrollerte krystallveksteksperimenter som tilbys av dette instrumentet.
Ved hjelp av et dialysekammer med lavt volum (ved bruk av OptiCrys) eller mikroanalyseknapper og screening av flere temperaturer og krystalliseringsforhold (f.eks. rutenett av bunnkonsentrasjon eller pH), er det mulig å få informasjon om plasseringen av grensen for den metastable sonen (kinetisk likevekt mellom kjerner og meterbare soner). Dette er uvurderlig når du utformer et vellykket krystallveksteksperiment, spesielt for nye proteinkandidater i krystallisering. Uten denne informasjonen kan eksperimenter starte fra et område av fasediagrammet med høy supermetning, for langt fra grensen for metastable sonen for å enkelt kontrollere krystallkjerner. Selv om oppløsning av proteinutløsning kan forsøkes, for eksempel ved å øke temperaturen i tilfelle direkte løselighet, for proteiner med redusert termobilitet, kan det å holde prøven ved høy temperatur i lengre tid gjøre proteinnedbøren irreversibel. Dermed består den beste strategien av å bruke en innledende tilstand med lavere supermetning som ligger nær grensen for metabilitet, hvor kjerner kan kontrolleres og proteinnedbør unngås. I tråd med dette reduserer krystalliseringsprescreening sjansen for å ha et proteinutfelling i dialysekammeret og øker suksessraten for eksperimentet.
Etter å ha designet et eksperiment, er det et annet viktig skritt å forberede dialysekamre (OptiCrys) eller mikrodialyseknapper. Forebygging av luftbobledannelse i dialysekammeret/knappen øker sjansen for vellykket krystallisering, spesielt når små volumer brukes. Tilstedeværelsen av luftbobler i dialysekammeret kan også endre kinetikken i krystalliseringsprosessen og redusere reproduserbarheten av eksperimentet (fordi protein/løsningskontaktoverflaten er endret). Ikke bare protein, men også krystalliseringsløsning kan påvirke eksperimentets suksess. Ved hjelp av nye 50 ml rør for pumpesystemet hver gang man ønsker å starte et nytt eksperiment og vaskerør etter hvert eksperiment reduserer sjansen for forurensning og unngår etablering av saltkrystaller i apparatet.
Bruk av mikroanalyseknapper er et alternativ når OptiCrys ikke er tilgjengelig. Strategiene for å optimalisere krystallisering og overvåking av krystallvekst nevnt ovenfor, må utføres manuelt. Vanligvis nødvendiggjør dette å være utenfor en termoregulert inkubator, noe som kan være problematisk når temperaturregulering er et kritisk skritt i metodikken som er beskrevet. Dette forenkler ikke endring av krystalliseringsløsningenes kjemiske sammensetning, eller overvåking av krystallvekst ved avbildning, slik at krystallvekstprosessen ikke kan kontrolleres i sanntid.
Kunnskap om fasediagrammet er grunnlaget for å bruke krystalliseringsbenken, OptiCrys, til systematisk å vokse store krystaller av høy kvalitet på en automatisert måte. Kontroll av fysikalske parametere som temperatur, bunnkonsentrasjon og pH under krystallisering beveger proteinløsningslikevekten i en veldefinert kinetisk bane over fasediagrammet. Dette suppleres ved bruk av dialysemembran for å justere massetransport og skape en kontrollert gradient i krystalliseringskammeret som påvirker krystallenes størrelse og kvalitet. Derfor er bruk av både termodynamiske data og kinetiske baner avgjørende for å kontrollere krystalliseringsprosessen for å vokse krystaller av høy kvalitet. Takket være OptiCrys kan systematiske fasediagrammer i et flerdimensjonalt rom studeres med en seriell tilnærming ved hjelp av betydelig mindre materiale enn før. For å demonstrere denne metodikken gir vi her en case-studie med et modellprotein, kyllingegg-hvitt lysozyme. Ved å bruke og mestre protokollen som presenteres her kan man tilpasse den for ekte proteinsystemer5,14,17,18.

Å forstå strukturfunksjonsforholdet mellom proteiner og mekanismen for fysiologiske veier er ofte avhengig av å kjenne posisjonene til hydrogenatomer (H) og hvordan ladning overføres i et protein1,2. Siden hydrogenatomer sprer røntgenstråler svakt, kan deres posisjoner bare bestemmes med svært høyoppløselige røntgendiffraksjonsdata (> 1 Å)3,4. Omvendt kan nøytronkrystallografi brukes til å oppnå en nøyaktig posisjon av hydrogenatomer i biologiske makromolekyler som hydrogen og deuterium (H2, isotop av hydrogen) atomer har spredningslengder av omtrent like stor størrelse som oksygen, nitrogen og karbon5. Nøytronfluks fra tilgjengelige nøytronkilder er imidlertid svakere enn for røntgenstråler, så dette må ofte kompenseres for2,3. Dette kan oppnås ved å utveksle H med H2 og/eller øke volumet av krystaller for å redusere usammenhengende spredning av hydrogener og øke signal-til-støy-forholdet mellom diffraksjonsbilder.
Det finnes ulike krystalliseringsmetoder (det tilsvarende skjematiske fasediagrammet er vist i figur 1) for å oppnå store krystaller av høy kvalitet for både røntgen- og nøytronbiomakromolekylær krystallografi6. I dampdiffusjon er en dråpe tilberedt fra en blanding av et protein og en krystalliseringsløsning likevekt over tid, gjennom fordampning av vann eller andre flyktige arter, mot et reservoar som inneholder en høyere konsentrasjon av precipitant av samme krystalliseringsløsning. Økningen i konsentrasjonen av protein og bunnfall i dråpet fører til supermetning som kreves for spontan kjerne etterfulgt av krystallvekst ved disse kjernene6,7. Selv om dampdiffusjon er den mest brukte teknikken for dyrking avkrystaller 4, kan krystalliseringsprosessen ikke kontrolleres nøyaktig8. I den frie grensesnittdiffusjonsmetoden sprer krystalliseringsløsningen seg inn i en konsentrert proteinløsning, og retter systemet sakte mot supermetning. Denne metoden kan betraktes som en satsvis metode med en langsom blandehastighet6,9,10,11,12. I batchmetoden blandes proteinet raskt med en krystalliseringsløsning som fører til rask supermetning og i sin tur jevn kjerner med mangekrystaller 3,7. Denne metoden står for omtrent en tredjedel av alle strukturer som for tiden er deponert i Protein Data Bank. Dialysemetoden brukes også til å dyrke høykvalitets og velfnærende proteinkrystaller. I dialysemetoden diffuserer molekyler av bunndeig fra et reservoar gjennom en halvgjennomtrengelig membran inn i et eget kammer med proteinoppløsningen. Kinetikken av likevekt er avhengig av ulike faktorer, for eksempel temperatur, membran porestørrelse, og volumet og konsentrasjonen av proteinprøver og krystalliseringsmidler6.
Krystalliseringsfasediagrammer kan brukes til å beskrive forskjellige tilstander av et protein som en funksjon av forskjellig fysisk eller kjemisk variabel3. Som illustrert i figur 1kan hver krystalliseringsteknikk visualiseres som å bruke en annen kinetisk bane for å nå kjerne- og metastable sonene i et slikt diagram6,10,13. Dette gir informasjon om proteinløselighet og proteinkonsentrasjonen der en termodynamisk likevekt mellom krystall og løsning observeres, og dermed finner de optimale forholdene for kjerneringog vekst 3,14. I et todimensjonalt fasediagram plottes proteinkonsentrasjonen som en funksjon av en variabel, og de andre variablene holdes konstant15. I et slikt fasediagram, når proteinkonsentrasjonen er under løselighetskurven, er løsningen i den undermeterte regionen og ingen kjerner eller krystallvekst oppstår. Over denne kurven er supermetningssonen der proteinkonsentrasjonen er høyere enn løselighetsgrensen3,14. Dette er videre delt inn i tre regioner: metasonen, den spontane kjernesonen og nedbørssonen. I metastable sonen er supermetning ikke tilstrekkelig for at kjerner skal skje innen rimelig tid, men veksten av seedede krystaller kan finne sted. Aggregering og nedbør favoriseres i nedbørssonen, hvor supermetning er for høy14,15.
Når tilstrekkelig overmetning for spontan kjerner oppnås, vil de første kjernene vises10. Veksten av krystaller fører til en reduksjon i proteinkonsentrasjonen til grensen for løselighet er nådd. Så lenge overmetningen forblir i nærheten av løselighetskurven, vil det ikke være noen signifikant endring i krystallstørrelsen. Det har imidlertid vist seg at variasjoner i temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsning (for eksempel konsentrasjonen av stupbrakt) vil påvirke proteinløselighet og kan føre til initiering av ytterligere krystallvekst8,13,16.
Som dialyse er en fordel for god kvalitet krystallvekst, OptiCrys krystallisering benken illustrert i figur 2, ble designet og utviklet i vårt laboratorium for å kontrollere krystallisering på en helautomatiskmåte 8. For dette formålet ble programvare skrevet med LabVIEW som tillater kontroll og overvåking av temperaturen på et flytende reservoardialyseoppsett i kontakt med Peltier-elementer, via en elektronisk kontroller og en kjøler. Den samme programvaren regulerer også automatisk den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen (for eksempel utveksling av krystalliseringsmidler) ved hjelp av et flerkanals fluidisk system. I tillegg brukes et digitalt kamera og et omvendt mikroskop til å visualisere og registrere krystalliseringsprosessen. To krystalliseringskamre med 15 μL og 250 μL volumer er tilgjengelige for dyrking av krystaller til forskjellige formål. Siden krystalliseringsprosessen er reversibel, er screening for ulike forhold mulig med bare noen få mikroliter av proteinløsningen så lenge prøven ikke er skadet8. Som et resultat minimerer bruk av denne metoden mengden proteinmateriale som brukes.
Fra tidligere arbeid8er det tydelig at under krystallvekstprosessen må in situ-observasjoner utføres med jevne mellomrom. Disse kan variere fra noen få sekunder til flere dager, avhengig av hendelsen under observasjon (nedbør, kjerner eller krystallvekst).
Optimaliseringen av krystallvekst med OptiCrys er basert på temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammer. Ved proteiner med løselighet som en direkte funksjon av temperatur, er det mulig å gjøre bruk av saltingsregimet18. Det er her å øke den ioniske styrken av løsningen, som kan visualiseres ved hjelp av protein-stupbrapende fasediagrammer, reduserer oppløseligheten av proteinet. På samme måte kan proteiner med invers løselighet gjøre bruk av saltingsregimet18. Nucleation forekommer i kjernesonen, i nærheten av den metastable sonen, og krystallvekst finner deretter sted i den metastable sonen i fasediagrammet til proteinkonsentrasjonen når løselighetsgrensen. Som vist i figur 3A, med konstant kjemisk sammensetningstemperatur kan reduseres for å holde krystalliseringsløsningen i metastable sonen for å forhindre ny kjerne. Krystaller vokser til den andre krystall / løsning likevekt oppnås, og etter det observeres ingen ytterligere økning i størrelsen på krystaller. Temperaturen reduseres flere ganger til krystallene når ønsket størrelse. I figur 3B, ved konstant temperatur, holder den utløsende konsentrasjonen løsningen i metasonen. Denne prosessen kan deretter gjentas flere ganger for å oppnå store krystaller. Endre temperaturen og manipulere krystallisering løsning forhold, ved å kontrollere supermetning nivåer, er to kraftige verktøy for å skille kjerner og vekst av krystaller som styres nøyaktig og automatisk av OptiCrys5,8,14.
Eksempler på proteinkrystaller dyrket av temperaturkontrollerte, eller temperatur- og bunnkonsentrasjonskontrollert krystallisering, samt relative diffraksjonsdata innhentet er tilgjengelige i litteraturen og PDB. Blant dem er menneskelig γ-krystallin E, PA-IIL lectin, gjær uorganisk pyrofosfatase, uratoksidase, human karbonsyreanhydrase II, YchB kinase, og laktat dehydrogenase5,14,17,18.
Selv om OptiCrys ble kommersialisert av NatX-ray, er det mange laboratorier som ikke har tilgang til dette instrumentet eller til den serielle tilnærmingen det tilbyr. Alternativet til denne teknikken er å bruke kommersielt tilgjengelige plastmikroanalyseknapper med ulike volumer. Ved hjelp av disse kan temperatur og kjemisk sammensetning justeres og varieres manuelt. Inspeksjon av mikrodialyseknapper kan ikke gjøres in situ og må i stedet gjøres manuelt med et optisk mikroskop. Temperaturkontroll kan oppnås ved å holde prøven i en vibrasjonsfri temperaturkontrollert inkubator. Det er viktig å holde temperaturen konstant for å sikre at krystalliseringseksperimenter er reproduserbare. Betydelig temperaturvariasjon kan også føre til skade eller ødeleggelse av krystaller5.
Her gir vi en detaljert protokoll som beskriver prøveforberedelse og bruk av kontrollprogramvare for vekst av store krystaller av høy kvalitet egnet for nøytronproteinkrystallografi. Denne trinnvise prosedyren ble utformet for å dra nytte av krystalliseringsfasediagrammet for å velge en startposisjon og kinetisk bane for å kontrollere størrelsen og kvaliteten på krystallene som genereres. I tillegg presenteres en detaljert protokoll for voksende krystaller med mikroanalyseknapper som bruker samme begrunnelse for å oppnå store krystaller av høy kvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Bruken av nøytron makromolekylær krystallografi (NMX) ekspanderer raskt med de fleste strukturer bestemt i det siste tiåret takket være nye NMX strålelinjer har blitt bygget og økt tilgjengelighet av struktur raffinement programvare. Nøytronkildene som for tiden er tilgjengelige for NMX, er imidlertid betydelig svakere enn tilsvarende kilder for røntgenkrystallografi. Til tross for fremskritt på dette feltet, vil betydelig større krystaller alltid være nødvendig for nøytrondiffraksjonsstudier, spesielt med tendens til å studere stadig større makromolekyler og komplekser. Ytterligere forbedringer i metoder og instrumentering egnet til å vokse større krystaller er derfor nødvendig for bruk av NMX å utvide.
I dette arbeidet introduserer vi rasjonelle strategier og en krystallvekstbenk (OptiCrys) utviklet i laboratoriet vårt som kombinerer sanntidsobservasjon gjennom et mikroskopmontert videokamera med presis automatisert kontroll av krystalliseringsløsninger (f.eks. stupbrakt konsentrasjon, pH, additiv, temperatur). Vi viser deretter hvordan denne kontrollen av temperatur og kjemisk sammensetning letter søket etter optimale krystalliseringsforhold ved hjelp av modellløselige proteiner. Grundig kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet er avgjørende for å velge startposisjon og kinetisk bane for ethvert krystalliseringseksperiment. Vi viser hvordan en rasjonell tilnærming kan kontrollere størrelsen og antall krystaller generert basert på kunnskap om flerdimensjonale fasediagrammer.

I seksjon 2.3 og 2.4 presenteres tre eksempler på optimalisert krystallvekst, som viser bruk av instrumentet og en eksperimentell design for dyrking av store krystaller. For denne demonstrasjonen har vi brukt lysozym som modellprotein, selv om krystallveksteksperimenter har blitt utført med mange andre proteinsystemer ved hjelp av denne metoden (se ovenfor). Ved å bruke og mestre protokollen som presenteres her, kan man tilpasse den til andre proteinkandidater.
I pkt. 2.3 viste vi at etablerte rasjonelle krystalliseringsstrategier kunne være gunstige for voksende krystaller med tilstrekkelig spredning av volumer for nøytronproteinkrystallografi. Her viser vi at de rasjonelle optimaliseringsstrategiene som foreslås, også tillater generering av en ensartet befolkning av krystaller av hvilken som helst bestemt størrelse som kreves for nedstrøms strukturbestemmelsesmetoder.
Disse to eksperimentene er utformet for å understreke viktigheten av fasediagrammer for å kontrollere krystallkryklering og vekst. Her brukes kontroll av temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsninger i kombinasjon med overvåking av krystalliseringsprosessen i sanntid til å studere det kvalitative fasediagrammet. Ved hjelp av denne metoden kan kjerne- og krystallvekst rasjonelt optimaliseres på en reversibel måte. Bruk av en slik seriell tilnærming reduserer også mengden protein og tiden som kreves for å kontrollere krystallenes størrelse og kvalitet.
I dialysemetoden skilles en proteinløsning fra en krystalliseringsløsning med en halvgjennomtrengelig membran6 (figur 5). Denne dialysemembranen gjør at små molekyler som tilsetningsstoffer, buffer og ioner kan passere gjennom membranen, men ikke makromolekyler somproteiner 6,20. Denne funksjonen gjør at krystalliseringsløsningen kan endres i løpet av eksperimentet6. Utveksling av løsningen kan gjøres manuelt, for eksempel i mikrodialyseknapper, eller på en automatisert måte ved hjelp av et instrument utviklet for dette formålet, OptiCrys8.
I det første settet med eksperimenter ble mikrodialyseknapper brukt til krystallisering av kyllingegg-hvitt lysozym. Mikroanalyseknapper ble nedsenket i krystalliseringsløsninger med forskjellige saltkonsentrasjoner. I dette enkle krystalliseringsrutenettet er den eneste variabelen bunnkonsentrasjon mens temperaturen holdes konstant (293 K). Som vist i figur 4, små variasjoner i saltkonsentrasjonen indusere en endring i størrelsen og antall krystaller observert, slik at undersøkelse av krystalliseringfasediagrammet. I figur 4, panel 1 inneholder krystalliseringsløsningen 0,7 M NaCl og et begrenset antall større krystaller har dukket opp i knappene. Ved å øke saltkonsentrasjonen fra 0,7 til 1,2 M øker supermetningen og løsningen i kjernesonen beveger seg bort fra metasonen (figur 4, panel 1 til 6). Som et resultat øker antall krystaller og størrelsen reduseres.
I det første eksperimentet med et helautomatisk instrument som muliggjør temperaturkontrollert dialysekrystallisering, OptiCrys (figur 9),ble krystallveksteksperimentet skreddersydd for å generere stor krystallvekst. Eksperimentet ble lansert ved en innledende temperatur på 295 K med en krystalliseringsløsning som inneholder 0,75 M NaCl og 0,1 M Na acetatbuffer pH 4. Under disse eksperimentelle forholdene nådde krystalliseringsløsningen kjernesonen i nærheten av den metastable sonen i fasediagrammet (figur 9, pil 1). Som et resultat ble bare noen få kjerner generert i løpet av den første fasen av eksperimentet. For å vokse utvalgte krystaller ytterligere (vist i figur 9)ble arbeidsflyten for krystallvekstoptimalisering drevet mot den metastable sonen med varierende temperatur så snart krystallløsningslikevekten ble nådd.
Hver gang likevekt mellom krystall og løsning ble nådd, ble temperaturen senket, først til 291 K, deretter til 288 K og til slutt til 275 K, for å holde krystalliseringsløsningen i metasonesonen. Resultatet av dette eksperimentet er en enkelt stor krystall egnet for både makromolekylær røntgen og nøytronkrystallografi.
For de fleste proteiner er det nøyaktige kvantitative fasediagrammet (eller bare et kvalitativt diagram) ennå ikke oppnådd på grunn av mangel på eksperimentelle enheter som er i stand til å måle proteinkonsentrasjonen (eller bare for å observere / oppdage krystalliseringsprosessen i sanntid) under krystalliseringseksperimenter18. Som et resultat er det ofte ikke mulig å designe eksperimentet på en slik måte at krystallisering begynner i det optimale området av fasediagrammet, i nærheten av metasonen.
Derfor må en krystalliseringsoptimaliseringsstudie finne sted før eksperimentet dedikert til veksten av en stor volumkrystall utføres. I denne studien, ved hjelp av temperaturvariasjoner (ved konstant kjemisk sammensetning) på den ene siden og variasjoner i kjemisk sammensetning (ved konstant temperatur) på den annen side, er nødvendig for å identifisere metastable sonen og for å avgrense de optimale forholdene for å starte et stort krystallveksteksperiment.
For dette formål presenteres to andre eksperimenter som var skreddersydd for å demonstrere reversibilitetet til de temperaturkontrollerte dialysekrystalliseringseksperimentene med OptiCrys for kjernering, krystallvekst, oppløsning og revekst. Arbeidsflyten for krystallvekstoptimalisering ble kontrollert slik at en jevn befolkning på færre, større lysozymkrystaller ble dyrket ved hjelp av variasjon av temperatur eller bunnkonsentrasjon.
I det andre eksperimentet med OptiCrys ble den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen holdt konstant gjennom hele eksperimentet (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Den opprinnelige temperaturen ble satt til 291 K. Resultatene av dette eksperimentet er oppsummert i figur 10. På grunn av høy overmetning dukket et stort antall små krystaller opp i krystalliseringskammeret (figur 10, paneler 1 og 2). I samsvar med begrepet direkte proteinløselighet, ved gradvis å øke temperaturen til 313 K, ble alle krystallene oppløst (figur 10, paneler 3, 4 og 5). Til slutt, ved å senke temperaturen til 295 K, ble den andre kjernen initiert i nærheten av metasonen og tillot kontrollert dannelse av et lavere antall kjerner. Ytterligere krystallvekst resulterte i ensartet generasjon av en befolkning av større krystaller (Figur 10, panel 7).
Som vist i figur 11kan variasjon av krystalliseringsløsningens kjemiske sammensetning ved en konstant temperatur på 291 K også brukes til å oppnå en jevn populasjon av større krystaller. I likhet med det forrige eksperimentet var den første tilstanden 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-konsentrasjonen ble deretter senket gradvis fra 0,9 M til null for å oppløse krystallene (figur 11, panel 4 og 5). På dette tidspunktet ble NaCl fullstendig erstattet av en bufferløsning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Reduksjon av saltkonsentrasjonen holder løsningen i den undermetettede sonen i fasediagrammet, noe som fører til oppløsning av krystallene. Deretter ble en ny krystalliseringsløsning med lavere ionisk styrke, på 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4, injisert i reservoarkammeret. Ved denne bunnkonsentrasjonen dukket den første kjernene opp (figur 11, panel 6) etter 90 minutter. Antallet genererte krystaller var lavere og krystallene når et større volum (Figur 11, panel 7) enn før.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figur 1: Skjematisk fasediagram. Kinetiske baner for tre krystalliseringsteknikker er representert i et saltingsregime. Hver metode oppnår kjernering og krystallisering annerledes, visualisert av en annen kinetisk vei gjennom fasediagrammet for å nå kjerne- og metastable sonene. Løselighetskurven skiller undermetning og supermetningsområder. Supermetning er delt inn i tre soner: metastable, kjerner og nedbør. I kjernesonen oppstår spontan kjerner mens i metasonen krystallvekst finner sted. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk representasjon av krystalliseringsbenken (OptiCrys). LED-lyskilden er plassert på toppen av den temperaturkontrollerte dialysestrømningscellen. Et invertert mikroskop og digitalkameraet vises øverst til høyre på bildet med den røde pilen. Den røde sirkelen representerer plasseringen av kjølerslangen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figur 3: Skjematisk todimensjonal proteinkrystalliseringsfasediagram som en funksjon av temperatur (A) og bunnkonsentrasjon (B). (A) Ved protein med direkte løselighet holder temperaturen krystalliseringsløsningen i metasone. Temperaturvariasjon kan gjentas flere ganger for å kontrollere krystallvekstprosessen til krystaller med ønsket volum oppnås. (B) Endring av konsentrasjonen av den utløsende oppløsningen kan også brukes til å holde krystalliseringsløsningen i metasonen for voksende krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figur 4: Krystaller av lysozym oppnådd ved hjelp av dialysemetoden. Dette eksperimentet ble utført ved en konstant temperatur på 293 K i 0,1 M natriumacetatbuffer pH 4. Økende NaCl-konsentrasjon fra 0,7 M til 1,2 M øker kjernehastigheten og resulterer i et større antall krystaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figur 5: Oversikt over proteinkrystalliseringsprosessen ved dialysemetoden. (A) Ved å legge proteinet til kammeret på dialyseknappen, (B) opprettes en kuppelform på toppen av kammeret. (C) En applikator brukes til å overføre O-ringen til sporet på dialyseknappen for å fikse dialysemembranen på plass. (D) Dialyseknappen er klar for nedsenking i reservoarløsningen. (E) Krystalliseringsløsning passerer gjennom den halvgjennomtrengelige membranen og krystaller begynner å danne seg inne i kammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figur 6: Skjematisk visning av det temperaturkontrollerte flytende dialyseoppsettet. (A) Proteinprøven tilsettes dialysekammeret. (B) Dialysemembranen festes på overkammeret med en O-ring ved hjelp av en applikator. (C) Overkammeret dreies og festes på toppen av dialysekammeret. Hvite piler indikerer hvor skruene er plassert på overkammeret. (D) Reservoarkammeret dreies med klokken (E) og festes oppå overkammeret. (F) Reservoarkammeret er dekket av en lufttett hette med kontakter til et pumpesystem, og (G) strømningscellen er plassert i messingstøtten. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figur 7: Tilberedning og injeksjon av krystalliseringsløsningen i reservoaret av det fluidiske systemet (A). Rør som inneholder salt og vann er koblet til trykk-/vakuumregulatoren (B) og til dreieventilen (C). Ved å bruke trykket skaper trykk-/vakuumregulatoren en konstant strøm av væskene fra rørene til dreieventilen. Hver væske som passerer gjennom strømningsmåleren (D) og bryteren injiseres i blanderøret (F). Når alle væskene er lagt til blanderøret, injiserer bryteren ved noen modifikasjoner den endelige løsningen fra blanderøret inn i reservoaret (G). Væsken strømmer gjennom systemet i retning av pilene i diagrammet merket i stigende rekkefølge (fra 1 til 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figur 8: Vedlikeholdsvisning av tilsynsprogramvaren. Denne visningen brukes til å kontrollere ulike parametere som temperatur, lys, krystalliseringsløsning og zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figur 9: Fasediagrammet som en funksjon av temperaturen (valgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). En enkelt stor lysozymkrystall oppnås ved systematisk å endre temperaturen fra 295 K til 275 K. I hvert trinn stoppes krystallveksten ved å nå løselighetskurven. Redusere temperaturen ved å holde løsningen i metastable sonen starter krystallvekst. Bildene har forskjellige nivåer av forstørrelse. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">figuren.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figur 10: Optimalisering av krystallvekst ved konstant kjemisk sammensetning ved hjelp av temperaturkontroll (utvalgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). Starter kjerneprosessen i kjernesonen ved 291 K, langt fra metasonen, resulterer i dannelsen av mange krystaller. Øke temperaturen til 313 K deretter oppløses krystallene til ingen synlige kjerner er sett i dialysekammeret. Til slutt, redusere temperaturen til 295 K starter kjerneprosessen for andre gang fører til et begrenset antall større krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">figuren.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figur 11: Optimalisering av krystallvekst ved konstant temperatur ved hjelp av variasjoner i bunnkonsentrasjon (utvalgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). Hvis du reduserer bunnkonsentrasjonen fra 0,9 M til 0 M oppløses krystallene som oppnås under den første nucleasjonshendelsen. Krystalliseringsprosessen startes på nytt ved injeksjon av samme stup, men ved lavere ionisk styrke, 0,75 M, noe som fører til dannelsen av noen større krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Strukturelle studier av biomacromolecules av krystallografi krever krystaller av høy kvalitet. Her demonstrerer vi en protokoll som kan brukes av OptiCrys (et helautomatisk instrument utviklet i laboratoriet vårt) og/eller mikroanalyseknapper for dyrking av store krystaller av høy kvalitet basert på kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet.

Optimalisering av krystallvekst for nøytron makromolekylær krystallografi

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Det finnes forskjellige krystalliseringstilnærminger for å oppnå store krystaller av høy kvalitet for både røntgen- og nøytronkrystallografi. En av disse tilnærmingene bruker dialysemetode. I denne teknikken skilles proteinoppløsningen fra en precipitantløsning av en halvgjennomtrengelig membran.De stupbrat molekylene sprer seg over membranen inn i proteinkammeret. Når riktig overmetning for en spontan kjerne oppnås, vises de første kjernene. Her vil vi demonstrere en protokoll som kan brukes av OptiCrys et helautomatisk instrument utviklet i laboratoriet vårt som bruker temperaturkontrollert dialysekrystallisering, og våre mikrodialyseknapper for dyrking av store krystaller av høy kvalitet for naturlig makromolekylær krystallografi basert på kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet.For en mikrodialyseknapp med visse mikrolitervolumpipette 35 mikroliter lysozymløsning inn i dialysekammeret. Dette ekstra volumet skaper en litt kuppelform på toppen av dialysekammeret og forhindrer luftbobledannelse. Ta en applikator og plasser strikken eller ringen på ekstremiteten av den.Plasser membranen på toppen av kammeret og fest den ved å overføre strikken eller ringen fra applikatoren til sporet på dialyseknappen. Overfør knappen til brønnen som inneholder krystalliseringsløsningen. Dekk brønnen med et glassdeksel slip eller et stykke tape.Oppbevar prøven på 293 Kelvin i en vibrasjonsfri termisk regulator inkubator. Å vite at dialysekrystalliseringen gir fordeler fra krystallvekstens krystalliseringsbenk, ble den såkalte OptiCrys designet og utviklet i vårt laboratorium for å tilby en helautomatisk kombinert kontroll av temperatur og kjemisk sammensetning av det biomolekylære krystalliseringseksperimentet. Optimaliseringen av krystallveksten av OptiCrys er basert på temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammer.Nucleation forekommer i kjernesonen i nærheten av den metastable sonen og krystallvekst finner deretter sted i metastable sonen etter fasediagram, til proteinkonsentrasjonen når løselighetskurven som representerer termodynamisk likevekt mellom løsning og krystaller. Ved å redusere temperaturen i tilfelle proteinet med direkte løselighet eller ved å øke den stupbratkonsentrasjonen i tilfelle salting ut når, forblir krystalliseringsløsningen i metasonesonen og ingen kjerner oppstår. Krystaller vokser til den andre krystallløsningslikevekt oppnår, og etter det observeres ingen ytterligere økning i krystallstørrelsen.Å redusere temperaturen eller øke bunnkonsentrasjonen gjentas flere ganger til krystallene når ønsket størrelse. Tilsett proteinløsningen til dialysekammeret i det temperaturkontrollerte flytende settet, dekk over kammeret med dialysemembranen og fest membranen med elastisk eller ring. Vend over kammeret og legg det på toppen av dialysekammeret.Trykk den forsiktig og sakte for å fjerne all luften som er fanget mellom to stykker, fest reservoaret i sin posisjon ved å forsiktig skru den på toppen av overkammeret. Tilsett krystalliseringsløsningen i reservoarkammeret og dekk den med den lufttette hetten. Overfør denne monteringen og satt den inn i bryststøtten til krystalliseringsbenken OptiCrys Crystal vekst er en tilsynsprogramvare av Crystallization Bench OptiCrys.Den inneholder fire forskjellige grafiske grensesnitt eller visninger. Hjemmevisningen inneholder knapper for å navigere til de andre visningene. Formålet med installasjonsgrensesnittet er å definere et eksperimentscenario som kan kjøres automatisk i testvisningen.Den siste visningen er vedlikeholdsvisningen. For å starte et eksperiment på nytt må vedlikeholdsvisningen være åpen der alle de essensielle parametrene for jevn kjøring av krystalliseringseksperimentene blir funnet. Øk lysstyrken fra lysseksjonen, lyset kan øke fra null, ingen lys til 100 maksimal lysstyrke.For å kontrollere og overvåke temperaturen, brukes temperaturregulatordelen. Klikk på knappen for å slå den på. Still inn temperaturen på set point-delen, og trykk enter.Under denne knappen er det to grafer. Den røde viser finalen, bestillingstemperaturen og den gule grafen viser gjeldende temperatur. En injeksjon av krystalliseringsløsningen til reservoarkammeret blandes med en lagerløsning, og styres av Palm-delen.Tilsett konsentrasjonen av lagerløsningen i første fase. Finn deretter den endelige konsentrasjonen av hver ny grouperløsning og legg dem til den endelige konsentrasjonsdelen. Når du har trykket på beregn-knappen, vil det bli beregnet volum av lagerløsning og legges til i volumpanelet foran hvert konsentrasjonspanel.Trykk på startforberedelsesknappen og vent til den nye førsteklasses løsningen er klar. For utveksling av krystalliseringsløsningen, klikk på Løsningsoppføring-knappen. For å stoppe prosessen, trykk Stopp distribusjon-knappen.På høyre side av mikroskopseksjonen, Det er flere paneler for å registrere viktig informasjon fra hvert krystallveksteksperiment. Tilsett tilsvarende proteiner navn, molekylvekt og krystallisering tilstand i denne delen. Definer et navn for eksperimentene dine ved ganske enkelt å skrive det inn i mappenavnet.Fra nb bilder delen, velg antall bilder som skal tas under eksperimentet. Legg til nummeret på bildene, og velg tidtakerskalaen fra panelet til høyre. Klikk på mappeknappen for å åpne mappen.I denne mappen er det en tekstfil som inneholder all informasjonen du tidligere definerte for eksperimentet. Bilder som er klare for videre behandling, lagres også i denne mappen. Zoom av mikroskopet kan også varieres automatisk.Endrer zoomen ved hjelp av pluss- og minusknappen på toppen av mikroskopdelen for å øke eller redusere forstørrelsen henholdsvis. Det er tre forskjellige måter å måle krystallstørrelsen på. For måling av lengden eller bredden, bruk breddevektoren.Avhengig av krystallformen kan de spesifikke verktøyene fra venstre del av mikroskopseksjonen velges. For eksempel et rektangulært eller polygon. Verdiene vises i måldelen.I det første settet med eksperimenter ble mikrodialyseknapper nedsenket i krystalliseringsløsningene med forskjellige saltkonsentrasjoner. I dette enkle krystalliseringsruteruteeksperimentet er den eneste variabelen bunnkonsentrasjon. mens temperaturen holdes konstant.Små variasjoner i saltkonsentrasjonen gjør det mulig å undersøke krystalliseringsfasediagrammet ved å øke saltkonsentrasjonen fra 0,7 til 1,2 molar overmetning øker og løsningen i kjernesonen beveger seg bort fra metasonesonen. Følgelig observeres en variasjon i størrelse og antall krystaller med antall krystaller som øker og størrelsen avtar. I det første eksperimentet med OptiCrys under den gitte eksperimentelle tilstanden, når likevekten i dialysekammeret når, er krystalliseringsløsningen i kjernesonen i nærheten av den metastable sonen for krystalliseringsfasediagram.Som et resultat genereres bare noen få kjerner i løpet av den første fasen av eksperimentet. For å holde veksten av krystaller i den metastable sonen og kontrollere krystallvekstprosessen, ble temperaturen endret med forskjellige tidsintervaller. Hver gang krystallløsningslikevekten ble fullført, var temperaturen variert.Derfor temperaturen redusert til 291 Kelvin, 288 Kelvin og til slutt 275 Kelvin å opprettholde veksten av valgt krystall i metastable sonen. Resultatet av dette eksperimentet er en enkelt stor krystall, med volumet som kreves for naturlig makromolekylær krystallografi. De neste to eksperimentene viser reversibilitetet til de temperaturkontrollerte dialyseeksperimentene for kjernering, krystallvekst, oppløsning og gjenvekst.I det andre eksperimentet med OptiCrys ble den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen holdt konstant gjennom eksperimentet og temperaturen varierte. Den opprinnelige temperaturen ble satt til 291 Kelvin. På grunn av høy overmetning dukket et stort antall små krystaller opp i krystalliseringskammeret.I samsvar med begrepet direkte proteinløselighet, ved gradvis å øke temperaturen til 313 Kelvin alle krystallene skulle oppløses. Til slutt, ved å senke temperaturen til 295 Kelvin, den andre kjerner initiert i nærheten av metastable sonen og lov til å kontrollere kjerneprosessen resulterer i forming av lavere antall kjerner. Ytterligere krystallvekst tillot generering av den ensartede befolkningen av større krystaller.I dette eksperimentet fører endring av krystalliseringsløsningens kjemiske sammensetning ved konstant temperatur til å oppnå en jevn populasjon av større krystaller. Krystalliseringstilstanden var lik det forrige eksperimentet. Oppløsning av krystallene ble oppnådd ved å senke gradvis NaCl konsentrasjonen fra 0,9 molar til null.Reduksjon av saltkonsentrasjonen holder løsningen i den undermetettede sonen i fasediagrammet som fører til oppløsning av krystallene. Deretter ble den nye krystalliseringsløsningen med lavere ionisk styrke enn tidligere injisert i reservoarkammeret. Ved denne bunnkonsentrasjonen vises det nedre antallet krystaller og krystallene når et større volum enn før.Her ga vi en detaljert protokoll som beskriver prøveforberedelse og justering av kontrollprogramvaren for dyrking av store krystaller av høy kvalitet for naturlig makromolekylær krystallografi ved hjelp av et helautomatisk instrument utviklet i laboratoriet vårt. Denne trinnvise prosedyren ble designet og dratt nytte av kunnskapen om krystalliseringsfasediagrammet for å skille kjerner og krystallvekst. Videre presenteres en protokoll for voksende krystaller med mikrocytosemønstre også ved hjelp av makrocytoseknapper som et alternativ når OptiCrys ikke er tilgjengelig.I tillegg til strategiene som jeg nevnte for OptiCrys endre den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsning og temperatur og ta bilder bør gjøres manuelt. Bruk av termisk regulert vibrasjon for inkubatoren for å holde temperaturen konstant er nødvendig, noe som er et kritisk skritt i metodikken demonstrert.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering og Biofysikalsk Study of Fruit neglebåndene

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høsting og Cryo-kjøling Krystaller av membran proteiner Grown i Lipidic Mesophases for strukturbestemmelse av Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analyse av PDZ-avhengige CFTR makromolekylær signalveier Komplekser

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Iterativ Optimalisering av DNA Duplex for krystallisering av SeqA-DNA komplekser

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produksjon av menneske norovirus utstående domener i<em&gt; E. coli</em&gt; For røntgenkrystallografi

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium gjennomstrømming Screening analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og Acrosome reaksjon i menneskelig sæden

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...