Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS признает поддержку LABEX VALO GRAL по контракту 2015 года. NJ признает CEA Международная докторская исследовательская программа (Irtelis) для phD стипендий. Авторы признают финансирование программы исследований и инноваций «Горизонт 2020» Европейского союза в рамках грантового соглашения Мари Склодовской-Кюри No 722687. Авторы также благодарны д-ру Эско Оксанену (ESS, Lund) и д-ру Джин-Люку Ферреру (IBS, Grenoble) за полезные беседы и идеи. IBS признает интеграцию в Междисциплинарный научно-исследовательский институт Гренобля (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Различные физические, химические и биологические переменные влияют на кристаллизацию белка, влияя на солукостьбелка 21. Среди этих переменных, температура и химический состав раствора кристаллизации используются здесь в сочетании с методом диализа для улучшения и выращивания больших высококачественных кристаллов биокромолекул для исследований нейтронной дифракции. Используя знания фазовых диаграмм, кристаллизация делается более предсказуемой. Хотя скрининг различных условий кристаллизации в серийном подходе также возможен, основная цель использования рациональных подходов заключается в разделении и контроле кинетики кристаллического ядра и роста.
Как и во всех исследованиях кристаллизации, высококачественные чистые и однородные образцы белка, а также решения кристаллизации без пыли увеличивают успешность эксперимента. Фильтрация и центрифугация решений являются важными шагами в описанных протоколах. Зная физикохимические свойства изученных белков, таких как молекулярный вес (выбрать соответствующую мембрану диализа), изоэлектрический момент, и белок solubility имеют решающее значение для разработки оптимального эксперимента роста кристалла. Кроме того, необходимо учитывать стабильность белка при различных температурах или с различными химическими веществами, чтобы предотвратить потерю образца и увеличить вероятность успеха. Учитывая температурный диапазон OptiCrys (233.0-353.0 ± 0.1 K), широкий спектр белков может быть кристаллизован с его помощью. Но стоит подчеркнуть, что белки, которые в первую очередь термостабличный, такие как белки из термофильных источников, выиграют больше всего в контролируемых температурой больших объемов кристаллических экспериментов роста, предлагаемых этим инструментом.
Используя малооъемную диализную камеру (при использовании кнопок OptiCrys) или микродиализа и скрининг нескольких температур и условий кристаллизации (например, сетки резкой концентрации или рН), можно получить информацию о расположении предела метастабиальной зоны (кинетическое равновесие между нуклеацией и метастабильными зонами). Это имеет неоценимое значение при разработке успешного эксперимента по росту кристаллов, особенно для новых кандидатов белка в кристаллизации. Без этой информации эксперименты могут начинаться с области фазовой диаграммы с высокой супернасыщением, слишком далеко от предела метастабиальной зоны, чтобы легко контролировать кристаллическое ядро. Хотя растворение осадка протеина может быть предпринято, например путем увеличивать температуру в случае сразу растворимости, для протеинов с уменьшенной термостабельностью, держать образец на высокой температуре на более длинний период времени может сделать высыпание протеина необратимым. Таким образом, лучшая стратегия состоит в использовании первоначального состояния с более низкой супернасыщенностью, расположенной вблизи предела метеоприбывания, где нуклеацию можно контролировать и избежать выпадения белков. В соответствии с этим, кристаллизация предварительной проверки снижает вероятность того, что белок осаждается в диализной камере и увеличивает скорость успеха эксперимента.
После разработки эксперимента, подготовка диализных камер (OptiCrys) или кнопок микродиализа является еще одним важным шагом. Предотвращение образования пузырьков воздуха в диализной камере/кнопке повышает вероятность успешной кристаллизации, особенно при использовании небольших объемов. Присутствие пузырьков воздуха в диализной камере может также изменить кинетику процесса кристаллизации и уменьшить воспроизводимость эксперимента (потому что контактная поверхность белка/раствора была изменена). На успех эксперимента может повлиять не только белок, но и раствор кристаллизации. Использование новых трубок 50 мл для насосной системы каждый раз, когда один хочет начать новый эксперимент и мытье труб после каждого эксперимента снижает вероятность загрязнения и позволяет избежать создания кристаллов соли в аппарате.
Использование кнопок микродиализа является альтернативой, когда OptiCrys недоступен. Стратегии оптимизации кристаллизации и мониторинга роста кристаллов, упомянутые выше, должны осуществляться вручную. Как правило, это требует назрения за пределами терморегулируемого инкубатора, что может быть проблематичным, когда регулирование температуры является критическим шагом в описанной методологии. Это не облегчает изменение химического состава растворов кристаллизации или мониторинг роста кристаллов с помощью изображений, поэтому процесс роста кристалла не может контролироваться в режиме реального времени.
Знание фазовой диаграммы является основой использования скамейки кристаллизации OptiCrys для систематического выращивания крупных высококачественных кристаллов в автоматическом режиме. Контроль физико-химических параметров, таких как температура, концентрация осадков и рН во время кристаллизации, перемещает равновесие белкового раствора по четко определенной кинетической траектории по фазовой диаграмме. Это дополняется использованием диализной мембраны для регулировки общественного транспорта и создания контролируемого градиента в камере кристаллизации, который влияет на размер и качество кристаллов. Поэтому использование как термодинамических данных, так и кинетических траекторий необходимо для контроля процесса кристаллизации для выращивания высококачественных кристаллов. Благодаря OptiCrys систематические фазовые диаграммы в многомерном пространстве можно изучать с помощью последовательного подхода, используя значительно меньше материала, чем раньше. Чтобы продемонстрировать эту методологию, мы предоставляем здесь пример с моделью белка, куриное яйцо-белый лизозим. Используя и осваивая представленный здесь протокол, можно адаптировать его к реальнымбелковым системам 5,14,17,18.

Понимание структуро-функциональных отношений белков и механизма физиологических путей часто зависит от знания позиций атомов водорода (H) и как заряд передается в пределахбелка 1,2. Так как атомы водорода рассеивают рентгеновские лучи слабо, их положение может быть определено только с очень высоким разрешением рентгеновских данных дифракции (Nogt;1)3,4. И наоборот, нейтронная кристаллография может быть использована для получения точного положения атомов водорода в биологических макромолекулах, так какатомы водорода и дейтерия(H 2, изотоп водорода) имеют разброс длин примерно одинаковой величины, как кислород, азот иуглерод 5. Тем не менее, нейтронный поток из имеющихся нейтронных источников слабее, чем у рентгеновских лучей, так что это часто должно бытькомпенсировано за 2,3. Этого можно достичь путем обмена H с H2 и/или увеличения объема кристаллов для уменьшения бессвязного рассеяния водородов и увеличения соотношения сигнала к шуму дифракционных изображений.
Существуют различные подходы к кристаллизации (соответствующая схематическая схема фазовая диаграмма показана на рисунке 1) для получения больших и высококачественных кристаллов как для рентгеновской, так и для нейтронной био-макромолекулярной кристаллографии6. При диффузии пара капля, приготовленная из смеси белка и раствора кристаллизации, со временем равноувеличилась через испарение воды или других летучих видов против резервуара, содержащего более высокую концентрацию осадков того же раствора кристаллизации. Увеличение концентрации белка и осадки в капле приводит к супернасыщению, необходимому для спонтанного нуклеации с последующим ростом кристалла вэтих ядрах 6,7. Хотя диффузия пара является наиболее часто используемым методомдля выращивания кристаллов 4,процесс кристаллизации не может быть точно контролируется8. В методе диффузии свободного интерфейса раствор кристаллизации рассеивается в концентрированном белковом растворе, очень медленно направляя систему на супернасыщение. Этот метод можно рассматривать как пакетный метод с медленной скоростьюсмешивания 6,9,10,11,12. В пакетной методике белок быстро смешивается с раствором кристаллизации, что приводит к быстрой супернасыщению и, в свою очередь, равномерному нуклеациисо многими кристаллами 3,7. На этот метод приходится примерно треть всех структур, которые в настоящее время депонированы в Банке данных по белкам. Метод диализа также используется для выращивания высококачественных и хорошо диффрактных кристаллов белка. В методе диализа молекулы обрывистого диффузии из резервуара через полупроницаемую мембрану в отдельную камеру с белковым раствором. Кинетики эквилибрации зависит от различных факторов, таких как температура, размер мембраны поры, а также объем и концентрация образцов белка и кристаллизацииагентов 6.
Диаграммы фазы кристаллизации могут быть использованы для описания различных состояний белка как функции различных физических или химических переменных3. Как показано на рисунке 1, каждый метод кристаллизации может быть визуализирован как использование другой кинетической траектории для достижения нуклеации и метастабибловыхзон такой диаграммы 6,10,13. Это дает информацию о растворимости белка и концентрации белка, при которой наблюдается термодинамическое равновесие между кристаллом и раствором, тем самым находя оптимальные условия длянуклеации и роста 3,14. На двухмерной фазовой диаграмме концентрация белка построена как функция одной переменной, а другие переменные остаются постоянными15. На такой фазовой диаграмме, когда концентрация белка ниже кривой растворимости, раствор находится в недонасыщенной области и не происходит нуклеации или роста кристалла. Над этой кривой находится зона супернасыщения, где концентрация белка выше, чем предел солуства3,14. Это далее делится на три области: метастабийная зона, зона самопроизвольного ядра и зона осадков. В метастабилярной зоне, супернасыщение не является достаточным для нуклеации произойти в течение разумного времени, но рост семенных кристаллов может иметь место. Агрегация и осадки благоприятствуют в зоне осадков, где супернасыщениеслишком высока 14,15.
Когда будет достигнуто достаточное количество супернасыщения для спонтанного нуклеации, первые ядра появятся10. Рост кристаллов приводит к снижению концентрации белка до тех пор, пока не будет достигнут предел растворимости. До тех пор, пока супернасыщение остается в непосредственной близости от кривой растворимости, не будет никаких существенных изменений в размерах кристаллов. Однако было показано, что колебания температуры и химического состава раствора кристаллизации (например, концентрация осадков) повлияют на раствор белка и могут привести к началу дальнейшегороста кристалла 8,13,16.
Поскольку диализ выгоден для роста кристаллов хорошего качества, скамейка кристаллизации OptiCrys, иллюстрированная на рисунке 2,была разработана и разработана в нашей лаборатории для управления кристаллизацией полностью автоматизированнойманерой 8. Для этого было написано программное обеспечение с LabVIEW, которое позволяет контролировать и контролировать температуру установки диализа резервуара в контакте с элементами Peltier, с помощью электронного контроллера и охладителя. Это же программное обеспечение также автоматически регулирует химический состав раствора кристаллизации (например, обмен кристаллическими агентами) с помощью многоканальной жидкостной системы. Кроме того, цифровая камера и перевернутый микроскоп используются для визуализации и записи процесса кристаллизации. Для выращивания кристаллов для различных целей доступны две камеры кристаллизации с объемами 15 МКл и 250 МКЛ. Поскольку процесс кристаллизации обратим, скрининг на различные условия возможен с помощью всего лишь нескольких микролитров белкового раствора до тех пор, пока образец неповрежден 8. В результате, используя этот метод сводит к минимуму количество используемого белкового материала.
Из предыдущейработы 8, очевидно, что во время процесса роста кристалла, на месте наблюдения должны проводиться через регулярные промежутки времени. Они могут варьироваться от нескольких секунд до нескольких дней, в зависимости от события под наблюдением (осадки, нуклеация, или рост кристалла).
Оптимизация роста кристаллов с помощью OptiCrys основана на диаграммах фазы температурной фазы. В случае белков с растворимости в качестве прямой функции температуры, можно использовать режим засолки из18. Именно здесь увеличение ионной прочности раствора, который можно визуализировать с помощью белково-обрывистых фазовых диаграмм, снижает растворимость белка. Аналогичным образом, белки с обратной растворимости может использовать соляной в режиме18. Нуклеация происходит в зоне нуклеации, в непосредственной близости от метастабиальной зоны, и рост кристалла происходит в метастабиальной зоне фазовой диаграммы до тех пор, пока концентрация белка не достигнет предела солублиции. Как показано на рисунке 3A, с постоянной температурой химического состава может быть уменьшена, чтобы сохранить кристаллизационный раствор в метастабиальной зоне, чтобы предотвратить новое нуклеацию. Кристаллы растут до тех пор, пока не будет достигнуто второе равновесие кристалла/раствора, и после этого дальнейшего увеличения размера кристаллов не наблюдается. Температура снижается в несколько раз, пока кристаллы не достигнут желаемого размера. На рисунке 3B,при постоянной температуре, повышение концентрации осадков сохраняет раствор в метастабильной зоне. Этот процесс может быть повторен несколько раз, чтобы получить большие кристаллы. Изменение температуры и манипулирование условиями решения кристаллизации, путем управления уровнями супернасыщения, являются двумя мощными инструментами для разделения нуклеации и роста кристаллов, которые контролируются точно и автоматически OptiCrys5,8,14.
Примеры кристаллов протеина, выращенных с помощью контролируемой температурой, или контролируемой температурой и высокой концентрацией кристаллизации, а также полученных данных относительной дифракции доступны в литературе и PDB. Среди них человеческий γ-кристаллин E, PA-IIL лектин, дрожжевые неорганические пирофосфазы, оксидазы уратов, углеродная ангидраза II человека, киназы ИчБ и лактатдегидрогеназы 5,14,17,18.
Хотя OptiCrys был коммерциализирован NatX-ray, есть много лабораторий, которые не имеют доступа к этому инструменту или серийному подходу, который он предлагает. Альтернативой этому методу является использование коммерчески доступных пластиковых кнопок микродиализа с различными объемами. Используя их, температурный и химический состав можно регулировать и менять вручную. Проверка кнопок микродиализа не может быть выполнена на месте и вместо этого должна быть сделана вручную с помощью оптического микроскопа. Контроль температуры может быть достигнут путем хранения образца в инкубаторе, свободном от вибрации, контролируемом температурой. Важно поддерживать постоянную температуру, чтобы эксперименты по кристаллизации были воспроизводимыми. Значительное изменение температуры может также привести к повреждению или разрушению кристаллов5.
Здесь мы предоставляем подробный протокол, описывающий подготовку образца и использование программного обеспечения для управления для роста больших, высококачественных кристаллов, пригодных для кристаллографии нейтронного белка. Эта пошаговая процедура была разработана, чтобы воспользоваться схемой фазы кристаллизации, чтобы выбрать исходное положение и кинетический путь для контроля размера и качества генерируемых кристаллов. Кроме того, представлен подробный протокол выращивания кристаллов с кнопками микродиализа, который использует то же обоснование для получения больших, высококачественных кристаллов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Использование нейтронной макромолекулярной кристаллографии (NMX) быстро расширяется, при этом большинство структур определяется в последнее десятилетие благодаря построению новых лучей NMX и повышению доступности программного обеспечения для уточнения структуры. Однако нейтронные источники, доступные в настоящее время для NMX, значительно слабее эквивалентных источников рентгеновской кристаллографии. Несмотря на достижения в этой области, для исследований нейтронной дифракции всегда потребуются значительно более крупные кристаллы, особенно с тенденцией к изучению все более крупных макромолекул и комплексов. Поэтому для расширения NMX необходимы дальнейшие усовершенствования методов и приборов, пригодных для выращивания более крупных кристаллов.
В этой работе мы вводим рациональные стратегии и скамейку роста кристаллов (OptiCrys), разработанную в нашей лаборатории, которая сочетает в себе наблюдение в режиме реального времени с помощью установленной микроскопом видеокамеры с точным автоматизированным управлением решениями кристаллизации (например, стремительной концентрацией, рН, добавкой, температурой). Затем мы демонстрируем, как этот контроль температуры и химического состава облегчает поиск оптимальных условий кристаллизации с использованием модельных растворимых белков. Тщательное знание диаграммы фазы кристаллизации имеет решающее значение для выбора исходного положения и кинетического пути для любого эксперимента кристаллизации. Мы показываем, как рациональный подход может контролировать размер и количество кристаллов, генерируемых на основе знаний многомерных фазовые диаграммы.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Структурные исследования биокромолекул с помощью кристаллографии требуют высококачественных кристаллов. Здесь мы демонстрируем протокол, который может быть использован OptiCrys (полностью автоматизированный инструмент, разработанный в нашей лаборатории) и / или microdialysis кнопки для выращивания больших высококачественных кристаллов на основе знаний о кристаллизации фазы диаграммы.

Оптимизация кристаллического роста для нейтронной макромолекулярной кристаллографии

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Существуют различные подходы к кристаллизации для получения больших и высококачественных кристаллов как для рентгеновской, так и для нейтронной кристаллографии. Одним из таких подходов является использование метода диализа. В этом методе белковый раствор отделяется от стремительного раствора полупроницаемой мембраной.Зарождающиеся молекулы рассеиваются через мембрану в белковую камеру. Когда будет достигнута правильная супернасыщение для спонтанного нуклеации, появятся первые ядра. Здесь мы продемонстрируем протокол, который может быть использован OptiCrys полностью автоматизированным инструментом, разработанным в нашей лаборатории, который использует кристаллизацию контролируемого температурного диализа, и наши кнопки микродиа диализа для выращивания больших высококачественных кристаллов для естественной макромолекулярной кристаллографии, основанной на знании диаграммы фазы кристаллизации.Для микро-кнопки диализа с определенным объемом микролитера пипетка 35 микролитров раствора лизозима попадает в диализную камеру. Этот дополнительный объем создает немного форму купола на верхней части камеры диализа и предотвращает образование пузырьков воздуха. Возьмите аппликатор и поместите эластичный или кольцо на конечности его.Поместите мембрану на верхней части камеры и исправить его путем передачи эластичной или кольцо от аппликатора в паз кнопки диализа. Перенесите кнопку в колодец, содержащий раствор кристаллизации. Обложка хорошо с стеклянной крышкой скольжения или кусок ленты.Держите образец на 293 Кельвин в вибрации свободного теплового регулятора инкубатора. Зная, что кристаллизация диализа дает преимущества с точки зрения роста кристаллизации, скамейка кристаллизации, так называемая OptiCrys, была разработана и разработана в нашей лаборатории, чтобы предложить полностью автоматизированный комбинированный контроль температуры и химического состава эксперимента по биомолекулярной кристаллизации. Оптимизация кристаллического роста OptiCrys основана на диаграммах фазы температурной фазы.Нуклеация происходит в зоне нуклеации в непосредственной близости от метастабиальной зоны, а рост кристалла происходит в метастабиальной зоне после фазовой диаграммы, пока концентрация белка не достигнет кривой растворимости, представляющей термодинамическое равновесие между раствором и кристаллами. Снижая температуру в случае белка с прямой растворимости или увеличивая выжидательную концентрацию в случае засолки, раствор кристаллизации остается в метастабильной зоне и не происходит нуклеации. Кристаллы растут до достижения равновесия второго кристаллического раствора, после чего дальнейшего увеличения размера кристаллов не наблюдается.Снижение температуры или повышение концентрации осадков повторяется несколько раз, пока кристаллы не достигнут желаемого размера. Добавьте белковый раствор в камеру диализа контролируемой температуры, накрываемую камерой с помощью диализной мембраны и зафиксв мембрану эластичной или кольцевой. Переверните над камерой и положить его на верхней части диализной камеры.Нажмите его осторожно и медленно, чтобы удалить весь воздух, оказавшихся между двумя частями, исправить резервуар в его положении, аккуратно завинчивая его на верхней части над камерой. Добавьте раствор кристаллизации в камеру резервуара и накройте его герметичной крышкой. Передача этой сборки и вставил его в груди поддержку кристаллизации скамейке OptiCrys Кристалл роста является надзор программное обеспечение Кристаллизация скамейке OptiCrys.Она включает в себя четыре различных графических интерфейсов или представлений. Домашнее представление содержит кнопки для навигации по другим представлениям. Целью интерфейса настройки является определение сценария эксперимента, который может быть запущен автоматически в тестовом представлении.Последним представлением является представление обслуживания. Чтобы перезапустить эксперимент, представление обслуживания должно быть открытым, где находятся все необходимые параметры для плавного запуска экспериментов по кристаллизации. Увеличьте светимость от световой секции, свет может увеличиться с нуля, без света до 100 максимальной яркости.Для контроля и мониторинга температуры используется секция регулятора температуры. Нажмите на кнопку, чтобы включить его. Установите температуру на секции точки набора и нажмите введите.Под этой кнопкой, Есть два графика. Красный показывает окончательный, температура порядка и желтый график показывает текущую температуру. Смешивая стоковые растворы, инъекция раствора кристаллизации в камеру резервуара контролируется секцией Palm.Добавьте концентрацию раствора запаса на первом этапе. Затем найдите окончательную концентрацию каждого нового решения группера и добавьте их в окончательный раздел концентрации. После нажатия кнопки расчета, выяснить объем запасного раствора будет рассчитан и добавит в объем панели перед каждой концентрационой панели.Нажмите кнопку подготовки запуска и подождите, пока новое решение премьера будет готово. Для обмена решением кристаллизации нажмите кнопку «Вход решений». Для остановки процесса нажмите кнопку Stop Distribution.На правой стороне раздела микроскопа, Есть несколько панелей для записи важной информации из каждого эксперимента роста кристалла. Добавьте соответствующее название белков, молекулярный вес и состояние кристаллизации в этом разделе. Определите имя для экспериментов, просто введя его на имя папки.Из раздела nb изображений выберите количество изображений, которые должны быть сделаны в ходе эксперимента. Добавьте количество изображений и с панели справа выберите шкалу таймера. Нажмите на кнопку папки, чтобы открыть папку.В этой папке есть текстовый файл, содержащий всю информацию, которую вы ранее определили для вашего эксперимента. Изображения, готовые к дальнейшему лечению, также сохраняются в этой папке. Увеличить микроскоп также можно автоматически.Изменяет масштабирование с помощью кнопки "плюс" и "минус" в верхней части раздела микроскопа, чтобы увеличить или уменьшить увеличение соответственно. Существует три различных способа измерения размера кристалла. Для измерения длины или ширины используйте вектор ширины.В зависимости от формы кристалла можно выбрать конкретные инструменты из левой части раздела микроскопа. Например, прямоугольный или полигон. Значения будут отображаться в разделе измерения.В первом наборе экспериментов кнопки микродиализа были погружены в растворы кристаллизации с различными концентрациями соли. В этом простом эксперименте сетки кристаллизации единственной переменной является пропасть концентрации. в то время как температура остается постоянной.Незначительные колебания концентрации соли позволяют исследовать схему фазы кристаллизации за счет увеличения концентрации соли с 0,7 до 1,2 увеличения объемной визуализации, а раствор в зоне нуклеации отохвается от метастабиальной зоны. Следовательно, наблюдается изменение размера и количества кристаллов с увеличением количества кристаллов и уменьшением их размера. В первом эксперименте с OptiCrys при данном экспериментальном состоянии, как только равновесие в диализной камере достигает, раствор кристаллизации находится в зоне нуклеации в непосредственной близости от метастабиальной зоны фазы кристаллизации диаграммы.В результате на первом этапе эксперимента генерируется всего несколько ядер. Для того, чтобы сохранить рост кристаллов в метастабиальной зоне и контролировать процесс роста кристалла, температура была изменена с разными временными интервалами. Каждый раз, когда равновесие кристаллического раствора было завершено, температура была разнообразной.Поэтому температура снизилась до 291 Кельвина, 288 Кельвина и, наконец, 275 Кельвина для поддержания роста выбранного кристалла в метастабиальной зоне. Результатом этого эксперимента является один большой кристалл, с объемом, необходимым для естественной макромолекулярной кристаллографии. Следующие два эксперимента демонстрируют обратимость контролируемых температурой диализных экспериментов для нуклеации, роста кристаллов, растворения и отрастания.Во втором эксперименте с OptiCrys химический состав раствора кристаллизации был постоянным в ходе эксперимента и температура менялась. Начальная температура была установлена на уровне 291 Кельвина. Из-за высокой супернасыщения в камере кристаллизации появилось большое количество мелких кристаллов.В соответствии с концепцией прямой растворимости белка, постепенно повышая температуру до 313 Кельвина, все кристаллы должны были растворяться. Наконец, понизив температуру до 295 Кельвина, второе нуклеацию началось в непосредственной близости от метастабийной зоны и позволило контролировать процесс нуклеации, что привело к формированию меньшего количества ядер. Дальнейший рост кристаллов позволил создать единую популяцию более крупных кристаллов.В этом эксперименте изменение химического состава раствора кристаллизации при постоянной температуре приводит к получению равномерной популяции более крупных кристаллов. Состояние кристаллизации было похоже на предыдущий эксперимент. Растворение кристаллов было достигнуто путем постепенного снижения концентрации NaCl с 0,9 молара до нуля.Снижение концентрации соли удерживает раствор в недонасыщенной зоне фазовой диаграммы, что приводит к растворению кристаллов. Затем в камеру резервуара был введен новый раствор кристаллизации с меньшей ионной прочностью, чем раньше. При такой стремительной концентрации появляется меньшее количество кристаллов и кристаллы достигают большего объема, чем раньше.Здесь мы представили подробный протокол, описывающий подготовку образца и корректировку программного обеспечения управления для выращивания больших и высококачественных кристаллов для естественной макромолекулярной кристаллографии с использованием полностью автоматизированного инструмента, разработанного в нашей лаборатории. Эта пошаговая процедура была разработана и извлечь выгоду из знания схемы фазы кристаллизации, чтобы отделить нуклеацию и рост кристаллов. Кроме того, протокол для выращивания кристаллов с микроцитозом моделей также представлен с использованием кнопок макроцитоза в качестве альтернативы, когда OptiCrys не доступен.В дополнение к стратегиям, которые я упомянул для OptiCrys изменения химического состава раствора кристаллизации и температуры и съемки должны быть сделаны вручную. Использование термической регулируемой вибрации для инкубатора для постоянной температуры требуется, что является критическим шагом в продемонстрированной методологии.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Изоляция и биофизических исследований фруктов кутикул

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Производство человека Norovirus выступающую Домены в<em&gt; E. палочки</em&gt; Для рентгеновской кристаллографии

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Средне-пропускная способность, отбор проб для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...