Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS bekräftar stödet från LABEX VALO GRAL enligt kontraktet 2015. NJ uppmärksammar CEA:s internationella forskarutbildning (Irtelis) för forskarstipendiet. Författarna erkänner finansieringen från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal nummer 722687. Författarna är också tacksamma mot Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) och Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) för hjälpsamma samtal och insikter. IBS erkänner integrationen i Grenobles tvärvetenskapliga forskningsinstitut (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Olika fysiska, kemiska och biologiska variabler påverkar proteinkristallisering genom att påverka proteinlösligheten21. Bland dessa variabler används kristalliseringslösningens temperatur och kemiska sammansättning här i kombination med dialysteknik för att förbättra och odla stora högkvalitativa kristaller av biomacromolecules för neutrondiffraktionsstudier. Genom att använda kunskap om fasdiagram blir kristalliseringen mer förutsägbar. Även om screening av olika kristalliseringsförhållanden i ett seriellt tillvägagångssätt också är möjligt, är huvudsyftet med att använda de rationella metoder som presenteras att separera och kontrollera kinetiken av kristallkärna och tillväxt.
I likhet med alla kristalliseringsstudier ökar högkvalitativa rena och homogena proteinprover och dammfria kristalliseringslösningar experimentet. Filtrering och centrifugering av lösningar är viktiga steg i de beskrivna protokollen. Att känna till de fysikaliskkemiska egenskaperna hos de studerade proteinerna, såsom molekylvikten (för att välja lämpligt dialysmembran), är den isoelektriska punkten och proteinlösligheten avgörande för utformningen av ett optimalt kristalltillväxtexperiment. Man måste också överväga proteinstabilitet vid olika temperaturer eller med olika kemikalier för att förhindra provförlust och öka sannolikheten för framgång. Med tanke på temperaturområdet för OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K) kan ett brett spektrum av proteiner kristalliseras med hjälp av det. Men det är värt att betona att proteiner som främst är termostabila, såsom proteiner från termofila källor, skulle gynnas mest i temperaturkontrollerade kristalltillväxtexperiment med stor volym som erbjuds av detta instrument.
Med hjälp av en dialyskammare med låg volym (vid användning av OptiCrys) eller mikrodialysknappar och screening av flera temperaturer och kristalliseringsförhållanden (t.ex. rutnät med utfällningskoncentration eller pH) är det möjligt att få information om platsen för gränsen för den metastaserbara zonen (kinetisk jämvikt mellan nukleation och metastaserbara zoner). Detta är ovärderligt när man utformar ett framgångsrikt kristalltillväxtexperiment speciellt för nya proteinkandidater i kristallisering. Utan denna information kan experiment börja från ett område i fasdiagrammet med hög övermättnad, för långt från gränsen för den metastaserbara zonen för att enkelt kontrollera kristallkärnan. Även om upplösning av proteinutfällningen kan försökas, till exempel genom att öka temperaturen vid direkt löslighet, för proteiner med minskad termostabilitet, kan det göra proteinutfällningen oåterkallelig genom att hålla provet vid hög temperatur under en längre tid. Således består den bästa strategin av att använda ett initialt tillstånd med lägre övermättnad som ligger nära gränsen för metastabilitet, där nukleation kan kontrolleras och proteinutfällning undviks. I linje med detta minskar kristalliseringsförscreening chansen att ha ett proteinutfällning i dialyskammaren och ökar experimentet.
Efter att ha designat ett experiment är det ett annat viktigt steg att förbereda dialyskammare (OptiCrys) eller mikrodialysknappar. Att förhindra luftbubblabildning i dialyskammaren/knappen ökar risken för framgångsrik kristallisering, särskilt när små volymer används. Förekomsten av luftbubblor i dialyskammaren kan också förändra kristalliseringsprocessens kinetik och minska experimentet (eftersom proteinet/lösningens kontaktyta har modifierats). Inte bara protein utan också kristalliseringslösning kan påverka experimentens framgång. Att använda nya 50 ml-rör till pumpsystemet varje gång man vill starta ett nytt experiment och tvättslangar efter varje experiment minskar risken för förorening och undviker att saltkristaller skapas i apparaten.
Användningen av mikrodialysknappar är ett alternativ när OptiCrys inte är tillgängligt. De strategier för optimering av kristallisering och övervakning av kristalltillväxt som nämns ovan måste utföras manuellt. Vanligtvis kräver detta att vara utanför en termoreglerad inkubator, vilket kan vara problematiskt när temperaturreglering är ett kritiskt steg i den beskrivna metoden. Detta underlättar inte att ändra kristalliseringslösningarnas kemiska sammansättning eller övervaka kristalltillväxt genom avbildning, så kristalltillväxtprocessen kan inte kontrolleras i realtid.
Kunskap om fasdiagrammet ligger till grund för att använda kristalliseringsbänken OptiCrys för att systematiskt odla stora kristaller av hög kvalitet på ett automatiserat sätt. Kontroll av fysikalisk-kemiska parametrar som temperatur, utfällningskoncentration och pH under kristallisering flyttar proteinlösningens jämvikt i en väldefinierad kinetisk bana över fasdiagrammet. Detta kompletteras med användning av ett dialysmembran för att justera masstransporten och skapa en kontrollerad gradient i kristalliseringskammaren som påverkar kristallernas storlek och kvalitet. Därför är det viktigt att använda både termodynamiska data och kinetiska banor för att kontrollera kristalliseringsprocessen för att odla högkvalitativa kristaller. Tack vare OptiCrys kan systematiska fasdiagram i ett flerdimensionellt utrymme studeras med ett seriellt tillvägagångssätt med betydligt mindre material än tidigare. För att demonstrera denna metodik ger vi här en fallstudie med ett modellprotein, kyckling äggvita lysozyme. Genom att använda och behärska protokollet som presenteras här kan man anpassa det för riktiga proteinsystem5,14,17,18.

Att förstå proteinernas struktur-funktionsförhållande och mekanismen för fysiologiska vägar bygger ofta på att känna till väteatomers (H) positioner och hur laddning överförs inom ett protein1,2. Eftersom väteatomer sprider röntgenstrålar svagt kan deras positioner endast bestämmas med mycket högupplösta röntgendiffraktionsdata (>1 Å)3,4. Omvänt kan neutronkristallografi användas för att erhålla en exakt position av väteatomer i biologiska makromolekyler eftersom väte- och deuteriumatomer (H2, isotop av väte) har spridningslängder av ungefär samma storlek som syre, kväve och kol5. Neutronflödet från tillgängliga neutronkällor är dock svagare än för röntgenstrålar, så detta måste ofta kompenseras för2,3. Detta kan uppnås genom att byta H med H2 och/eller öka volymen av kristaller för att minska den inkonsekventa spridningen av väte och öka signal-till-brusförhållandet för diffraktionsbilder.
Det finns olika kristalliseringsmetoder (motsvarande schematiska fasdiagram visas i figur 1) för att erhålla stora kristaller av hög kvalitet för både röntgen och neutronbiomakromolekylär kristallografi6. Vid ångdiffusion jämställs en droppe som framställs av en blandning av ett protein och en kristalliseringslösning med tiden, genom avdunstning av vatten eller andra flyktiga arter, mot en reservoar som innehåller en högre koncentration av fällning av samma kristalliseringslösning. Ökningen av koncentrationen av protein och fällningsmedel i droppen leder till den övermättnad som krävs för spontan nukleation följt av kristalltillväxt vid dessakärnor 6,7. Även om ångdiffusion är den vanligaste tekniken för odling avkristaller 4,kan kristalliseringsprocessen inte kontrolleras exakt8. I den fria gränssnittsdiffusionsmetoden sprids kristalliseringslösningen till en koncentrerad proteinlösning, vilket mycket långsamt leder systemet mot övermättnad. Denna metod kan betraktas som en batchmetod med en långsam blandningshastighet6,9,10,11,12. I batchmetoden blandas proteinet snabbt med en kristalliseringslösning som leder till snabb övermättnad och i sin tur enhetlig nukleation med många kristaller3,7. Denna metod står för ungefär en tredjedel av alla strukturer som för närvarande deponeras i Protein Data Bank. Dialysmetoden används också för odling av högkvalitativa och väldriffande proteinkristaller. I dialysmetoden sprids molekyler av utfällande diffus från en reservoar genom ett halvgenomsläppligt membran i en separat kammare med proteinlösningen. Jämviktens kinetik beror på olika faktorer, såsom temperatur, membranporstorlek och volym och koncentration av proteinprover och kristalliseringsmedel6.
Kristalliseringsfasdiagram kan användas för att beskriva olika tillstånd hos ett protein som en funktion av olika fysiska eller kemiska variabel3. Som illustreras i figur 1kan varje kristalliseringsteknik visualiseras som att använda en annan kinetisk bana för att nå nukleations- och metastaserbara zoner i ett sådant diagram6,10,13. Detta ger information om proteinlöslighet och proteinkoncentrationen vid vilken en termodynamisk jämvikt mellan kristall och lösning observeras, vilket hittar de optimala förutsättningarna för nukleation och tillväxt3,14. I ett tvådimensionellt fasdiagram ritas proteinkoncentrationen som en funktion av en variabel och de andra variablerna hållskonstanta 15. I ett sådant fasdiagram, när proteinkoncentrationen ligger under löslighetskurvan, är lösningen i den undermättade regionen och ingen nukleation eller kristalltillväxt uppstår. Ovanför denna kurva ligger övermättnadszonen där proteinkoncentrationen är högre än löslighetsgränsen3,14. Detta är vidare indelat i tre regioner: den metastaserbara zonen, den spontana nukleationszonen och nederbördszonen. I den metastaserbara zonen är övermättnad inte tillräcklig för att nukleation ska ske inom rimlig tid men tillväxt av sådda kristaller kan äga rum. Aggregering och nederbörd gynnas i nederbördszonen, där övermättnaden är för hög14,15.
När tillräcklig övermättnad för spontan nukleation uppnås, kommer de första kärnorna att visas10. Tillväxten av kristaller leder till en minskning av proteinkoncentrationen tills gränsen för löslighet uppnås. Så länge övermättnaden stannar i närheten av löslighetskurvan kommer det inte att ske någon betydande förändring i kristallens storlek. Det har dock visat sig att variationer i kristalliseringslösningens temperatur och kemiska sammansättning (till exempel koncentrationen av fällningsmedel) kommer att påverka proteinlösligheten och kan leda till att ytterligare kristalltillväxt8,13,16.
Eftersom dialys är fördelaktigt för kristalltillväxt av god kvalitet, designades och utvecklades OptiCrys kristalliseringsbänk illustrerad i figur 2i vårt laboratorium för att kontrollera kristallisering på ett helautomatiskt sätt8. För detta ändamål skrevs programvara med LabVIEW som möjliggör kontroll och övervakning av temperaturen hos en flytande reservoardialysinställning i kontakt med Peltier-element, via en elektronisk styrenhet och en kylare. Samma programvara reglerar också automatiskt kristalliseringslösningens kemiska sammansättning (till exempel utbyte av kristalliseringsmedel) med hjälp av ett fluidiskt system med flera kanaler. Dessutom används en digitalkamera och ett inverterat mikroskop för att visualisera och spela in kristalliseringsprocessen. Två kristalliseringskammare med 15 μL- och 250 μL-volymer finns tillgängliga för odling av kristaller för olika ändamål. Eftersom kristalliseringsprocessen är reversibel är screening för olika förhållanden möjlig med bara några mikroliter av proteinlösningen så länge provet inte är skadat8. Som ett resultat minimerar användningen av denna metod mängden proteinmaterial som används.
Från tidigare arbete8är det uppenbart att observationer på plats under kristalltillväxtprocessen måste utföras med jämna tidsintervall. Dessa kan variera från några sekunder till flera dagar, beroende på händelsen under observation (nederbörd, nukleation eller kristalltillväxt).
Optimeringen av kristalltillväxt med OptiCrys baseras på temperaturutfällande koncentrationsfasdiagram. När det gäller proteiner med löslighet som en direkt funktion av temperaturen är det möjligt att använda utsaltningssystemet18. Det är här en ökning av lösningens joniska styrka, som kan visualiseras med hjälp av proteinutfällande fasdiagram, minskar proteints löslighet. På samma sätt kan proteiner med omvänd löslighet använda saltningssystemet18. Nukleation sker i nukleationszonen, i närheten av den metastabila zonen, och kristalltillväxt sker sedan i fasdiagrammets metastaserbara zon tills proteinkoncentrationen når löslighetsgränsen. Som visas i figur 3A, med konstant kemisk sammansättningstemperatur kan minskas för att hålla kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen för att förhindra ny nukleation. Kristaller växer tills den andra kristallen / lösningsjämvikten uppnås och därefter observeras ingen ytterligare ökning av kristallens storlek. Temperaturen sänks flera gånger tills kristallerna når önskad storlek. I figur 3B, vid konstant temperatur, håller en ökning av den utfällande koncentrationen lösningen i den metastaserbara zonen. Denna process kan sedan upprepas flera gånger för att få stora kristaller. Att ändra temperaturen och manipulera kristalliseringslösningsförhållandena, genom att kontrollera övermättnadsnivåerna, är två kraftfulla verktyg för att separera kärnor och tillväxt av kristaller som kontrolleras exakt och automatiskt av OptiCrys5,8,14.
Exempel på proteinkristaller som odlas av temperaturkontrollerad, eller temperatur- och utfällbar koncentrationsstyrd kristallisering, samt relativa diffraktionsdata som erhållits finns tillgängliga i litteraturen och PDB. Bland dem finns humant γ-kristalllin E, PA-IIL-ditin, jäst oorganiskt pyrofosfatas, uratoxidas, human kolsyra anhydras II, YchB-kinas och laktatdehydrogenas5,14,17,18.
Även om OptiCrys kommersialiserades av NatX-ray finns det många laboratorier som inte har tillgång till detta instrument eller till den seriella metoden det erbjuder. Alternativet till denna teknik är att använda kommersiellt tillgängliga mikrodialysknappar av plast med olika volymer. Med hjälp av dessa kan temperatur och kemisk sammansättning justeras och varieras manuellt. Inspektion av mikrodialysknappar kan inte göras på plats utan måste istället göras manuellt med ett optiskt mikroskop. Temperaturreglering kan uppnås genom att hålla provet i en vibrationsfri temperaturstyrd inkubator. Det är viktigt att hålla temperaturen konstant för att säkerställa att kristalliseringsexperiment är reproducerbara. Betydande temperaturvariationer kan också leda till skador eller förstörelse av kristaller5.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som beskriver provberedning och användning av kontrollprogramvara för tillväxt av stora kristaller av hög kvalitet som är lämpliga för neutronproteinkristallografi. Denna steg-för-steg-procedur utformades för att dra nytta av kristalliseringsfasdiagrammet för att välja en startposition och kinetisk bana för att kontrollera storleken och kvaliteten på de kristaller som genereras. Dessutom presenteras ett detaljerat protokoll för odling av kristaller med mikrodialysknappar som använder samma logik för att få stora kristaller av hög kvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Användningen av neutronmakromolekylär kristallografi (NMX) expanderar snabbt med de flesta strukturer som fastställts under det senaste decenniet tack vare att nya NMX-strållinjer har byggts och ökad tillgång till strukturförfiningsprogram. De neutronkällor som för närvarande finns tillgängliga för NMX är dock betydligt svagare än motsvarande källor för röntgenkristallografi. Trots framsteg inom detta område kommer betydligt större kristaller alltid att krävas för neutrondiffraktionsstudier, särskilt med tendensen att studera allt större makromolekyler och komplex. Ytterligare förbättringar av metoder och instrumentering som lämpar sig för odling av större kristaller är därför nödvändiga för att användningen av NMX ska kunna expandera.
I detta arbete introducerar vi rationella strategier och en kristalltillväxtbänk (OptiCrys) utvecklad i vårt laboratorium som kombinerar realtidsobservation genom en mikroskopmonterad videokamera med exakt automatiserad kontroll av kristalliseringslösningar (t.ex. utfällningskoncentration, pH, tillsats, temperatur). Vi visar sedan hur denna kontroll av temperatur och kemisk sammansättning underlättar sökandet efter optimala kristalliseringsförhållanden med hjälp av modelllösliga proteiner. Grundlig kunskap om kristalliseringsfasdiagrammet är avgörande för att välja startposition och kinetisk väg för alla kristalliseringsexperiment. Vi visar hur ett rationellt tillvägagångssätt kan styra storleken och antalet kristaller som genereras baserat på kunskap om flerdimensionella fasdiagram.

I avsnitten 2.3 och 2.4 presenteras tre exempel på optimerad kristalltillväxt som visar användning av instrumentet och en experimentell design för odling av stora kristaller. För denna demonstration har vi använt lysozyme som modellprotein, även om kristalltillväxtexperiment framgångsrikt har utförts med många andra proteinsystem med denna metod (se ovan). Genom att använda och behärska protokollet som presenteras här kan man anpassa det för andra proteinkandidater.
I avsnitt 2.3 visade vi att etablerade rationella kristalliseringsstrategier kan vara till nytta för odling av kristaller med tillräckliga spridningsvolymer för neutronproteinkristallografi. Här visar vi att de föreslagna rationella optimeringsstrategierna också möjliggör generering av en enhetlig population av kristaller av någon specifik storlek som krävs för nedströms strukturbestämningsmetoder.
Dessa två experiment är utformade för att betona vikten av fasdiagram för att kontrollera kristallkärnor och tillväxt. Här används kontroll av kristalliseringslösningarnas temperatur och kemiska sammansättning i kombination med övervakning av kristalliseringsprocessen i realtid för att studera det kvalitativa fasdiagrammet. Med denna metod kan nukleation och kristalltillväxt optimeras rationellt på ett reversibelt sätt. Användning av ett sådant seriellt tillvägagångssätt minskar också mängden protein och den tid som krävs för att kontrollera kristallens storlek och kvalitet.
I dialysmetoden separeras en proteinlösning från en kristalliseringslösning med ett halvgenomsläppligtmembran 6 (figur 5). Detta dialysmembran tillåter små molekyler som tillsatser, buffert och joner att passera genom membranet men inte makromolekyler somproteiner 6,20. Med den här funktionen kan kristalliseringslösningen ändras under experimentet6. Utbyte av lösningen kan ske manuellt, till exempel i mikrodialysknappar, eller på ett automatiserat sätt med hjälp av ett instrument som utvecklats för detta ändamål, OptiCrys8.
I den första uppsättningen experiment användes mikrodialysknappar för kristallisering av kyckling äggvit lysozyme. Mikrodialysknappar var nedsänkta i kristalliseringslösningar med olika saltkoncentrationer. I detta enkla kristalliseringsnätsexperiment är den enda variabeln utfällbar koncentration medan temperaturen hålls konstant (293 K). Som visas i figur 4inducerar små variationer i saltkoncentrationen en förändring av storleken och antalet observerade kristaller, vilket möjliggör undersökning av kristalliseringsfasdiagrammet. I figur 4, panel 1, innehåller kristalliseringslösningen 0,7 M NaCl och ett begränsat antal större kristaller har dykt upp i knapparna. Genom att öka saltkoncentrationen från 0,7 till 1,2 M ökar övermättnaden och lösningen i nukleationszonen rör sig bort från den metastaserbara zonen (figur 4, panelerna 1 till 6). Som ett resultat ökar antalet kristaller och deras storlek minskar.
I det första experimentet med ett helautomatiskt instrument som möjliggör temperaturkontrollerad dialyskristallisering, OptiCrys (Figur 9), var kristalltillväxtexperimentet skräddarsytt för att generera stor kristalltillväxt. Experimentet lanserades vid en initial temperatur på 295 K med en kristalliseringslösning som innehåller 0,75 M NaCl och 0,1 M Na acetatbuffert pH 4. Under dessa experimentella förhållanden nådde kristalliseringslösningen nukleationszonen i närheten av fasdiagrammets metastaserbara zon (figur 9, pil 1). Som ett resultat genererades endast ett fåtal atomkärnor under experimentet första steget. För att odla utvalda kristaller ytterligare (visas i figur 9)drevs arbetsflödet för kristalltillväxtoptimering mot den metastaserbara zonen av varierande temperatur så snart kristalllösningens jämvikt nåddes.
Varje gång jämvikt mellan kristall och lösning nåddes sänktes temperaturen, först till 291 K, sedan till 288 K och slutligen till 275 K, för att hålla kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen. Resultatet av detta experiment är en enda stor kristall som lämpar sig för både makromolekylär röntgen och neutronkristallografi.
För de flesta proteiner har det exakta kvantitativa fasdiagrammet (eller bara ett kvalitativt diagram) ännu inte erhållits på grund av bristen på experimentella anordningar som exakt kan mäta proteinkoncentrationen (eller bara observera/upptäcka kristalliseringsprocessen i realtid) under kristalliseringsexperiment18. Som ett resultat är det ofta inte möjligt att utforma experimentet på ett sådant sätt att kristalliseringen börjar i det optimala området i fasdiagrammet, i närheten av den metastaserbara zonen.
Därför måste en kristalliseringsoptimeringsstudie äga rum innan experimentet tillägnad tillväxten av en stor volymkristall genomförs. I denna studie, med hjälp av temperaturvariationer (vid konstant kemisk sammansättning) å ena sidan och variationer i kemisk sammansättning (vid konstant temperatur) å andra sidan, är det nödvändigt att identifiera den metastaserbara zonen och att avgränsa de optimala förutsättningarna för att starta ett stort kristalltillväxtexperiment.
För detta ändamål presenteras två andra experiment som var skräddarsydda för att visa reversibiliteten hos de temperaturkontrollerade dialyskristalliseringsexperimenten med OptiCrys för nukleation, kristalltillväxt, upplösning och återväxt. Arbetsflödet för kristalltillväxtoptimering kontrollerades så att en enhetlig population av färre, större lysozymekristaller odlades, med hjälp av variation av temperatur eller utfällningskoncentration.
I det andra experimentet med OptiCrys hölls kristalliseringslösningens kemiska sammansättning konstant under hela experimentet (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Utgångstemperaturen sattes till 291 K. Resultaten av detta experiment sammanfattas i figur 10. På grund av hög övermättnad uppträdde ett stort antal små kristaller i kristalliseringskammaren (Figur 10, panelerna 1 och 2). I enlighet med begreppet direkt proteinlöslighet, genom att gradvis öka temperaturen till 313 K, löstes alla kristaller upp(figur 10,panelerna 3, 4 och 5). Slutligen, genom att sänka temperaturen till 295 K, inleddes den andra kärnan i närheten av den metastaserbara zonen och tillät kontrollerad bildning av ett lägre antal atomkärnor. Ytterligare kristalltillväxt resulterade i en enhetlig generation av en population av större kristaller(figur 10,panel 7).
Som visas i figur 11kan variation av kristalliseringslösningens kemiska sammansättning, vid en konstant temperatur av 291 K, också användas för att erhålla en enhetlig population av större kristaller. I likhet med det tidigare experimentet var det ursprungliga tillståndet 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-koncentrationen sänktes sedan gradvis från 0,9 M till noll för att lösa upp kristallerna(figur 11,panelerna 4 och 5). Vid denna tidpunkt ersattes NaCl helt av en buffertlösning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Att minska saltkoncentrationen håller lösningen i fasdiagrammets undermättade zon, vilket leder till upplösning av kristallerna. Sedan injicerades en ny kristalliseringslösning med lägre jonisk styrka, vid 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4, i reservoarkammaren. Vid denna fällningskoncentration uppträdde de första kärnorna(figur 11, panel 6) efter 90 minuter. Antalet genererade kristaller var lägre och kristallerna når en större volym(bild 11,panel 7) än tidigare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Bild 1: Schematiskt fasdiagram. Kinetiska banor för tre kristalliseringstekniker representeras i en saltning-out regim. Varje metod uppnår kärnor och kristallisering på olika sätt, visualiseras av en annan kinetisk väg genom fasdiagrammet för att nå nukleations- och metastaserbara zoner. Löslighetskurvan separerar undersaturerings- och övermättnadsområden. Supersaturation är indelad i tre zoner: metastaserbar, nukleation och nederbörd. I nukleationszonen sker spontan nukleation medan i den metastaserbara zonen sker kristalltillväxt. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk representation av kristalliseringsbänken (OptiCrys). LED-ljuskällan är placerad ovanpå den temperaturkontrollerade dialysflödescellen. Ett inverterat mikroskop och digitalkameran visas längst upp till höger på bilden med den röda pilen. Den röda cirkeln representerar kylslangens placering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figur 3: Schematiskt tvådimensionellt proteinkristalliseringsfasdiagram som en funktion av temperatur (A) och utfällningskoncentration (B). a) Vid ett protein med direkt löslighet håller temperatursänkningen kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen. Temperaturvariation kan upprepas flera gånger för att styra kristalltillväxtprocessen tills kristaller med önskad volym erhålls. (B) Ändring av koncentrationen av den utfällbara lösningen kan också användas för att hålla kristalliseringslösningen i metastaserzonen för odling av kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figur 4: Kristaller av lysozym som erhålls med dialysmetoden. Detta experiment utfördes vid en konstant temperatur av 293 K i 0,1 M natriumacetatbuffert pH 4. Att öka NaCl-koncentrationen från 0,7 M till 1,2 M ökar nukleeringshastigheten och resulterar i ett större antal kristaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figur 5: Översikt över proteinkristalliseringsprocessen med dialysmetoden. A) Genom att tillsätta proteinet i dialysknappens kammare skapas (B) en kupolform på kammarens översida. c) En applikator används för att överföra O-ringen till dialysknappens spår för att fixera dialysmembranet på plats. (D) Dialysknappen är klar för nedsänkning i reservoarlösningen. (E) Kristalliseringslösningen passerar genom det halvgenomsläppliga membranet och kristaller börjar bildas inuti kammaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Bild 6: Schematisk vy över den temperaturkontrollerade flytande dialysinställningen. A) Proteinprovet tillsätts dialyskammaren. B) Dialysmembranet är fastsatt på överkammaren med en O-ring med hjälp av en applikator. C) Överchambern vänds och fixeras på toppen av dialyskammaren. Vita pilar anger var skruvar placeras på överkammaren. D) Reservoarkammaren vänds medurs (E) och fixeras ovanpå överkammaren. F) Reservoarkammaren är täckt av ett lufttätt lock med kontakter till ett pumpsystem och (G) flödescellen placeras i mässingsstödet. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figur 7: Förberedelse och injektion av kristalliseringslösningen i behållaren med det fluidiska systemet (A). Rör som innehåller salt och vatten ansluts till tryck-/vakuumregulatorn (B) och till rotationsventilen (C). Genom att använda trycket skapar tryck-/vakuumregulatorn ett konstant flöde av vätskorna från rören till rotationsventilen. Varje vätska som passerar genom flödesmätaren (D) och strömbrytaren injiceras i blandningsröret (F). När alla vätskor har tillsatts blandningsröret injicerar omkopplaren genom vissa modifieringar den slutliga lösningen från blandningsröret i behållaren (G). Vätskan flödar genom systemet i pilarnas riktning i diagrammet markerat i stigande ordning (från 1 till 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figur 8: Underhållsvy av övervakningsprogramvaran. Den här vyn används för att styra olika parametrar som temperatur, ljus, kristalliseringslösning och zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figur 9: Fasdiagrammet som en funktion av temperaturen (valda bilder ska spåras i stigande ordning). En enda stor lysozymekristall erhålls genom att systematiskt ändra temperaturen från 295 K till 275 K. Vid varje steg stoppas kristalltillväxten när den når löslighetskurvan. Att minska temperaturen genom att hålla lösningen i den metastaserbara zonen startar om kristalltillväxten. Bilderna har olika nivåer av förstoring. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figur 10: Optimering av kristalltillväxt vid konstant kemisk sammansättning med hjälp av temperaturkontroll (utvalda bilder ska spåras i stigande ordning). Att starta nukleationsprocessen i nukleationszonen vid 291 K, långt från den metastaserbara zonen, resulterar i bildandet av många kristaller. Att öka temperaturen till 313 K löser sedan upp kristallerna tills inga synliga kärnor ses i dialyskammaren. Slutligen, att minska temperaturen till 295 K startar om nukleationsprocessen för andra gången vilket leder till ett begränsat antal större kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figur 11: Optimering av kristalltillväxten vid konstant temperatur med hjälp av variationer i utfällningskoncentrationen (utvalda bilder ska spåras i stigande ordning). Genom att minska den utfällande koncentrationen från 0,9 M till 0 M löses de kristaller som erhålls under den första nukleationshändelsen. Kristalliseringsprocessen startas om genom injektion av samma fällningsmedel men vid lägre jonisk styrka, 0,75 M, vilket leder till bildandet av några större kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Strukturella studier av biomacromolecules genom kristallografi kräver högkvalitativa kristaller. Här demonstrerar vi ett protokoll som kan användas av OptiCrys (ett helautomatiskt instrument utvecklat i vårt labb) och/eller mikrodialysknappar för odling av stora högkvalitativa kristaller baserat på kunskap om kristalliseringsfasdiagrammet.

Optimering av kristalltillväxt för neutronmakromolekylär kristallografi

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Det finns olika kristalliseringsmetoder för att få stora och högkvalitativa kristaller för både röntgen- och neutronkristallografi. En av dessa metoder är att använda dialysmetod. I denna teknik separeras proteinlösningen från en fällningslösning av ett halvgenomsläppligt membran.Fällmolekylerna sprider sig över membranet in i proteinkammaren. När rätt övermättnad för en spontan nukleation uppnås kommer de första kärnorna att visas. Här kommer vi att demonstrera ett protokoll som kan användas av OptiCrys ett helautomatiskt instrument utvecklat i vårt labb som använder temperaturkontrollerad dialyskristallisering, och våra mikrodialysknappar för odling av stora högkvalitativa kristaller för naturlig makromolekylär kristallografi baserad på kunskap om kristalliseringsfasdiagrammet.För en mikrodialysknapp med viss mikrolitervolympipett 35 mikroliter lysozymelösning i dialyskammaren. Denna extra volym skapar en något kupolform ovanpå dialyskammaren och förhindrar luftbubblabildning. Ta en applikator och placera resårbandet eller ringen i änden av den.Placera membranet ovanpå kammaren och fixera det genom att överföra resårbandet eller ringen från applikatorn till dialysknappens spår. Överför knappen till brunnen som innehåller kristalliseringslösningen. Täck brunnen med en glaskåpa eller en bit tejp.Förvara provet på 293 Kelvin i en vibrationsfri termisk regulatorinkubator. Med vetskapen om att dialyskristalliseringen erbjuder fördelar ur kristalltillväxtssynpunkt designades och utvecklades kristalliseringsbänken OptiCrys i vårt laboratorium för att erbjuda en helt automatiserad kombinerad kontroll av temperatur och kemisk sammansättning av det biomolekylära kristalliseringsexperimentet. Optimeringen av kristalltillväxten av OptiCrys baseras på temperaturutfällningsfasdiagrammen.Nukleation sker i nukleationszonen i närheten av den metastabila zonen och kristalltillväxten sker sedan i den metastaserbara zonen efter fasdiagrammet, tills proteinkoncentrationen når löslighetskurvan som representerar den termodynamiska jämvikten mellan lösning och kristaller. Genom att sänka temperaturen vid proteinet med direkt löslighet eller genom att öka den utfällande koncentrationen vid saltning ut nå, förblir kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen och ingen nukleation sker. Kristaller växer tills den andra kristalllösningsjämvikten uppnår och därefter observeras ingen ytterligare ökning av kristallens storlek.Att sänka temperaturen eller öka den utfällande koncentrationen upprepas flera gånger tills kristallerna når önskad storlek. Tillsätt proteinlösningen till dialyskammaren i den temperaturkontrollerade flytande uppsättningen, täck överkammaren med dialysmembranet och fixera membranet med resårbandet eller ringen. Vänd överkammaren och lägg den ovanpå dialyskammaren.Tryck försiktigt och långsamt för att ta bort all luft som är instängd mellan två delar, fixera behållaren i dess läge genom att försiktigt skruva den ovanpå överkammaren. Tillsätt kristalliseringslösningen i reservoarkammaren och täck den med det lufttäta locket. Överför denna montering och sätt in den i bröststödet på kristalliseringsbänken OptiCrys Crystal tillväxt är en övervakning programvara av Crystallization Bench OptiCrys.Den innehåller fyra olika grafiska gränssnitt eller vyer. Hemvyn innehåller knappar för att navigera till de andra vyerna. Syftet med inställningsgränssnittet är att definiera ett experimentscenario som kan köras automatiskt i testvyn.Den sista vyn är underhållsvyn. Om du vill starta om ett experiment måste underhålls vyn vara öppen där alla viktiga parametrar för smidig körning av kristalliserings experimenten hittas. Öka ljusstyrkan från ljussektionen, ljuset kan öka från noll, inget ljus till 100 maximal ljusstyrka.För att styra och övervaka temperaturen används temperaturregulatorsektionen. Klicka på knappen för att aktivera den. Ställ in temperaturen på bördpunktsavsnittet och tryck på retur.Under den här knappen finns två grafer. Den röda visar finalen, ordertemperaturen och det gula diagrammet visar aktuell temperatur. Blandning av en stamlösning, en injektion av kristalliseringslösningen till reservoarkammaren styrs av Palm-sektionen.Tillsätt koncentrationen av stamlösningen i det första steget. Hitta sedan den slutliga koncentrationen av varje ny grouperlösning och lägg till dem i det slutliga koncentrationsavsnittet. När du har tryckt på beräkningsknappen beräknas ta reda på volymen av lagerlösningen och lägg till volympanelen framför varje koncentrationspanel.Tryck på startförberedelseknappen och vänta tills den nya främsta lösningen är klar. Om du vill byta kristalliseringslösning klickar du på knappen Lösningsinmatning. Om du vill stoppa processen trycker du på knappen Stoppa distribution.På höger sida av mikroskopsektionen finns det flera paneler för att registrera viktig information från varje kristalltillväxtexperiment. Lägg till motsvarande proteinnamn, molekylvikt och kristalliseringstillstånd i det här avsnittet. Definiera ett namn på dina experiment genom att helt enkelt skriva det på mappnamnet.I avsnittet nb-bilder väljer du antal bilder som ska tas under experimentet. Lägg till antalet bilder och välj timerskalan från panelen till höger. Klicka på mappknappen för att öppna mappen.I den här mappen finns en textfil som innehåller all information som du tidigare har definierat för experimentet. Bilder som är redo för ytterligare behandling sparas också i den här mappen. Zooma av mikroskopet kan också varieras automatiskt.Ändrar din zoom genom att använda plus- och minusknappen ovanpå mikroskopavsnittet för att öka eller minska förstoringen. Det finns tre olika sätt att mäta kristallstorleken. För att mäta längden eller bredden använd breddvektorn.Beroende på kristallformen kan de specifika verktygen från den vänstra delen av mikroskopsektionen väljas. Till exempel en rektangulär eller polygon. Värdena visas i måttavsnittet.I den första uppsättningen experiment var mikrodialysknapparna nedsänkta i kristalliseringslösningarna med olika saltkoncentrationer. I detta enkla kristalliseringsnätexperiment är den enda variabeln utfällbar koncentration. medan temperaturen hålls konstant.Små variationer i saltkoncentrationen gör det möjligt att undersöka kristalliseringsfasdiagrammet genom att öka saltkoncentrationen från 0, 7 till 1, 2 molar övermättnad ökar och lösningen i nukleationszonen rör sig bort från den metastaserbara zonen. Följaktligen observeras en variation i storlek och antal kristaller med antalet kristaller som ökar och deras storlek minskar. I det första experimentet med OptiCrys under det givna experimentella tillståndet, när jämvikten i dialyskammaren når, ligger kristalliseringslösningen i nukleationszonen i närheten av kristalliseringsfasdiagrammets metastaserbara zon.Som ett resultat genereras endast ett fåtal atomkärnor under experimentet första stadiet. För att hålla tillväxten av kristaller i den metastaserbara zonen och kontrollera kristalltillväxtprocessen ändrades temperaturen med olika tidsintervall. Varje gång kristalllösningens jämvikt slutfördes varierades temperaturen.Därför sjönk temperaturen till 291 Kelvin, 288 Kelvin och slutligen 275 Kelvin för att upprätthålla tillväxten av vald kristall i den metastaserbara zonen. Resultatet av detta experiment är en enda stor kristall, med den volym som krävs för naturlig makromolekylär kristallografi. Nästa två experiment visar reversibiliteten hos de temperaturkontrollerade dialysexperimenten för nukleation, kristalltillväxt, upplösning och återväxt.I det andra experimentet med OptiCrys hölls kristalliseringslösningens kemiska sammansättning konstant genom experimentet och temperaturen varierade. Den ursprungliga temperaturen sattes till 291 Kelvin. På grund av hög övermättnad uppträdde ett stort antal små kristaller i kristalliseringskammaren.I enlighet med begreppet direkt proteinlöslighet, genom att gradvis öka temperaturen till 313 Kelvin skulle alla kristaller lösas upp. Slutligen, genom att sänka temperaturen till 295 Kelvin, den andra kärnan initierad i närheten av den metastaserbara zonen och tillåten att kontrollera nukleationsprocessen som resulterar i form av lägre antal kärnor. Ytterligare kristalltillväxt tillät att generera den enhetliga populationen av större kristaller.I detta experiment leder en ändring av kristalliseringslösningens kemiska sammansättning vid konstant temperatur till att få en enhetlig population av större kristaller. Kristallisering villkoret liknade det tidigare experimentet. Upplösning kristallerna uppnåddes genom att gradvis sänka NaCl koncentrationen från 0,9 molar till noll.Att minska saltkoncentrationen håller lösningen i fasdiagrammets undermättade zon, vilket leder till upplösning av kristallerna. Sedan injicerades den nya kristalliseringslösningen med lägre jonstyrka än tidigare i reservoarkammaren. Vid denna fällningskoncentration uppträder det lägre antalet kristaller och kristallerna når en större volym än tidigare.Här tillhandahöll vi ett detaljerat protokoll som beskriver provberedning och justering av kontrollprogramvaran för odling av stora och högkvalitativa kristaller för naturlig makromolekylär kristallografi med hjälp av ett helautomatiskt instrument utvecklat i vårt labb. Denna steg-för-steg förfarande utformades och dra nytta av kunskapen om kristallisering fas diagram för att separera nukleation och kristall tillväxt. Dessutom presenteras ett protokoll för odling av kristaller med mikrocytosmönster också med makrocytosknappar som ett alternativ när OptiCrys inte är tillgängligt.Förutom de strategier som jag nämnde för OptiCrys bör ändra kristalliseringslösningens och temperaturens kemiska sammansättning och ta bilder göras manuellt. Att använda den termiska reglerade vibrationen för inkubatorn för att hålla temperaturen konstant krävs, vilket är ett kritiskt steg i den metod som demonstreras.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Protein Kristallisering för röntgenkristallografi

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering och Biofysikalisk studie av frukt nagelband

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In vitro analys av PDZ-beroende Signaling CFTR makromolekylära komplex

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Iterativ Optimering av DNA-duplex för Kristallisation av SeqA-DNA-komplex

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produktion av Human Norovirus utskjutande domäner i<em&gt; E. coli</em&gt; För röntgenkristallografi

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...