Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS, LABEX VALO GRAL'ın 2015 sözleşmesi kapsamındaki desteğini kabul etmektedir. NJ, Doktora Bursu için CEA'nın Uluslararası Doktora Araştırma Programını (Irtelis) kabul eder. Yazarlar, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması olan 722687 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan fon sağladığını kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca yardımcı konuşmalar ve içgörüler için Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) ve Dr Jean-Luc Ferrer'e (IBS, Grenoble) minnettardır. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder.

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Farklı fiziksel, kimyasal ve biyolojik değişkenler protein çözünürlüğü etkileyerek protein kristalizasyonunu etkiler21. Bu değişkenler arasında, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklık ve kimyasal bileşimi, nötron kırınım çalışmaları için biyomacrooleküllerin büyük yüksek kaliteli kristallerini iyileştirmek ve büyütmek için diyaliz tekniği ile birlikte kullanılmaktadır. Faz diyagramları bilgisi kullanılarak kristalizasyon daha öngörülebilir hale getirilir. Farklı kristalleşme koşullarının seri bir yaklaşımla taranması da mümkün olsa da, sunulan rasyonel yaklaşımların kullanılmasının temel amacı kristal çekirdeklenme ve büyümenin kinetiğini ayırmak ve kontrol etmektir.
Tüm kristalizasyon çalışmalarına benzer şekilde, yüksek kaliteli saf ve homojen protein örnekleri ve tozsuz kristalizasyon çözümleri deneyin başarı oranını arttırır. Çözümlerin filtrasyonu ve santrifüjlenmesi, açıklanan protokollerde önemli adımlardır. Moleküler ağırlık (uygun diyaliz zarını seçmek için), izoelektrik nokta ve protein çözünürlüğü gibi çalışılan proteinlerin fizikokimyasal özelliklerini bilmek, optimal bir kristal büyüme deneyinin tasarımı için çok önemlidir. Ayrıca, numune kaybını önlemek ve başarı olasılığını artırmak için farklı sıcaklıklarda veya farklı kimyasallarla protein stabilitesi için dikkate alınmalıdır. OptiCrys'in sıcaklık aralığı (233.0–353.0 ± 0.1 K) göz önüne alındığında, çok çeşitli proteinler kullanılarak kristalize edilebilir. Ancak, termofilik kaynaklardan elde edilen proteinler gibi öncelikle termo-stabil olan proteinlerin, bu cihaz tarafından sunulan sıcaklık kontrollü büyük hacimli kristal büyüme deneylerinde en çok fayda sağlayacağını vurgulamak gerekir.
Düşük hacimli bir diyaliz odası (OptiCrys kullanırken) veya mikrodiyaliz düğmeleri kullanarak ve çeşitli sıcaklıkları ve kristalizasyon koşullarını (örneğin, çökelti konsantrasyonu veya pH ızgaraları) tararken, metastable bölgenin sınırının (çekirdeklenme ve metastable bölgeler arasındaki kinetik denge) yeri hakkında bilgi edinmek mümkündür. Bu, özellikle kristalizasyonda yeni protein adayları için başarılı bir kristal büyüme deneyi tasarlarken paha biçilemez. Bu bilgi olmadan deneyler, kristal çekirdeğini kolayca kontrol etmek için metastable bölgenin sınırından çok uzak, yüksek doymamışlık ile faz diyagramının bir alanından başlayabilir. Protein çökeltisinin çözünmesine çalışılsa da, örneğin doğrudan çözünürlük durumunda sıcaklığı artırarak, termositesi azaltılmış proteinler için, numuneyi daha uzun süre yüksek sıcaklıkta tutmak protein çökeltmesini geri döndürülemez hale getirebilir. Bu nedenle, en iyi strateji, çekirdeklenmenin kontrol edilebildiği ve protein yağışının önlenebileceği metasabiliyet sınırına yakın bulunan daha düşük aşırı doymalı bir başlangıç koşulu kullanmaktan oluşur. Bu doğrultuda kristalizasyon önscreeningi diyaliz odasında protein çökeltme şansını azaltır ve deneyin başarı oranını artırır.
Bir deney tasarladıktan sonra, diyaliz odaları (OptiCrys) veya mikrodiyaliz düğmeleri hazırlamak bir başka önemli adımdır. Diyaliz haznesinde/butonunda hava kabarcığı oluşumunun önlenmesi özellikle küçük hacimler kullanıldığında başarılı kristalleşme şansını artırır. Diyaliz odasında hava kabarcıklarının varlığı da kristalleşme sürecinin kinetiğini değiştirebilir ve deneyin tekrarlanabilirliğini azaltabilir (çünkü protein/ çözelti temas yüzeyi değiştirilmiştir). Sadece protein değil, kristalizasyon çözeltisi de deneyin başarısını etkileyebilir. Her deneyden sonra pompalama sistemi için yeni 50 mL tüpler kullanmak ve her deneyden sonra boru yıkamak, kontaminasyon olasılığını azaltır ve aparatta tuz kristallerinin oluşturulmasını önler.
OptiCrys mevcut olmadığında mikrodiyaliz düğmelerinin kullanımı bir alternatiftir. Yukarıda belirtilen kristalizasyonu optimize etme ve kristal büyümesini izleme stratejileri manuel olarak gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak bu, sıcaklık düzenlemesi açıklanan metodolojide kritik bir adım olduğunda sorunlu olabilen bir termoregülasyonlu inkübatörün dışında olmayı gerektirir. Bu, kristalizasyon çözeltilerinin kimyasal bileşimini değiştirmeyi veya kristal büyümesini görüntüleme ile izlemeyi kolaylaştırmaz, bu nedenle kristal büyüme süreci gerçek zamanlı olarak kontrol edilemez.
Faz diyagramının bilgisi, kristalizasyon tezgahı OptiCrys'i otomatik bir şekilde sistematik olarak büyük, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanmanın temelidir. Kristalizasyon sırasında sıcaklık, çökelti konsantrasyonu ve pH gibi fizikokimyasal parametrelerin kontrolü, protein çözeltisi dengesini faz diyagramında iyi tanımlanmış bir kinetik yörüngede hareket ettirir. Bu, kütle taşımacılığını ayarlamak ve kristalizasyon odasında kristallerin boyutunu ve kalitesini etkileyen kontrollü bir gradyan oluşturmak için bir diyaliz zarının kullanılmasıyla tamamlanır. Bu nedenle, hem termodinamik verileri hem de kinetik yörüngeleri kullanmak, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kristalleşme sürecini kontrol etmek için gereklidir. OptiCrys sayesinde, çok boyutlu bir alandaki sistematik faz diyagramları, öncekinden önemli ölçüde daha az malzeme kullanılarak seri bir yaklaşımla incelenebilir. Bu metodolojiyi göstermek için, burada bir model protein, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme ile bir vaka çalışması sunuyoruz. Burada sunulan protokolü kullanarak ve ustalayarak gerçek proteinsistemlerineuyarlayabilir 5,14,17,18.

Proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisini ve fizyolojik yolların mekanizmasını anlamak genellikle hidrojen atomlarının (H) konumlarını ve yükün bir protein içinde nasıl aktarıldığınıbilmeyedayanır1,2. Hidrojen atomları X ışınlarını zayıf bir şekilde dağıttığından, konumları sadece çok yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınım verileri (>1 Å)3,4ile belirlenebilir. Tersine, nötron kristalografisi hidrojen ve döteryum (H2,hidrojen izotopu) atomlarının oksijen, azot ve karbon5olarak kabaca eşit büyüklükte saçılma uzunluklarına sahip olması nedeniyle biyolojik makromoleküllerde hidrojen atomlarının doğru bir konumunu elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mevcut nötron kaynaklarından gelen nötron akısı X-ışını ışınlarından daha zayıftır, bu nedenle bu genellikle2,3için telafi edilmelidir. Bu, H2 ile H alışverişi ve / veya hidrojenlerin tutarsız saçılmasını azaltmak ve kırınım görüntülerinin sinyal-gürültü oranını artırmak için kristallerin hacmini artırarak elde edilebilir.
Hem X-ışını hem de nötron biyo-makromoleküler kristalografi için büyük ve yüksek kaliteli kristaller elde etmek için çeşitli kristalleşme yaklaşımları vardır (ilgili şematik faz diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir6. Buhar difüzyonunda, bir protein ve kristalizasyon çözeltisinin karışımından hazırlanan bir damlacık, zaman içinde, su veya diğer uçucu türlerin buharlaşması yoluyla, aynı kristalizasyon çözeltisinin daha yüksek bir çökelti konsantrasyonunu içeren bir rezervuara karşı denge edilir. Damlacıktaki protein ve çökelti konsantrasyonundaki artış, spontan çekirdeklenme için gerekli olan aşırı doyma ve ardından bu çekirdeklerde kristal büyümesine yol açar6,7. Buhar difüzyonu kristal yetiştirmek için en sık kullanılan teknik olmasına rağmen4, kristalizasyon işlemi tam olarak kontrol edilemez8. Serbest arayüz difüzyon yönteminde, kristalizasyon çözeltisi konsantre bir protein çözeltisine yayılır ve sistemi çok yavaş bir şekilde aşırı doygunluğa yönlendirir. Bu yöntem, yavaş karıştırma hızı6, 9 , 10,11,12olan bir toplu iş yöntemi olarak düşünülebilir. Parti yönteminde, protein hızla aşırı doymaya yol açan bir kristalizasyon çözeltisi ve buna karşılık birçok kristal ile tekdüze çekirdeklenme ile karıştırılır3,7. Bu yöntem, şu anda Protein Veri Bankası'na yatırılan tüm yapıların yaklaşık üçte birini oluşturmuştır. Diyaliz yöntemi aynı zamanda yüksek kaliteli ve iyi dağınık protein kristalleri yetiştirmek için de kullanılır. Diyaliz yönteminde, çökelti molekülleri bir rezervuardan yarı geçirgen bir membrandan protein çözeltisi ile ayrı bir odaya yayılır. Denge kinetiği sıcaklık, membran gözenek büyüklüğü ve protein örneklerinin ve kristalizasyon ajanlarının hacmi ve konsantrasyonu gibi çeşitli faktörlere bağlıdır6.
Kristalizasyon faz diyagramları, bir proteinin farklı durumlarını farklı fiziksel veya kimyasal değişken3'ünbir işlevi olarak tanımlamak için kullanılabilir. Şekil 1'degösterildiği gibi, her kristalizasyon tekniği, böyle bir diyagram6, 10,13'ünçekirdeklenme ve metastable bölgelerine ulaşmak için farklı bir kinetik yörünge kullanılarak görselleştirilebilir. Bu, protein çözünürlüğü ve kristal ile çözelti arasındaki termodinamik dengenin gözlendiği protein konsantrasyonu hakkında bilgi sağlar, böylece çekirdeklenme ve büyüme için en uygun koşulları bulur3,14. İki boyutlu faz diyagramında, protein konsantrasyonu bir değişkenin işlevi olarak çizilir ve diğer değişkenler sabit tutulur15. Böyle bir faz diyagramında, protein konsantrasyonu çözünürlük eğrisinin altında olduğunda, çözelti az doymamış bölgededir ve çekirdeklenme veya kristal büyümesi gerçekleşmez. Bu eğrinin üzerinde, protein konsantrasyonunun çözünürlük sınırı3,14'tendaha yüksek olduğu aşırı doyma bölgesi vardır. Bu daha sonra üç bölgeye ayrılır: metastable bölge, spontan çekirdeklenme bölgesi ve yağış bölgesi. Metastable bölgede, aşırı doyma, çekirdeğin makul bir süre içinde gerçekleşmesi için yeterli değildir, ancak tohumlu kristallerin büyümesi gerçekleşebilir. Aşırı doymanın çok yüksek olduğu yağış bölgesinde toplama ve yağış tercih edilir14,15.
Spontan çekirdeklenme için yeterli aşırı doyma sağlandığında, ilk çekirdek10görünecektir. Kristallerin büyümesi, çözünürlük sınırına ulaşılana kadar protein konsantrasyonunda bir azalmaya yol açar. Aşırı doyma, çözünürlük eğrisinin yakınında kaldığı sürece, kristallerin boyutunda önemli bir değişiklik olmayacaktır. Bununla birlikte, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklığındaki ve kimyasal bileşimindeki varyasyonların (örneğin, çökelti konsantrasyonu) protein çözünürlüğünü etkileyeceği ve daha fazla kristal büyümesinin başlatılmasına yol açabileceği gösterilmiştir8,13,16.
Diyaliz kaliteli kristal büyümesi için avantajlı olduğundan, Şekil 2'degösterilen OptiCrys kristalizasyon tezgahı, kristalleşmeyi tam otomatik bir şekilde kontrol etmek için laboratuvarımızda tasarlanmış ve geliştirilmiştir8. Bu amaçla LabVIEW ile Peltier elemanları ile temas halinde akan rezervuar diyaliz kurulumunun sıcaklığının elektronik kontrolör ve soğutucu aracılığıyla kontrol ve izlenmesini sağlayan bir yazılım yazılmıştır. Aynı yazılım ayrıca çok kanallı akışkan bir sistem kullanarak kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini (örneğin kristalizasyon ajanlarının değişimi) otomatik olarak düzenler. Ayrıca, kristalizasyon işlemini görselleştirmek ve kaydetmek için dijital kamera ve ters mikroskop kullanılır. Farklı amaçlar için kristal yetiştirmek için 15 μL ve 250 μL hacimli iki kristalizasyon odası mevcuttur. Kristalizasyon işlemi tersine çevrilebilir olduğundan, numune zarar görmediği sürece protein çözeltisinin sadece birkaç mikrolitresi ile farklı koşullar için tarama mümkündür8. Sonuç olarak, bu yöntemin kullanılması kullanılan protein malzemesi miktarını en aza indirir.
Önceki çalışmalardan8Kristal büyüme sürecinde, yerinde gözlemlerin düzenli zaman aralıklarında yapılması gerektiği açıktır. Bunlar, gözlem altındaki olaya (yağış, çekirdeklenme veya kristal büyümesi) bağlı olarak birkaç saniye ile birkaç gün arasında değişebilir.
OptiCrys ile kristal büyümesinin optimizasyonu, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon fazı diyagramlarına dayanmaktadır. Sıcaklığın doğrudan bir işlevi olarak çözünürlüğe sahip proteinler söz konusu olduğunda, tuzlama rejiminden yararlanmak mümkündür18. Bu, protein-çökağan faz diyagramları kullanılarak görselleştirilebilen çözeltinin iyonik gücünün artırılmasının proteinin çözünürlüğünü azalttığı yerdir. Aynı şekilde, ters çözünürlüğe sahip proteinler tuzlama rejiminden yararlanabilir18. Çekirdeklenme çekirdeklenme bölgesinde, metastable bölgesinin yakınında gerçekleşir ve kristal büyümesi daha sonra protein konsantrasyonu çözünürlük sınırına ulaşana kadar faz diyagramının metastable bölgesinde gerçekleşir. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, yeni çekirdeklenmeyi önlemek için kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutmak için sabit kimyasal bileşim sıcaklığı azaltılabilir. Kristaller ikinci kristal/çözelti dengesi elde edilene kadar büyür ve bundan sonra kristallerin boyutunda daha fazla artış gözlenmez. Kristaller istenen boyuta ulaşana kadar sıcaklık birkaç kez azalır. Şekil 3B'de , sabit sıcaklıkta, çökelti konsantrasyonu arttırılması çözeltiyi metastable bölgesinde tutar. Bu işlem daha sonra büyük kristaller elde etmek için birkaç kez tekrarlanabilir. Sıcaklığı değiştirmek ve kristalizasyon çözüm koşullarını manipüle etmek, aşırı doyma seviyelerini kontrol ederek, OptiCrys 5,8,14tarafındantam ve otomatik olarak kontrol edilen kristallerin çekirdeklenme ve büyümesini ayırmak için iki güçlü araçtır.
Literatürde ve PDB'de sıcaklık kontrollü veya sıcaklık ve çökelti konsantrasyon kontrollü kristalleşme ile yetiştirilen protein kristallerinin yanı sıra elde edilen göreceli kırınım verileri örnekleri mevcuttur. Bunlar arasında insan γ-kristalin E, PA-IIL lectin, maya inorganik pirofosfataz, ürat oksidaz, insan karbonik anhidraz II, YchB kinaz ve laktat dehidrogenaz5,14,17,18bulunmaktadır.
OptiCrys NatX-ray ile ticarileştirilmiş olsa da, bu cihaza veya sunduğu seri yaklaşıma erişimi olmayan birçok laboratuvar vardır. Bu tekniğin alternatifi, çeşitli hacimlerde ticari olarak kullanılabilen plastik mikrodiyaliz düğmelerini kullanmaktır. Bunları kullanarak, sıcaklık ve kimyasal bileşim manuel olarak ayarlanabilir ve değiştirilebilir. Mikrodiyaliz düğmelerinin muayenesi yerinde yapılamaz ve bunun yerine optik mikroskopla manuel olarak yapılmalıdır. Numuneyi titreşimsiz sıcaklık kontrollü bir inkübatörde tutarak sıcaklık kontrolü sağlanabilir. Kristalizasyon deneylerinin tekrarlanabilir olmasını sağlamak için sıcaklığı sabit tutmak önemlidir. Sıcaklıktaki önemli değişim kristallerin zarar görmesine veya tahrip olmasına da neden olabilir5.
Burada, nötron protein kristalografisi için uygun büyük, yüksek kaliteli kristallerin büyümesi için numune hazırlama ve kontrol yazılımının kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu adım adım prosedür, oluşturulan kristallerin boyutunu ve kalitesini kontrol etmek için bir başlangıç pozisyonu ve kinetik yol seçmek için kristalizasyon faz diyagramından yararlanmak için tasarlanmıştır. Ek olarak, büyük, yüksek kaliteli kristaller elde etmek için aynı mantığı kullanan mikrodiyaliz düğmeli kristallerin yetiştirilmeleri için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Nötron makromoleküler kristalografinin (NMX) kullanımı, inşa edilen yeni NMX kiriş hatları ve yapı iyileştirme yazılımının kullanılabilirliğinin artması sayesinde son on yılda belirlenen çoğu yapıyla hızla genişliyor. Bununla birlikte, şu anda NMX için mevcut olan nötron kaynakları, X-ışını kristalografisi için eşdeğer kaynaklardan önemli ölçüde daha zayıftır. Bu alandaki gelişmelere rağmen, nötron kırınım çalışmaları için, özellikle de daha büyük makromolekülleri ve kompleksleri inceleme eğilimi ile her zaman önemli ölçüde daha büyük kristaller gerekecektir. Bu nedenle, NMX'in genişlemesi için daha büyük kristaller yetiştirmeye uygun yöntemler ve enstrümantasyonda daha fazla iyileştirme yapılması gerekir.
Bu çalışmada, laboratuvarımızda geliştirilen ve mikroskopla monte edilmiş bir video kamera aracılığıyla gerçek zamanlı gözlemi kristalizasyon çözeltilerinin hassas otomatik kontrolüyle (örneğin, çökelti konsantrasyonu, pH, katkı maddesi, sıcaklık) birleştiren rasyonel stratejiler ve bir kristal büyüme tezgahı (OptiCrys) sunuyoruz. Daha sonra bu sıcaklık ve kimyasal bileşim kontrolünün model çözünür proteinleri kullanarak optimum kristalizasyon koşullarının aranmasını nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Kristalizasyon faz diyagramı hakkında kapsamlı bilgi, herhangi bir kristalizasyon deneyi için başlangıç konumunu ve kinetik yolu seçmek için çok önemlidir. Rasyonel bir yaklaşımın, çok boyutlu faz diyagramlarının bilgisine dayanarak üretilen kristallerin boyutunu ve sayısını nasıl kontrol edebileceğini gösteriyoruz.

Bölüm 2.3 ve 2.4'te, cihazın kullanımını ve büyük kristalleri büyütmek için deneysel bir tasarımı gösteren optimize edilmiş kristal büyümesinin üç örneği sunulmuştur. Bu gösteri için, kristal büyüme deneyleri bu yöntemi kullanarak diğer birçok protein sistemiyle başarıyla gerçekleştirilmesine rağmen, lysozyme'ı bir model protein olarak kullandık (yukarıya bakın). Burada sunulan protokolü kullanarak ve ustalayarak diğer protein adayları için uyarlanabilir.
Bölüm 2.3'te, yerleşik rasyonel kristalleşme stratejilerinin nötron proteini kristalografisi için yeterli saçılma hacimlerine sahip kristallerin yetiştirilmesinde faydalı olabileceğini gösterdik. Burada, önerilen rasyonel optimizasyon stratejilerinin, aşağı akış yapısı belirleme yaklaşımları için gereken belirli bir boyutta tekdüze bir kristal popülasyonunun üretilmesine de izin verdiğini gösteriyoruz.
Bu iki deney, kristal çekirdeklenme ve büyümeyi kontrol etmede faz diyagramlarının önemini vurgulamak için tasarlanmıştır. Burada, kristalizasyon çözeltilerinin sıcaklığının ve kimyasal bileşiminin gerçek zamanlı olarak kristalizasyon sürecinin izlenmesi ile birlikte kontrol edilmesi, nitel faz diyagramını incelemek için kullanılır. Bu yöntem kullanılarak, çekirdeklenme ve kristal büyümesi rasyonel olarak geri döndürülebilir bir şekilde optimize edilebilir. Böyle bir seri yaklaşımın kullanılması, protein miktarını ve kristallerin boyutunu ve kalitesini kontrol etmek için gereken süreyi de azaltır.
Diyaliz yönteminde, bir protein çözeltisi kristalleşme çözeltisinden yarı geçirgen bir membran6 (Şekil 5)ile ayrılır. Bu diyaliz zarı, katkı maddeleri, tampon ve iyonlar gibi küçük moleküllerin zardan geçmesine izin verir, ancak proteinler6,20gibi makromoleküllerden geçmez. Bu özellik, kristalizasyon çözeltisinin deney sırasında değiştirilmesini sağlar6. Çözümün değişimi manuel olarak, örneğin mikrodiyaliz düğmelerinde veya bu amaç için geliştirilen bir cihaz kullanılarak otomatik bir şekilde yapılabilir, OptiCrys8.
İlk deney setinde, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme kristalizasyonu için mikrodiyaliz düğmeleri kullanılmıştır. Mikrodiyaliz düğmeleri farklı tuz konsantrasyonlarına sahip kristalizasyon çözeltilerine daldırıldı. Bu basit kristalizasyon ızgarası deneyinde, sıcaklık sabit tutulurken tek değişken çökelti konsantrasyonudur (293 K). Şekil 4'tegösterildiği gibi, tuz konsantrasyonundaki hafif farklılıklar, gözlenen kristallerin boyutunda ve sayılarında bir değişikliğe neden olur ve kristalleşme faz diyagramının araştırılmasına izin verir. Şekil 4, panel 1'de, kristalizasyon çözeltisi 0.7 M NaCl içerir ve düğmelerde sınırlı sayıda daha büyük kristal ortaya çıkmıştır. Tuz konsantrasyonunu 0,7'den 1,2 M'ye yükselterek, aşırı doyma artar ve çekirdeklenme bölgesindeki çözelti metastable bölgeden uzaklaşır(Şekil 4, paneller 1 ila 6). Sonuç olarak, kristallerin sayısı artar ve boyutları azalır.
Sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyonunu sağlayan tam otomatik bir cihazla yapılan ilk deneyde, OptiCrys (Şekil 9), kristal büyüme deneyi büyük kristal büyümesi oluşturmak için özel olarak tasarlanmıştır. Deney, 0.75 M NaCl ve 0.1 M Na asetat tampon pH 4 içeren bir kristalizasyon çözeltisi ile 295 K başlangıç sıcaklığında başlatıldı. Bu deneysel koşullar altında kristalizasyon çözeltisi faz diyagramının metastable bölgesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesine ulaşmıştır (Şekil 9, ok 1). Sonuç olarak, deneyin ilk aşamasında sadece birkaç çekirdek üretildi. Seçilen kristalleri daha da büyütmek için (Şekil 9'dagösterilmiştir), kristal büyüme optimizasyonu iş akışı, kristal çözelti dengesine ulaşılır ulaşılmaz sıcaklık değiştirilerek metastable bölgeye doğru yönlendirilmiştir.
Kristal ve çözelti arasındaki dengeye her ulaşıldığı zaman, kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutmak için sıcaklık önce 291 K'ya, sonra 288 K'ye ve son olarak 275 K'ya düşürüldü. Bu deneyin sonucu, hem makromoleküler röntgen hem de nötron kristalografisi için uygun tek bir büyük kristaldir.
Çoğu protein için, kristalizasyon deneyleri sırasında protein konsantrasyonunu doğru bir şekilde ölçebilen (veya kristalizasyon işlemini gerçek zamanlı olarak gözlemleyebilen / tespit edebilen) deneysel cihazların eksikliği nedeniyle hassas nicel faz diyagramı (veya sadece nitel bir diyagram) henüz elde edilmiştir18. Sonuç olarak, deneyi, kristalleşmenin faz diyagramının en uygun alanında, metastable bölgenin yakınında başlayacak şekilde tasarlanması genellikle mümkün değildir.
Bu nedenle, büyük hacimli bir kristalin büyümesine adanmış deney yapılmadan önce bir kristalizasyon optimizasyonu çalışması yapılmalıdır. Bu çalışmada, bir yandan sıcaklık değişimleri (sabit kimyasal bileşimde) ve diğer yandan kimyasal bileşimdeki (sabit sıcaklıkta) varyasyonlar kullanılarak, metastable bölgeyi tanımlamak ve büyük bir kristal büyüme deneyine başlamak için en uygun koşulları tanımlamak gerekir.
Bu amaçla, OptiCrys ile yapılan sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyon deneylerinin çekirdeklenme, kristal büyümesi, çözülme ve yeniden büyüme için tersine çevrilebilirliğini göstermek için özel olarak hazırlanmış iki deney daha sunulmaktadır. Kristal büyüme optimizasyonu iş akışı, sıcaklık veya çökelti konsantrasyonu varyasyonu kullanılarak daha az, daha büyük lysozyme kristallerinden oluşan tekdüze bir popülasyonun yetiştirilmesi için kontrol edildi.
OptiCrys ile yapılan ikinci deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimi deney boyunca sabit tutuldu (0,1 M CH3COONa pH 4'te 0,9 M NaCl) değişken sıcaklıkta. İlk sıcaklık 291 K olarak belirlendi. Bu deneyin sonuçları Şekil 10'da özetlenmiştir. Yüksek aşırı doyma nedeniyle, kristalleşme odasında çok sayıda küçük kristal ortaya çıktı(Şekil 10, paneller 1 ve 2). Doğrudan protein çözünürlüğü kavramına uygun olarak, sıcaklığı kademeli olarak 313 K'ye çıkararak, kristallerin tümü çözülmüştür(Şekil 10, paneller 3, 4 ve 5). Son olarak, sıcaklığın 295 K'ye düşürülmesiyle, metastable bölgenin yakınında ikinci çekirdeklenme başlatıldı ve daha az sayıda çekirdeğin kontrollü bir şekilde oluşmasına izin verildi. Daha fazla kristal büyümesi, daha büyük kristal popülasyonunun düzgün bir şekilde üretilmesine neden oldu(Şekil 10, panel 7).
Şekil 11'degösterildiği gibi, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşiminin 291 K sabit sıcaklıkta varyasyonu, aynı şekilde daha büyük kristallerin tekdüze bir popülasyonunu elde etmek için kullanılabilir. Önceki deneye benzer şekilde, ilk durum 0.1 M CH 3 COONa pH 4'te0.9M NaCl idi. NaCl konsantrasyonu daha sonra kristalleri çözmek için kademeli olarak 0,9 M'den sıfıra düşürüldü(Şekil 11, paneller 4 ve 5). Bu noktada, NaCl tamamen 0.1 M CH 3 COONa pH4tampon çözeltisi ile değiştirildi. Tuz konsantrasyonunun azaltılması, çözeltiyi faz diyagramının az doymamış bölgesinde tutar ve bu da kristallerin çözünmesine yol açar. Daha sonra, rezervuar odasına 0,1 M CH3COONa pH 4'te 0,75 M NaCl'de daha düşük iyonik mukavemetli yeni bir kristalizasyon çözeltisi enjekte edildi. Bu çökağacı konsantrasyonda, ilk çekirdek 90 dakika sonra ortaya çıktı (Şekil 11, panel 6). Üretilen kristallerin sayısı daha düşüktü ve kristaller öncekinden daha büyük bir hacme(Şekil 11, panel 7) ulaşıyordu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Şekil 1: Şematik faz diyagramı. Üç kristalizasyon tekniği için kinetik yörüngeler tuzlama rejiminde temsil edilir. Her yöntem, çekirdeklenme ve metastable bölgelere ulaşmak için faz diyagramında farklı bir kinetik yol ile görselleştirilerek çekirdeklenme ve kristalleşmeyi farklı bir şekilde elde eder. Çözünürlük eğrisi, az doyma ve aşırı doyma bölgelerini ayırır. Aşırı doyma üç bölgeye ayrılır: metastable, çekirdeklenme ve yağış. Çekirdeklenme bölgesinde, spontan çekirdeklenme gerçekleşirken metastable bölgede kristal büyümesi gerçekleşir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Şekil 2: Kristalizasyon tezgahının şematik gösterimi (OptiCrys). LED ışık kaynağı, sıcaklık kontrollü diyaliz akış hücresinin üstünde bulunur. Ters bir mikroskop ve dijital kamera kırmızı okla görüntünün sağ üst kısmında gösterilir. Kırmızı daire, soğutucu borunun yerini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Şekil 3: Sıcaklık (A) ve çökelti konsantrasyonunun (B) bir fonksiyonu olarak şematik iki boyutlu protein kristalizasyon faz diyagramı. (A) Doğrudan çözünürlükte bir protein olması durumunda, sıcaklığın azaltılması kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutar. İstenilen hacme sahip kristaller elde edilene kadar kristal büyüme sürecini kontrol etmek için sıcaklık değişimi birkaç kez tekrarlanabilir. (B) Çökelti çözeltisinin konsantrasyonunu değiştirmek, kristalleşme çözeltisini kristalleşmeyi kristallerin yetiştirilmesi için metastable bölgede tutmak için de kullanılabilir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Şekil 4: Diyaliz yöntemi kullanılarak elde edilen lysozyme kristalleri. Bu deney 0,1 M sodyum asetat tampon pH 4'te 293 K sabit sıcaklıkta gerçekleştirildi. NaCl konsantrasyonunu 0,7 M'den 1,2 M'ye çıkarmak çekirdeklenme oranını arttırır ve daha fazla sayıda kristalle sonuçlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Şekil 5: Diyaliz yöntemi ile protein kristalleşme sürecine genel bakış. (A) Proteini diyaliz düğmesinin haznesine ekleyerek, (B) odanın üst kısmında bir kubbe şekli oluşturulur. (C) Diyaliz zarını yerinde sabitlemek için O halkasını diyaliz düğmesinin oluğuna aktarmak için bir aplikatör kullanılır. (D) Diyaliz düğmesi rezervuar çözeltisinde daldırma için hazırdır. (E) Kristalizasyon çözeltisi yarı geçirgen membrandan geçer ve kristaller odanın içinde oluşmaya başlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Şekil 6: Sıcaklık kontrollü akan diyaliz kurulumunun şematik görünümü. (A) Protein örneği diyaliz odasına eklenir. (B) Diyaliz zarı bir aplikatör kullanılarak bir O-halkası ile büyük bir kenara sabitlenir. (C) Fazlalık döndürülür ve diyaliz odasının üstüne sabitlenir. Beyaz oklar, vidaların yerle bir olan yere yerleştirildiği yeri gösterir. (D) Rezervuar haznesi saat yönünde (E) çevrilir ve fazlalık üzerine sabitlenir. (F) Rezervuar haznesi, pompalama sistemine konektörlü hava geçirmez bir kapakla kaplanır ve (G) akış hücresi pirinç desteğine yerleştirilir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Şekil 7: Kristalizasyon çözeltisinin akışkan sistem (A) tarafından rezervuara hazırlanması ve enjeksiyonu. Tuz ve su içeren tüpler basınç/vakum kontrol ünitesine (B) ve döner vanaya (C) bağlanır. Basınç/vakum kontrolörü, basıncı kullanarak sıvıların borulardan döner vanaya sabit bir akışını oluşturur. Akış ölçerden (D) geçen her sıvı ve anahtar karıştırma tüpüne (F) enjekte edilir. Tüm sıvılar karıştırma tüpüne eklendikten sonra, bazı değişikliklerle anahtar, karıştırma tüpünden nihai çözeltiyi rezervuara (G) enjekte eder. Sıvı, artan sırada (1'den 6'ya) işaretlenmiş diyagramdaki oklar yönünde sistemden akar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Şekil 8: Denetim yazılımının bakım görünümü. Bu görünüm sıcaklık, ışık, kristalizasyon çözümü ve yakınlaştırma gibi farklı parametreleri kontrol etmek için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Şekil 9: Sıcaklığın bir işlevi olarak faz diyagramı (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Sıcaklığın sistematik olarak 295 K'den 275 K'ya değiştirilmesiyle tek bir büyük lysozyme kristali elde edilir. Her adımda, çözünürlük eğrisi ulaştıktan sonra kristal büyümesi durdurulur. Çözeltiyi metastable bölgesinde tutarak sıcaklığı azaltmak kristal büyümesini yeniden başlatır. Görüntüler farklı büyütme seviyelerine sahiptir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Şekil 10: Sıcaklık kontrolü kullanılarak sabit kimyasal bileşimde kristal büyümesinin optimizasyonu (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Nükleasyon işlemine 291 K'de, metastable bölgeden uzakta çekirdeklenme işlemine başlamak, çok sayıda kristal oluşumuna neden olur. Sıcaklığın 313 K'ye çıkarılması, diyaliz odasında görünür bir çekirdek görülmeyene kadar kristalleri çözer. Son olarak, sıcaklığın 295 K'ye düşmesi, çekirdeklenme işlemini ikinci kez yeniden başlatır ve sınırlı sayıda daha büyük kristallere yol haline eder. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Şekil 11: Çökelti konsantrasyonundaki varyasyonlar kullanılarak kristal büyümesinin sabit sıcaklıkta optimizasyonu (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Çökelti konsantrasyonunu 0,9 M'den 0 M'ye düşürür, ilk çekirdeklenme olayı sırasında elde edilen kristalleri çözrür. Kristalleşme işlemi, aynı çökelticinin enjeksiyonu ile yeniden başlatılır, ancak daha düşük iyonik mukavemetle, 0.75 M, bu da birkaç büyük kristal oluşumuna yol açar. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Hem röntgen hem de nötron kristalografisi için büyük ve kaliteli kristaller elde etmek için farklı kristalleşme yaklaşımları vardır. Bu yaklaşımlardan biri diyaliz yöntemini kullanmaktır. Bu teknikte, protein çözeltisi çökeltici bir çözeltiden yarı geçirgen bir membran ile ayrılır.Çökelti molekülleri zar boyunca protein odasına yayılır. Spontan bir çekirdeklenme için doğru aşırı doyma sağlandığında, ilk çekirdek görünecektir. Burada, OptiCrys tarafından laboratuvarımızda geliştirilen ve sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyonu kullanan tam otomatik bir cihaz ve kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak doğal makromoleküler kristalografi için büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için mikro diyaliz düğmelerimiz tarafından kullanılabilecek bir protokol göstereceğiz.Belirli bir mikrolitre hacimli pipet ile bir mikro diyaliz düğmesi için diyaliz odasına 35 mikrolitre lysozyme çözeltisi. Bu ekstra hacim diyaliz odasının üstünde hafif bir kubbe şekli oluşturur ve hava kabarcığı oluşumunu önler. Bir aplikatör alın ve elastik veya halkayı ekstremitesine yerleştirin.Zarı haznenin üzerine yerleştirin ve elastik veya halkayı aplikatörden diyaliz düğmesinin oluğuna aktararak sabitlayın. Düğmeyi kristalizasyon çözeltisini içeren kuyuya aktarın. Kuyuyu bir cam kapak fişi veya bir bant parçası ile örtün.Numuneyi titreşimsiz bir termal regülatör inkübatöründe 293 Kelvin'de tutun. Diyaliz kristalizasyonunun kristal büyümesi açısından avantajlar sunduğunu bilerek, OptiCrys adı verilen kristalizasyon tezgahı, laboratuvarımızda biyomoleküler kristalizasyon deneyinin sıcaklık ve kimyasal bileşiminin tam otomatik bir birleşik kontrolünü sunmak için tasarlanmış ve geliştirilmiştir. OptiCrys tarafından kristal büyümesinin optimizasyonu, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon faz diyagramlarına dayanmaktadır.Çekirdeklenme, metastable bölgesinin ve kristal büyümesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesinde gerçekleşir, daha sonra protein konsantrasyonu çözelti ve kristaller arasındaki termodinamik dengeyi temsil eden çözünürlük eğrisine ulaşana kadar faz diyagramı sonrası metastable bölgede gerçekleşir. Proteinin doğrudan çözünürlükte olması durumunda sıcaklığı düşürerek veya tuzlama durumunda çökelti konsantrasyonunu artırarak kristalleşme çözeltisi metastable bölgede kalır ve çekirdeklenme meydana gelmez. Kristaller, ikinci kristal çözelti dengesi elde edilene kadar büyür ve bundan sonra kristallerin boyutunda daha fazla artış gözlenmez.Sıcaklığı azaltmak veya çökelti konsantrasyonu arttırılması, kristaller istenen boyuta ulaşana kadar birkaç kez tekrarlanır. Protein çözeltisini sıcaklık kontrollü akan kurulumun diyaliz odasına ekleyin, üst hazneyi diyaliz zarı ile örtün ve zarı elastik veya halka ile sabitleyin. Üst bölmeyi çevirin ve diyaliz odasının üstüne koyun.İki parça arasında sıkışan tüm havayı çıkarmak için hafifçe ve yavaşça bastırın, rezervuarı üst bölmenin üzerine hafifçe vidalayarak yerine sabitleyin. Kristalizasyon çözeltisini rezervuar odasına ekleyin ve hava geçirmez kapakla örtün. Bu montajı aktarın ve kristalizasyon bankı OptiCrys'in meme desteğine yerleştirin Kristalleşme Tezgahı OptiCrys'in bir gözetim yazılımıdır.Dört farklı grafik arayüz veya görünüm içerir. Giriş görünümü, diğer görünümlere gitmek için düğmeler içerir. Kurulum arabiriminin amacı, test görünümünde otomatik olarak çalıştırılabilen bir deneme senaryosu tanımlamaktır.Son görünüm bakım görünümüdür. Bir denemeyi yeniden başlatmak için, kristalizasyon deneylerini sorunsuz bir şekilde çalıştırmak için gerekli tüm parametrelerin bulunduğu bakım görünümünün açık olması gerekir. Işık bölümünden parlaklığı artırın, ışık sıfırdan artabilir, ışık yok maksimum 100 parlaklığa.Sıcaklığı kontrol etmek ve izlemek için sıcaklık regülatörü bölümü kullanılır. Açmak için düğmeye tıklayın. Ayarlanan nokta bölümündeki sıcaklığı ayarlayın ve enter tuşuna basın.Bu düğmenin altında iki grafik vardır. Kırmızı olan finali, sipariş sıcaklığını ve sarı grafik geçerli sıcaklığı gösterir. Bir stok çözeltisinin karıştırılması, kristalizasyon çözeltisinin rezervuar odasına enjeksiyonu Palm bölümü ile kontrol edilir.stok çözeltisinin konsantrasyonunu ilk aşamada ekleyin. Ardından her yeni torlayıcı çözeltisinin son konsantrasyonu bulun ve bunları son konsantrasyon bölümüne ekleyin. Hesapla düğmesine bastıktan sonra, stok çözeltisinin hacminin hesaplanacağını ve her konsantrasyon panelinin önündeki hacim panelini ekleyeceğini öğrenin.Başlatma hazırlığı düğmesine basın ve yeni premier çözüm hazır olana kadar bekleyin. Kristalizasyon çözümünü değiştirmek için Çözüm Girişi düğmesine tıklayın. İşlemi durdurmak için Dağıtımı Durdur düğmesine basın.Mikroskop bölümünün sağ tarafında, her kristal büyüme deneyinden önemli bilgileri kaydetmek için birkaç panel vardır. Bu bölüme ilgili proteinlerin adını, moleküler ağırlığını ve kristalizasyon durumunu ekleyin. Denemeleriniz için klasör adına yazarak bir ad tanımlayın.Nb görüntüleri bölümünden, deneme sırasında alınması gereken görüntü sayısını seçin. Görüntülerin numarasını ekleyin ve sağdaki panelden zamanlayıcı ölçeğini seçin. Klasörü açmak için klasör düğmesini tıklatın.Bu klasörde, daha önce denemeniz için tanımladığınız tüm bilgileri içeren bir metin dosyası vardır. Başka bir işlem için hazır görüntüler de bu klasöre kaydedilir. Mikroskobu yakınlaştırın, otomatik olarak da değiştirilebilir.Büyütmeyi artırmak veya azaltmak için mikroskop bölümünün üstündeki artı ve eksi düğmesini kullanarak yakınlaştırmanızı değiştirir. Kristal boyutunu ölçmenin üç farklı yolu vardır. Uzunluğu veya genişliği ölçmek için genişlik vektörü kullanın.Kristal şekline bağlı olarak mikroskop bölümünün sol kısmından belirli aletler seçilebilir. Dikdörtgen veya çokgen gibi. Değerler ölçü bölümünde görünecektir.İlk deney setinde mikrodiyaliz düğmeleri farklı tuz konsantrasyonlarına sahip kristalizasyon çözeltilerine daldırıldı. Bu basit kristalleşme ızgarası deneyinde, tek değişken çökeltici konsantrasyondur. sıcaklık sabit tutulurken.Tuz konsantrasyonundaki hafif değişimler, tuz konsantrasyonunu 0,7'den 1,2 molar aşırı doyma artışına yükselterek kristalizasyon faz diyagramını araştırmaya izin verir ve çekirdeklenme bölgesindeki çözelti metastable bölgeden uzaklaşır. Sonuç olarak, kristallerin sayısının artması ve boyutlarının azalmasıyla kristallerin boyut ve sayısında bir değişim gözlenir. Verilen deneysel durum altında OptiCrys ile yapılan ilk deneyde, diyaliz odasındaki denge bir kez ulaştığında, kristalizasyon çözeltisi, kristalizasyon faz diyagramının metastable bölgesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesindedir.Sonuç olarak, deneyin ilk aşamasında sadece birkaç çekirdek üretilir. Kristallerin büyümesini metastable bölgede tutmak ve kristal büyüme sürecini kontrol etmek için sıcaklık farklı zaman aralıklarında değiştirildi. Kristal çözelti dengesi her tamamlandığında, sıcaklık çeşitliydi.Bu nedenle sıcaklık, metastable bölgesinde seçilen kristalin büyümesini korumak için 291 Kelvin, 288 Kelvin ve son olarak 275 Kelvin'e düştü. Bu deneyin sonucu, doğal makromoleküler kristalografi için gerekli hacme sahip tek bir büyük kristaldir. Sonraki iki deney, çekirdeklenme, kristal büyümesi, çözülme ve yeniden büyüme için sıcaklık kontrollü diyaliz deneylerinin geri döndürülebilirliğini göstermektedir.OptiCrys ile yapılan ikinci deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimi deney boyunca sabit tutuldu ve sıcaklık değişti. İlk sıcaklık 291 Kelvin olarak belirlendi. Yüksek aşırı doyma nedeniyle, kristalleşme odasında çok sayıda küçük kristal ortaya çıktı.Doğrudan protein çözünürlüğü kavramına uygun olarak, sıcaklığı kademeli olarak 313 Kelvin'e çıkararak tüm kristaller çözülecekti. Son olarak, sıcaklığı 295 Kelvin'e düşürerek, ikinci çekirdekleme metastable bölgenin yakınında başlatıldı ve çekirdeklenme sürecini kontrol etmesine izin verdi ve daha az sayıda çekirdek oluşmasına neden oldu. Daha fazla kristal büyümesi, daha büyük kristallerin tekdüze popülasyonunun üretilmesine izin verildi.Bu deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini sabit sıcaklıkta değiştirmek, daha büyük kristallerden oluşan tekdüze bir popülasyon elde edilmesine yol açar. Kristalleşme durumu önceki deneye benzerdi. Kristallerin çözülmesi, NaCl konsantrasyonu kademeli olarak 0,9 azı dişinden sıfıra indirilerek elde edildi.Tuz konsantrasyonunun azaltılması, çözeltiyi faz diyagramının az doymamış bölgesinde tutar ve bu da kristallerin çözünmesine yol açar. Daha sonra daha önce olduğundan daha düşük iyonik mukavemete sahip yeni kristalizasyon çözeltisi rezervuar odasına enjekte edildi. Bu çökelti konsantrasyonunda daha az sayıda kristal ortaya çıkar ve kristaller öncekinden daha büyük bir hacme ulaşır.Burada, laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir alet kullanarak doğal makromoleküler kristalografi için büyük ve yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için numune hazırlama ve kontrol yazılımını ayarlamayı açıklayan ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu adım adım prosedür, çekirdeklenme ve kristal büyümesini ayırmak için kristalizasyon faz diyagramının bilgisinden yararlanarak tasarlanmıştır. Ayrıca, OptiCrys mevcut olmadığında alternatif olarak makrositoz düğmeleri kullanılarak mikrositoz desenli kristal yetiştirmek için bir protokol de sunulmaktadır.OptiCrys için bahsettiğim stratejilere ek olarak kristalizasyon çözeltisinin ve sıcaklığının kimyasal bileşimini değiştirmek ve görüntü almak manuel olarak yapılmalıdır. Sıcaklığı sabit tutmak için inkübatör için termal düzenlenmiş titreşimin kullanılması gerekir, bu da gösterilen metodolojide kritik bir adımdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...