Name: isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Vi takker Roberta Migliore for teknisk bistand. Forskningen, der fører til disse resultater, har modtaget finansiering fra Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) under IG2016-ID.18443-projektet - P.I. Marchesi Federica. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

For alle indskrevne patienter blev perifert blod og bugspytkirtelsaft indsamlet på tidspunktet for operationen i henhold til protokoller godkendt af institutionens etiske udvalg. Alle patienterne blev inkluderet i studiet efter underskrevet informeret samtykke, herunder indsamling af biologiske prøver og kliniske data. Undersøgelsen blev godkendt af institutionens etiske udvalg (protokolnummer ICH-595, godkendelse udstedt i maj 2009). Procedurer, der involverede mus og deres pleje, var i overensstemmelse med EU's og i...

I denne undersøgelse har vi beskrevet teknikken til intraoperativt at indsamle bugspytkirtelsaft, en stort set uudforsket væskebiopsi. Vi har for nylig vist, at bugspytkirtelsaft kan udnyttes som en kilde til metaboliske markører for sygdom12. Metabolomisk analyse af andre flydende biopsier, såsom blod 5,6,7, urin8 og spyt9, har vist lovende resultater i...

Pankreatisk duktalt adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive tumorer og snart at blive den næststørste dødsårsag 1,2,3. Det er kendt for sit immunsuppressive mikromiljø og for dets manglende reaktion på immunterapiprotokoller4. I øjeblikket er kirurgisk resektion stadig den eneste helbredende mulighed for PDAC, men alligevel er der en høj frekvens af tidlige tilbagefald og postkirurgiske komplikationer. Manglen på specifikke symptomer indtil et avanceret stadium tillader ikke en tidlig diagnose, hvilket bidrager til sygdommens deadlines. Desuden kan overlapningen af symptomer mellem PDAC og andre godartede bugspytkirtelpatologier hæmme opnåelsen af en hurtig og pålidelig diagnose med de nuværende diagnostiske strategier. Identifikation af variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier kan lette den kirurgiske beslutningsproces og forbedre patientprofilering.
 Lovende resultater i biomarkøropdagelse er opnået ved hjælp af let tilgængelige kropsvæsker, såsom blod 5,6,7, urin8, spyt 9 og bugspytkirtelsaft10,11,12. Mange undersøgelser har udnyttet omfattende "omics" tilgange, såsom genomiske, proteomiske og metabolomiske teknikker, til at identificere kandidatmolekyler eller signaturer, der kan diskriminere mellem PDAC og andre godartede pancreas lidelser. Vi har for nylig demonstreret, at bugspytkirtelsaft, en relativt uudforsket kropsvæske, kan bruges til at identificere metaboliske signaturer hos patienter med forskellige kliniske profiler12. Bugspytkirtelsaft er en proteinrig væske, som akkumulerer sekretomet af bugspytkirtelkanalerne og strømmer til hovedbugspytkirtelkanalen og derefter til den vigtigste fælles galdekanal. På grund af dets nærhed til bugspytkirtlen kan det blive stærkt påvirket af mikromiljøforstyrrelser induceret af tumormassen (figur 1) og derfor mere informativ end blod eller urin eller vævsbaseret profilering. Flere undersøgelser har undersøgt potentialet i bugspytkirtelsaft til at identificere nye biomarkører for sygdom ved hjælp af forskellige tilgange, herunder cytologisk analyse13, proteomisk analyse udført ved massespektrometri 14,15, vurdering af genetiske og epigenetiske markører såsom K-ras og p53 mutationer 16,17, ændringer i DNA-methylering 18 og miRNA'er 19 . Teknisk set kan bugspytkirtelsaft indsamles intraoperativt eller med minimalt invasive procedurer, såsom endoskopisk ultralyd, retrograd cholangio-pancreatografi eller ved endoskopisk samling af duodenal juice sekretion20. Det er endnu ikke klart, i hvilket omfang pancreasjuicesammensætningen påvirkes af den anvendte indsamlingsteknik. Vi beskriver her den intraoperative indsamlingsprocedure og viser, at bugspytkirtelsaft kan repræsentere en dyrebar kilde til PDAC-biomarkører.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af pancreas juice samling. (A) Skematisk repræsentation, der viser udskillelsen af bugspytkirtelsaft i bugspytkirtelkanalen og dens samling under operationen. Indsatsen viser et nærbillede af tumormikromiljøet: bugspytkirtelsaft samler molekyler frigivet af tumor- og stromale celler i bugspytkirtelkanalerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Indsamlingen af bugspytkirtelsaft i genetiske og ortopiske musemodeller af PDAC ville blive værdsat i perspektivet for at udnytte denne biofluid i prækliniske mekanistiske undersøgelser; Denne procedure kan dog være teknisk meget udfordrende og er ikke mulig for enklere modeller såsom subkutane tumorer. Af denne grund identificerede vi tumor interstitiel væske (TIF) som en alternativ kilde til bugspytkirtelsaft for dets lignende egenskab ved at fungere som en indikator for omgivende forstyrrelser. Interstitiel væske (IF) er den ekstracellulære væske, der findes uden for blod og lymfekar, som bader vævsceller21. IF-sammensætningen påvirkes af både blodcirkulationen til organet og lokal sekretion; faktisk producerer og udskiller omgivende celler aktivt proteiner i IF21. Interstitium afspejler mikromiljømæssige ændringer i omgivende væv og kan derfor udgøre en værdifuld kilde til biomarkøropdagelse i flere patologiske sammenhænge, såsom tumorer. Den høje koncentration af lokalt udskilte proteiner i TIF kan bruges til at identificere kandidatmolekyler, der skal testes som prognostiske eller diagnostiske biomarkører i plasma22,23,24. Flere undersøgelser har vist, at TIF er en passende prøve til proteomiske tilgange med høj kapacitet, såsom massespektrometriteknikker 23,24,25 samt multiplex ELISA-tilgange 26 og mikroRNA-profilering 27.
Der er foreslået flere metoder til isolering af IF i tumorer, som bredt kan kategoriseres som in vivo (kapillær ultrafiltrering 28,29,30,31 og mikrodialyse 32,33,34,35) og ex vivo-metoder (vævscentrifugering 22,36,37,38 og vævseluation 39,40,41,42). Disse teknikker er blevet gennemgået i omfattende detaljer43,44. Ved valget af den passende metode bør der tages hensyn til spørgsmål som f.eks. downstreamanalyser og applikationer og den genvundne mængde. Vi brugte for nylig denne tilgang som et bevis på princippet for at demonstrere den forskellige metaboliske aktivitet af tumorer fra to murine pancreas adenocarcinom cellelinjer12. Baseret på litteratur 24,38 valgte vi at bruge lavhastighedscentrifugeringsmetoden for at undgå cellebrud og fortynding fra intracellulært indhold. Både mængden af glukose og laktat i TIF afspejlede de forskellige glykolytiske egenskaber ved de to forskellige cellelinjer. Her beskriver vi detaljeret protokollen for de to mest almindeligt anvendte metoder til isolering af TIF: vævscentrifugering og vævseluering (figur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk repræsentation af tumor interstitielle væskeisoleringsmetoder. Skematisk illustration af de teknikker, der er beskrevet detaljeret i protokollen, nemlig vævscentrifugering (A) og vævseluering (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

Pancreas adenocarcinom (PDAC) er den fjerde førende årsag til kræftrelateret død og snart at blive den anden. Der er et presserende behov for variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier for at hjælpe præoperativ differentialdiagnose og patientprofilering. Pancreasjuice er en relativt uudforsket kropsvæske, som på grund af sin nærhed til tumorstedet afspejler ændringer i det omgivende væv. Her beskriver vi detaljeret den intraoperative indsamlingsprocedure. Desværre er oversættelse af bugspytkirtelsaftsamling til murinemodeller af PDAC til udførelse af mekanistiske undersøgelser teknisk meget udfordrende. Tumor interstitiel væske (TIF) er den ekstracellulære væske uden for blod og plasma, som bader tumor- og stromalceller. På samme måde som bugspytkirtelsaft, for dets egenskab til at indsamle og koncentrere molekyler, der findes fortyndet i plasma, kan TIF udnyttes som en indikator for mikromiljømæssige ændringer og som en værdifuld kilde til sygdomsassocierede biomarkører. Da TIF ikke er let tilgængelig, er der foreslået forskellige teknikker til isolering. Vi beskriver her to enkle og teknisk krævende metoder til isolering: vævscentrifugering og vævseluering.

Vi fulgte den ovenfor beskrevne procedure for at opnå bugspytkirtelsaft fra patienter med PDAC (n = 31) og andre godartede bugspytkirtelpåvirkninger (ikke-PDAC, n = 9), herunder pancreatitis (n = 2), papillær-ampulla tumorer (n = 4), neuroendokrine tumorer (n = 2), intraduktal papillær mucinøs neoplasi (IPMN; n = 1)12. Prøverne af bugspytkirtelsaft blev derefter underkastet metabolomisk analyse ved anvendelse af kernemagnetisk resonans (1H-NMR)12</su...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Bugspytkirtelsaft er en dyrebar kilde til biomarkører for kræft i bugspytkirtlen. Vi beskriver her en metode til intraoperativ indsamlingsprocedure. For at overvinde udfordringen med at vedtage denne procedure i murinemodeller foreslår vi en alternativ prøve, tumor interstitiel væske, og beskriver her to protokoller for dens isolering.

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown af genekspression i kræft cellelinjer til at studere ansættelse af monocytter/makrofager at Tumor mikromiljø

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering af patient-afledte bugspytkirtel ductal adenokarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Ortotopisk implantation af murin Pankreatisk ductal adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Udvidelse af forståelsen af tumormikromiljøet ved hjælp af massespektrometribilleddannelse af formalinfaste og paraffinindlejrede vævsprøver

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiseret, kunstig intelligens-styret lasermikrodissektion til mikroskaleret proteomisk analyse af tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafisklarver som model til evaluering af potentielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...