Name: isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Nous remercions Roberta Migliore pour son assistance technique. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de l’Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) dans le cadre du projet IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Pour tous les patients recrutés, le sang périphérique et le suc pancréatique ont été prélevés au moment de la chirurgie selon les protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’établissement. Tous les patients ont été recrutés dans l’étude après avoir signé un consentement éclairé, y compris la collecte d’échantillons biologiques et de données cliniques. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’institution (protocole numéro ICH-595, approbation délivrée en mai 2...

Dans cette étude, nous avons décrit la technique de collecte peropératoire du suc pancréatique, une biopsie liquidienne largement inexplorée. Nous avons récemment montré que le suc pancréatique peut être exploité comme source de marqueurs métaboliques de la maladie12. L’analyse métabolomique sur d’autres biopsies liquides, telles que le sang 5,6,7, l’urine8 et la salive9<sup...

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs les plus agressives et deviendra bientôt la deuxième cause de décès 1,2,3. Il est bien connu pour son microenvironnement immunosuppresseur et pour son manque de réponse aux protocoles d’immunothérapie4. Actuellement, la résection chirurgicale est toujours la seule option curative pour PDAC, mais il existe une fréquence élevée de rechutes précoces et de complications postopératoires. L’absence de symptômes spécifiques jusqu’à un stade avancé ne permet pas un diagnostic précoce, contribuant ainsi aux délais de la maladie. En outre, le chevauchement des symptômes entre PDAC et d’autres pathologies pancréatiques bénignes peut entraver la réalisation d’un diagnostic rapide et fiable avec les stratégies de diagnostic actuelles. L’identification de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pourrait faciliter le processus de prise de décision chirurgicale et améliorer le profilage des patients.
Des résultats prometteurs dans la découverte de biomarqueurs ont été obtenus en utilisant des fluides corporels facilement accessibles, tels que le sang 5,6,7, l’urine 8, la salive9 et le suc pancréatique 10,11,12. De nombreuses études ont exploité des approches « omiques » globales, telles que des techniques génomiques, protéomiques et métabolomiques, pour identifier des molécules candidates ou des signatures qui pourraient faire la distinction entre l’ACPE et d’autres affections pancréatiques bénignes. Nous avons récemment démontré que le suc pancréatique, un fluide corporel relativement inexploré, peut être utilisé pour identifier les signatures métaboliques de patients ayant des profils cliniques distincts12. Le suc pancréatique est un liquide riche en protéines, qui accumule le sécrétome des cellules canalaires pancréatiques et s’écoule vers le canal pancréatique principal, puis vers le canal cholédoque principal. En raison de sa proximité avec le pancréas, il pourrait être fortement affecté par les perturbations microenvironnementales induites par la masse tumorale (Figure 1), et donc plus informatif que le sang ou l’urine, ou le profilage tissulaire. Plusieurs études ont exploré le potentiel du suc pancréatique pour identifier de nouveaux biomarqueurs de la maladie en utilisant diverses approches, y compris l’analyse cytologique 13, l’analyse protéomique effectuée par spectrométrie de masse 14,15, l’évaluation de marqueurs génétiques et épigénétiques tels que les mutations K-ras et p53 16,17, les altérations de la méthylation de l’ADN18 et les miARN 19 . Techniquement, le suc pancréatique peut être collecté en peropératoire ou avec des procédures mini-invasives, telles que l’échographie endoscopique, la cholangio-pancréatographie rétrograde ou par collecte endoscopique de la sécrétion de suc duodénal20. On ne sait pas encore dans quelle mesure la composition du suc pancréatique est affectée par la technique de collecte utilisée. Nous décrivons ici la procédure de prélèvement peropératoire et montrons que le suc pancréatique peut représenter une source précieuse pour les biomarqueurs PDAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la collection de sucs pancréatiques. (A) Représentation schématique représentant la sécrétion de suc pancréatique dans le canal pancréatique et sa collecte pendant la chirurgie. L’encart montre un gros plan du microenvironnement tumoral: le suc pancréatique recueille les molécules libérées par les cellules tumorales et stromales dans les canaux pancréatiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La collecte de suc pancréatique dans des modèles murins génétiques et orthotopiques de PDAC serait appréciée dans la perspective d’exploiter ce biofluide dans des études mécanistiques précliniques ; Cependant, cette procédure peut être techniquement très difficile et n’est pas réalisable pour des modèles plus simples tels que les tumeurs sous-cutanées. Pour cette raison, nous avons identifié le liquide interstitiel tumoral (TIF) comme une source alternative au suc pancréatique, pour sa caractéristique similaire d’agir comme un indicateur des perturbations environnantes. Le liquide interstitiel (SI) est le liquide extracellulaire, trouvé à l’extérieur des vaisseaux sanguins et lymphatiques, qui baigne les cellules tissulaires21. La composition de la FI est affectée à la fois par la circulation sanguine vers l’organe et par la sécrétion locale; en fait, les cellules environnantes produisent et sécrètent activement des protéines dans l’IF21. L’interstitium reflète les changements microenvironnementaux des tissus environnants et pourrait donc représenter une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs dans plusieurs contextes pathologiques, tels que les tumeurs. La forte concentration de protéines sécrétées localement dans le TIF peut être utilisée pour identifier les molécules candidates à tester comme biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques dans le plasma22,23,24. Plusieurs études ont prouvé que le TIF est un échantillon approprié pour les approches protéomiques à haut débit, telles que les techniques de spectrométrie de masse 23,24,25, ainsi que les approches ELISA multiplex 26 et le profilage des microARN 27.
Plusieurs approches ont été proposées pour l’isolement de la FI dans les tumeurs, qui peuvent être largement classées comme in vivo (ultrafiltration capillaire 28,29,30,31 et microdialyse 32,33,34,35) et ex vivo (centrifugation tissulaire 22,36,37,38 et élution tissulaire 39,40,41,42). Ces techniques ont été examinées en détail43,44. Le choix de la méthode appropriée devrait tenir compte de questions telles que les analyses et les applications en aval et le volume récupéré. Nous avons récemment utilisé cette approche comme preuve de principe pour démontrer l’activité métabolique différente des tumeurs de deux lignées cellulaires d’adénocarcinome pancréatique murin12. Sur la base de la littérature24,38, nous avons choisi d’utiliser la méthode de centrifugation à basse vitesse pour éviter la rupture cellulaire et la dilution du contenu intracellulaire. La quantité de glucose et de lactate dans le TIF reflétait les différentes caractéristiques glycolytiques des deux lignées cellulaires différentes. Nous décrivons ici en détail le protocole des deux méthodes les plus couramment utilisées pour l’isolement du FIT : la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> Figure 2 : Représentation schématique des méthodes d’isolement du liquide interstitiel tumoral. Illustration schématique des techniques décrites en détail dans le protocole, à savoir la centrifugation tissulaire (A) et l’élution tissulaire (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est la quatrième cause de décès lié au cancer, et deviendra bientôt la deuxième. Il existe un besoin urgent de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pour faciliter le diagnostic différentiel préopératoire et le profilage des patients. Le suc pancréatique est un fluide corporel relativement inexploré qui, en raison de sa proximité avec le site tumoral, reflète les changements dans les tissus environnants. Nous décrivons ici en détail la procédure de collecte peropératoire. Malheureusement, la traduction de la collecte de sucs pancréatiques en modèles murins de PDAC, pour effectuer des études mécanistes, est techniquement très difficile. Le liquide interstitiel tumoral (TIF) est le liquide extracellulaire, à l’extérieur du sang et du plasma, qui baigne les cellules tumorales et stromales. Tout comme le suc pancréatique, pour sa propriété de collecter et de concentrer les molécules qui se trouvent diluées dans le plasma, le TIF peut être exploité comme indicateur d’altérations microenvironnementales et comme source précieuse de biomarqueurs associés à la maladie. Le FIT n’étant pas facilement accessible, diverses techniques ont été proposées pour son isolement. Nous décrivons ici deux méthodes simples et techniquement peu exigeantes pour son isolement: la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire.

Nous avons suivi la procédure décrite ci-dessus pour obtenir le suc pancréatique de patients atteints de PDAC (n = 31) et d’autres affections pancréatiques bénignes (non-PDAC, n = 9), y compris la pancréatite (n = 2), les tumeurs papillaires de l’ampoule (n = 4), les tumeurs neuroendocrines (n = 2), la néoplasie mucineuse papillaire intracanalaire (IPMN; n = 1) 12. Les échantillons de suc pancréatique ont ensuite été soumis à une analyse métabolomique par résonance magnétique nu...

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Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Le suc pancréatique est une source précieuse de biomarqueurs du cancer du pancréas humain. Nous décrivons ici une méthode de procédure de collecte peropératoire. Pour surmonter le défi de l’adoption de cette procédure dans des modèles murins, nous suggérons un échantillon alternatif, le liquide interstitiel tumoral, et décrivons ici deux protocoles pour son isolement.

Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

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Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantation orthotopique guidée par ultrasons de l'adénocarcinome ductal pancréatique murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

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Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

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A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

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Élargir la compréhension du microenvironnement tumoral à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse d’échantillons de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

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Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

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Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...