Name: isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

אנו מודים לרוברטה מיליורה על הסיוע הטכני. המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מ- Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) במסגרת פרויקט IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על הוצאתם לאור או בהכנת כתב היד.

עבור כל החולים שנרשמו, דם היקפי ומיץ לבלב נאספו בזמן הניתוח על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית של המוסד. כל המטופלים נרשמו למחקר לאחר שחתמו על הסכמה מדעת כולל איסוף דגימות ביולוגיות ונתונים קליניים. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד (פרוטוקול מספר ICH-595, אישור שניתן במאי 2009). נה?...

במחקר זה תיארנו את הטכניקה לאיסוף תוך-ניתוחי של מיץ הלבלב, ביופסיה נוזלית שטרם נחקרה ברובה. לאחרונה הראינו כי מיץ הלבלב יכול להיות מנוצל כמקור סמנים מטבוליים של מחלה12. ניתוח מטבולי של ביופסיות נוזליות אחרות, כגון דם 5,6,7, שתן <su...

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד הגידולים האגרסיביים ביותר, ובקרוב תהפוך לסיבתהמוות השנייה המובילה 1,2,3. הוא ידוע במיקרו-סביבה המדכאת את מערכת החיסון שלו ובחוסר התגובה שלו לפרוטוקולים אימונותרפיים4. נכון לעכשיו, כריתה כירורגית היא עדיין האפשרות המרפאת היחידה עבור PDAC, ובכל זאת יש תדירות גבוהה של הישנות מוקדמת וסיבוכים לאחר ניתוח. היעדר סימפטומים ספציפיים עד שלב מתקדם אינו מאפשר אבחון מוקדם, תורם למועדי המחלה. יתר על כן, החפיפה של הסימפטומים בין PDAC לבין פתולוגיות לבלב שפירות אחרות יכולה לעכב את ההישג של אבחנה מהירה ואמינה עם אסטרטגיות האבחון הנוכחיות. זיהוי משתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות יכול להקל על תהליך קבלת ההחלטות הכירורגיות ולשפר את פרופיל המטופל.
תוצאות מבטיחות בגילוי סמנים ביולוגיים הושגו באמצעות נוזלי גוף נגישים בקלות, כגון דם 5,6,7, שתן 8, רוק9 ומיץ לבלב10,11,12. מחקרים רבים ניצלו גישות מקיפות של "אומיקה", כגון טכניקות גנומיות, פרוטאומיות ומטבולומיות, כדי לזהות מולקולות או חתימות מועמדות שיכולות להבחין בין PDAC לבין פגיעות לבלב שפירות אחרות. לאחרונה הדגמנו כי ניתן להשתמש במיץ לבלב, נוזל גוף שטרם נחקר באופן יחסי, כדי לזהות חתימות מטבוליות של מטופלים עם פרופילים קליניים שונים12. מיץ הלבלב הוא נוזל עשיר בחלבון, אשר צובר את הפרשת תאי צינור הלבלב וזורם לצינור הלבלב הראשי, ולאחר מכן לצינור המרה המשותף העיקרי. בשל קרבתו ללבלב, הוא עשוי להיות מושפע מאוד מהפרעות מיקרו-סביבתיות המושרות על-ידי מסת הגידול (איור 1), ולכן הוא אינפורמטיבי יותר מדם או שתן, או פרופיל מבוסס רקמות. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל של מיץ לבלב לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות באמצעות גישות שונות, כולל ניתוח ציטולוגי 13, אנליזה פרוטאומית המבוצעת על ידי ספקטרומטריית מסה 14,15, הערכת סמנים גנטיים ואפיגנטיים כגון מוטציות K-ras ו-p53 16,17, שינויים במתילציה של DNA18, ו-miRNAs 19 . מבחינה טכנית, מיץ הלבלב ניתן לאסוף תוך ניתוחי או עם הליכים פולשניים מינימליים, כגון אולטרסאונד אנדוסקופי, cholangio-panracegraphy retrograde, או על ידי אוסף אנדוסקופי של הפרשת מיץ התריסריון20. עדיין לא ברור באיזו מידה הרכב מיץ הלבלב מושפע מטכניקת האיסוף המשמשת. אנו מתארים כאן את הליך האיסוף התוך-ניתוחי ומראים כי מיץ הלבלב יכול להוות מקור יקר ערך לסמנים ביולוגיים של PDAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של איסוף מיץ הלבלב. (A) ייצוג סכמטי המתאר את הפרשת מיץ הלבלב לצינור הלבלב ואיסופו במהלך הניתוח. הכניסה מראה תקריב של המיקרו-סביבה של הגידול: מיץ הלבלב אוסף מולקולות המשוחררות על ידי תאים סרטניים וסטרומליים בצינורות הלבלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
אוסף מיץ הלבלב במודלים גנטיים ואורתוטופיים של עכברים PDAC יהיה מוערך בפרספקטיבה כדי לנצל את זה biofluid במחקרים מכניסטיים פרה-קליניים; עם זאת, הליך זה יכול להיות מאתגר מאוד מבחינה טכנית ואינו אפשרי עבור מודלים פשוטים יותר כגון גידולים תת עוריים. מסיבה זו, זיהינו נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול (TIF) כמקור חלופי למיץ הלבלב, בגלל המאפיין הדומה שלו לפעול כאינדיקטור להפרעות בסביבה. נוזל אינטרסטיציאלי (IF) הוא הנוזל החוץ-תאי, הנמצא מחוץ לכלי הדם והלימפה, אשר שוטף תאי רקמה21. הרכב IF מושפע הן ממחזור הדם לאיבר והן מהפרשה מקומית; למעשה, התאים הסובבים מייצרים ומפרישים חלבונים באופן פעיל ב-IF21. האינטרסטיטיום משקף שינויים מיקרו-סביבתיים של הרקמות הסובבות ולכן יכול להוות מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים במספר הקשרים פתולוגיים, כגון גידולים. הריכוז הגבוה של חלבונים מופרשים מקומית ב- TIF יכול לשמש לזיהוי מולקולות מועמדות להיבדק כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים או אבחנתיים בפלזמה22,23,24. מספר מחקרים הוכיחו כי TIF הוא מדגם מתאים לגישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה, כגון טכניקות ספקטרומטריית מסות23,24,25, כמו גם גישות ELISA מולטיפלקס26, ופרופיל מיקרו-רנ"א 27.
מספר גישות הוצעו לבידוד של IF בגידולים, אשר ניתן לסווג באופן רחב כמו in vivo (אולטרה סינון נימי 28,29,30,31 ומיקרודיאליזה 32,33,34,35) ושיטות ex vivo (צנטריפוגה רקמה 22,36,37,38 ו רקמות elution 39,40,41,42). טכניקות אלה נסקרו בפירוט רב43,44. הבחירה בשיטה המתאימה צריכה לקחת בחשבון סוגיות כגון ניתוחים ויישומים במורד הזרם והנפח שהתאושש. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כהוכחה עקרונית כדי להדגים את הפעילות המטבולית השונה של גידולים משני קווי אדנוקרצינומה של לבלב12. בהתבסס על ספרות24,38, בחרנו להשתמש בשיטת הצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי למנוע שבירה ודילול של תאים מתוכן תוך-תאי. גם כמות הגלוקוז וגם הלקטט ב-TIF שיקפו את המאפיינים הגליקוליטיים השונים של שני קווי התאים השונים. כאן נתאר בפירוט את הפרוטוקול של שתי השיטות הנפוצות ביותר לבידוד של TIF: צנטריפוגה של רקמות ואלוציה של רקמות (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של שיטות לבידוד נוזלים אינטרסטיציאליים של גידולים. המחשה סכמטית של הטכניקות המתוארות בפירוט בפרוטוקול, כלומר צנטריפוגה של רקמות (A) ואלקטרוגציה של רקמות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

אדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) היא הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן, ובקרוב תהפוך לשנייה. קיים צורך דחוף במשתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות כדי לסייע באבחון דיפרנציאלי לפני הניתוח ובפרופיל המטופל. מיץ הלבלב הוא נוזל גוף שלא נחקר יחסית, אשר, בשל קרבתו לאתר הגידול, משקף שינויים ברקמה הסובבת. כאן אנו מתארים בפירוט את הליך האיסוף תוך ניתוחי. למרבה הצער, תרגום איסוף מיץ הלבלב למודלים של PDAC, לביצוע מחקרים מכניסטיים, הוא מאתגר מאוד מבחינה טכנית. הנוזל הבין-תאי של הגידול (TIF) הוא הנוזל החוץ-תאי, מחוץ לדם ולפלזמה, אשר שוטף את תאי הגידול והסטרומל. בדומה למיץ הלבלב, עבור התכונה שלו לאסוף ולרכז מולקולות שנמצאות מדולל בפלזמה, TIF יכול להיות מנוצל כאינדיקטור לשינויים מיקרו-סביבתיים וכמקור רב ערך של סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות. מכיוון ש- TIF אינו נגיש בקלות, הוצעו טכניקות שונות לבידודו. אנו מתארים כאן שתי שיטות פשוטות ובלתי תובעניות מבחינה טכנית לבידודה: צנטריפוגה של רקמות והרחבת רקמות.

עקבנו אחר ההליך שתואר לעיל כדי לקבל מיץ לבלב מחולים עם PDAC (n = 31) ומחלות לבלב שפירות אחרות (שאינן PDAC, n = 9), כולל דלקת הלבלב (n = 2), גידולים פפילריים-אמפולה (n = 4), גידולים נוירואנדוקריניים (n = 2), ניאופלזיה פפילרית רירי תוך-דוקטלית (IPMN; n = 1)12. דגימות מיץ הלבלב עברו אנליזה מטבולית באמצעות ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

מיץ לבלב הוא מקור יקר של סמנים ביולוגיים לסרטן הלבלב האנושי. אנו מתארים כאן שיטה להליך איסוף תוך ניתוחי. כדי להתגבר על האתגר של אימוץ הליך זה במודלים של מורין, אנו מציעים דגימה חלופית, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול, ומתארים כאן שני פרוטוקולים לבידודו.

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

מודל עכברי לחקר התפקיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן בצמיחת הגידול

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...