Name: isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00
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Agradecemos a Roberta Migliore pela assistência técnica. A pesquisa que levou a esses resultados recebeu financiamento da Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) no âmbito do projeto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Para todos os pacientes inscritos, o sangue periférico e o suco pancreático foram coletados no momento da cirurgia, de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Instituição. Todos os pacientes foram incluídos no estudo após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, incluindo coleta de espécimes biológicos e dados clínicos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição (protocolo número ICH-595, aprovação emitida em maio de 2009). Os procedimentos envolvendo camu...

Neste estudo, descrevemos a técnica de coleta intraoperatória de suco pancreático, uma biópsia de fluidos em grande parte inexplorada. Recentemente, mostramos que o suco pancreático pode ser explorado como fonte de marcadores metabólicos da doença12. A análise metabolômica em outras biópsias líquidas, como sangue 5,6,7, urina8 e saliva9, mostrou r...

O adenocarcinoma ductal pancreático (ACPD) é um dos tumores mais agressivos, e logo se tornará a segunda principal causa de morte 1,2,3. É conhecida por seu microambiente imunossupressor e por sua falta de resposta aos protocolos de imunoterapia4. Atualmente, a ressecção cirúrgica ainda é a única opção curativa para a ACPD, mas há uma alta frequência de recidivas precoces e complicações pós-cirúrgicas. A falta de sintomas específicos até um estágio avançado não permite um diagnóstico precoce, contribuindo para os prazos da doença. Além disso, a sobreposição de sintomas entre o PDAC e outras patologias pancreáticas benignas pode dificultar a obtenção de um diagnóstico rápido e confiável com as estratégias diagnósticas atuais. A identificação de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas poderia facilitar o processo de tomada de decisão cirúrgica e melhorar o perfil do paciente.
Resultados promissores na descoberta de biomarcadores têm sido alcançados utilizando fluidos corporais de fácil acesso, como sangue 5,6,7, urina8, saliva 9 e suco pancreático10,11,12. Muitos estudos exploraram abordagens "ômicas" abrangentes, como técnicas genômicas, proteômicas e metabolômicas, para identificar moléculas ou assinaturas candidatas que poderiam discriminar entre PDAC e outras aflições pancreáticas benignas. Recentemente, demonstramos que o suco pancreático, um fluido corporal relativamente inexplorado, pode ser utilizado para identificar assinaturas metabólicas de pacientes com perfis clínicos distintos12. O suco pancreático é um fluido rico em proteínas, que acumula o secretoma das células ductais pancreáticas e flui para o ducto pancreático principal e, em seguida, para o ducto biliar comum principal. Devido à sua proximidade com o pâncreas, pode ser fortemente afetada por perturbações microambientais induzidas pela massa tumoral (Figura 1) e, portanto, mais informativa do que o sangue ou a urina, ou o perfil baseado em tecidos. Vários estudos têm explorado o potencial do suco pancreático para identificar novos biomarcadores de doença usando várias abordagens, incluindo análise citológica 13, análise proteômica realizada por espectrometria de massa14,15, avaliação de marcadores genéticos e epigenéticos como mutações K-ras e p53 16,17, alterações na metilação do DNA 18 e miRNAs 19 . Tecnicamente, o suco pancreático pode ser coletado no intraoperatório ou com procedimentos minimamente invasivos, como ultrassonografia endoscópica, colangiopancreatografia retrógrada ou por coleta endoscópica de secreção de suco duodenal20. Ainda não está claro até que ponto a composição do suco pancreático é afetada pela técnica de coleta utilizada. Descrevemos aqui o procedimento de coleta intraoperatória e mostramos que o suco pancreático pode representar uma fonte preciosa de biomarcadores PDAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da coleção de suco pancreático. (A) Representação esquemática que descreve a secreção de suco pancreático no ducto pancreático e sua coleta durante a cirurgia. A inserção mostra um close-up do microambiente tumoral: o suco pancreático coleta moléculas liberadas por células tumorais e estromais nos ductos pancreáticos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A coleta de suco pancreático em modelos genéticos e ortotópicos de camundongos de PDAC seria apreciada na perspectiva de explorar esse biofluido em estudos mecanicistas pré-clínicos; no entanto, esse procedimento pode ser tecnicamente muito desafiador e inviável para modelos mais simples, como tumores subcutâneos. Por esse motivo, identificamos o líquido intersticial tumoral (TIF) como uma fonte alternativa ao suco pancreático, por sua característica semelhante de atuar como um indicador de perturbações circundantes. O líquido intersticial (FI) é o líquido extracelular, encontrado fora dos vasos sanguíneos e linfáticos, que banha as células teciduais21. A composição do FI é afetada tanto pela circulação sanguínea para o órgão quanto pela secreção local; de fato, as células circundantes produzem e secretam ativamente proteínas no FI21. O interstício reflete as alterações microambientais dos tecidos circundantes e, portanto, pode representar uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores em vários contextos patológicos, como tumores. A alta concentração de proteínas secretadas localmente no TIF pode ser utilizada para identificar moléculas candidatas a serem testadas como biomarcadores prognósticos ou diagnósticos no plasma22,23,24. Vários estudos comprovaram que o TIF é uma amostra adequada para abordagens proteômicas de alto rendimento, como técnicas de espectrometria de massa 23,24,25, bem como abordagens ELISA multiplex 26 e perfil de microRNA 27.
Diversas abordagens têm sido propostas para o isolamento do FI em tumores, que podem ser amplamente categorizados como in vivo (ultrafiltração capilar 28,29,30,31 e microdiálise 32,33,34,35) e métodos ex vivo (centrifugação tecidual 22,36,37,38 e eluição tecidual 39,40,41,42). Essas técnicas têm sido revisadas em detalhesextensivos 43,44. A escolha do método adequado deverá ter em conta questões como as análises e aplicações a jusante e o volume recuperado. Recentemente, utilizamos essa abordagem como prova de princípio para demonstrar a diferente atividade metabólica de tumores de duas linhagens celulares de adenocarcinoma pancreático murino12. Com base na literatura24,38, optou-se por utilizar o método de centrifugação de baixa velocidade para evitar a quebra celular e a diluição do conteúdo intracelular. Tanto a quantidade de glicose quanto o lactato no TIF refletiram as diferentes características glicolíticas das duas linhagens celulares diferentes. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para os dois métodos mais utilizados para o isolamento de TIF: centrifugação tecidual e eluição tecidual (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática dos métodos de isolamento do líquido intersticial tumoral. Ilustração esquemática das técnicas descritas detalhadamente no protocolo, nomeadamente centrifugação tecidual (A) e eluição tecidual (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer e logo se tornará a segunda. Há uma necessidade urgente de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas para auxiliar o diagnóstico diferencial pré-operatório e o perfil do paciente. O suco pancreático é um fluido corporal relativamente inexplorado, que, devido à sua proximidade com o local do tumor, reflete mudanças no tecido circundante. Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de coleta intraoperatória. Infelizmente, traduzir a coleta de suco pancreático para modelos murinos de PDAC, para realizar estudos mecanicistas, é tecnicamente muito desafiador. O líquido intersticial tumoral (TIF) é o fluido extracelular, fora do sangue e do plasma, que banha as células tumorais e estromais. Da mesma forma que o suco pancreático, por sua propriedade de coletar e concentrar moléculas que são encontradas diluídas no plasma, o TIF pode ser explorado como um indicador de alterações microambientais e como uma valiosa fonte de biomarcadores associados à doença. Como o TIF não é facilmente acessível, várias técnicas têm sido propostas para o seu isolamento. Descrevemos aqui dois métodos simples e tecnicamente pouco exigentes para o seu isolamento: centrifugação tecidual e eluição tecidual.

Seguimos o procedimento descrito acima para obtenção de suco pancreático de pacientes com PCAC (n=31) e outras aflições pancreáticas benignas (não PDAC, n=9), incluindo pancreatite (n=2), tumores papilar-ampola (n=4), tumores neuroendócrinos (n=2), neoplasia mucinosa papilar intraductal (NMPI; n=1)12. As amostras de suco pancreático foram então submetidas à análise metabolômica por ressonância magnética nuclear (1H-NMR)12. Ao filtrar o...

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Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.

Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Pesquisa do câncer

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Larvas de zebrafish como modelo para avaliar potenciais radiossensibilizadores ou protetores

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...