Name: isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Мы благодарим Роберту Мильоре за техническую помощь. Исследование, приведшее к этим результатам, получило финансирование от Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) в рамках проекта IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

У всех зарегистрированных пациентов периферическая кровь и панкреатический сок были собраны во время операции в соответствии с протоколами, утвержденными Этическим комитетом Учреждения. Все пациенты были включены в исследование после подписания информированного согласия, включая с...

В этом исследовании мы описали технику интраоперационного сбора сока поджелудочной железы, в значительной степени неисследованную жидкую биопсию. Недавно мы показали, что панкреатический сок может быть использован в качестве источника метаболических маркеров заболевания12...

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является одной из самых агрессивных опухолей, и вскоре станет второй по значимости причиной смерти 1,2,3. Он хорошо известен своей иммуносупрессивной микросредой и своей неспособностью реагировать на протоколы иммунотерапии4. В настоящее время хирургическая резекция по-прежнему является единственным лечебным вариантом для PDAC, но существует высокая частота ранних рецидивов и послеоперационных осложнений. Отсутствие специфических симптомов до запущенной стадии не позволяет провести раннюю диагностику, способствуя срокам заболевания. Кроме того, перекрытие симптомов между PDAC и другими доброкачественными патологиями поджелудочной железы может препятствовать достижению быстрой и надежной диагностики с текущими диагностическими стратегиями. Идентификация переменных, связанных с конкретными патологиями поджелудочной железы, может облегчить процесс принятия хирургических решений и улучшить профилирование пациентов.
Многообещающие результаты в открытии биомаркеров были достигнуты с использованием легкодоступных жидкостей организма, таких как кровь 5,6,7, моча8, слюна9 и панкреатический сок 10,11,12. Во многих исследованиях использовались комплексные «омические» подходы, такие как геномные, протеомные и метаболомные методы, для идентификации молекул-кандидатов или сигнатур, которые могут различать PDAC и другие доброкачественные заболевания поджелудочной железы. Недавно мы продемонстрировали, что панкреатический сок, относительно неисследованная жидкость организма, может быть использован для идентификации метаболических сигнатур пациентов с различными клиническими профилями12. Панкреатический сок представляет собой богатую белком жидкость, которая накапливает секретом клеток протоков поджелудочной железы и поступает в главный проток поджелудочной железы, а затем в основной общий желчный проток. Из-за своей близости к поджелудочной железе на него могут сильно влиять микроокружательные возмущения, индуцированные опухолевой массой (рисунок 1), и, следовательно, более информативные, чем кровь или моча, или профилирование на основе тканей. В нескольких исследованиях изучался потенциал панкреатического сока для выявления новых биомаркеров заболевания с использованием различных подходов, включая цитологический анализ13, протеомный анализ, выполненный масс-спектрометрией 14,15, оценку генетических и эпигенетических маркеров, таких как мутации K-ras и p53 16,17, изменения в метилировании ДНК18 и миРНК 19 . Технически панкреатический сок может быть собран интраоперационно или с помощью минимально инвазивных процедур, таких как эндоскопическое ультразвуковое исследование, ретроградная холангио-панкреатография или эндоскопический сбор секреции дуоденального сока20. Пока не ясно, в какой степени на состав панкреатического сока влияет используемая методика сбора. Мы описываем здесь процедуру интраоперационного сбора и показываем, что панкреатический сок может представлять собой ценный источник биомаркеров PDAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение сбора сока поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение, изображающее секрецию панкреатического сока в проток поджелудочной железы и его сбор во время операции. Вставка показывает крупный план микроокружения опухоли: панкреатический сок собирает молекулы, высвобождаемые опухолевыми и стромальными клетками в протоках поджелудочной железы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Коллекция панкреатического сока в генетических и ортотопических мышиных моделях PDAC была бы оценена в перспективе использования этой биожидкости в доклинических механистических исследованиях; однако эта процедура может быть технически очень сложной и неосуществимой для более простых моделей, таких как подкожные опухоли. По этой причине мы идентифицировали опухолевую интерстициальную жидкость (TIF) в качестве альтернативного источника панкреатического сока, поскольку она сходная характеристика действует как индикатор окружающих возмущений. Интерстициальная жидкость (ИФ) представляет собой внеклеточную жидкость, обнаруженную вне кровеносных и лимфатических сосудов, которая омывает клеткиткани 21. На состав ПЧ влияет как кровообращение в органе, так и местная секреция; фактически, окружающие клетки активно продуцируют и секретируют белки в IF21. Интерстиций отражает микроокружательные изменения окружающих тканей и, следовательно, может представлять собой ценный источник для обнаружения биомаркеров в нескольких патологических контекстах, таких как опухоли. Высокая концентрация локально секретируемых белков в TIF может быть использована для идентификации молекул-кандидатов для тестирования в качестве прогностических или диагностических биомаркеров в плазме 22,23,24. Несколько исследований доказали, что TIF является подходящим образцом для высокопроизводительных протеомных подходов, таких как методы масс-спектрометрии23,24,25, а также мультиплексные подходы ИФА26 и профилирование микроРНК27.
Было предложено несколько подходов к выделению МФ в опухолях, которые можно в широком смысле классифицировать как in vivo (капиллярная ультрафильтрация 28,29,30,31 и микродиализ 32,33,34,35) и методы ex vivo (тканевая центрифугирование 22,36,37,38 и тканевое элюирование 39,40,41,42). Эти методы были подробно рассмотрены43,44. При выборе соответствующего метода следует учитывать такие вопросы, как последующий анализ и применение, а также восстановленный объем. Недавно мы использовали этот подход в качестве доказательства принципа для демонстрации различной метаболической активности опухолей из двух клеточных линий аденокарциномы мышей поджелудочной железы12. Основываясь на литературе24,38, мы решили использовать метод центрифугирования с низкой скоростью, чтобы избежать разрушения и разбавления клеток от внутриклеточного содержимого. Как количество глюкозы, так и лактата в TIF отражало различные гликолитические характеристики двух разных клеточных линий. Здесь мы подробно опишем протокол для двух наиболее часто используемых методов выделения TIF: тканевого центрифугирования и тканевого элюирования (рисунок 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематическое изображение методов выделения опухолевой интерстициальной жидкости. Схематическая иллюстрация методов, подробно описанных в протоколе, а именно центрифугирования тканей (А) и тканевого элюирования (В). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является четвертой по значимости причиной смерти, связанной с раком, и вскоре станет второй. Существует острая потребность в переменных, связанных со специфическими патологиями поджелудочной железы, чтобы помочь предоперационной дифференциальной диагностике и профилированию пациентов. Панкреатический сок представляет собой относительно неисследованную жидкость организма, которая благодаря своей непосредственной близости к месту опухоли отражает изменения в окружающих тканях. Здесь мы подробно опишем процедуру интраоперационного сбора. К сожалению, перевод сбора панкреатического сока на мышиные модели PDAC для выполнения механистических исследований технически очень сложен. Опухолевая интерстициальная жидкость (TIF) представляет собой внеклеточную жидкость, находящуюся вне крови и плазмы, которая омывает опухолевые и стромальные клетки. Подобно соку поджелудочной железы, из-за его свойства собирать и концентрировать молекулы, которые находятся разбавленными в плазме, TIF может использоваться в качестве индикатора микроокружающих изменений и в качестве ценного источника биомаркеров, связанных с заболеванием. Поскольку TIF не является легкодоступным, были предложены различные методы его изоляции. Здесь мы опишем два простых и технически нетребовательных метода его выделения: тканевое центрифугирование и тканевое элюирование.

Мы следовали описанной выше процедуре для получения панкреатического сока от пациентов с PDAC (n = 31) и другими доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы (non-PDAC, n = 9), включая панкреатит (n = 2), папиллярно-ампульные опухоли (n = 4), нейроэндокринные опухоли (n = 2), внутрипродукционную ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma at JoVE.com

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Панкреатический сок является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы человека. Здесь описан метод интраоперационной процедуры сбора. Чтобы преодолеть проблему принятия этой процедуры в мышиных моделях, мы предлагаем альтернативный образец, опухолевую интерстициальную жидкость, и описываем здесь два протокола для ее выделения.

Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Условное нокдаун экспрессии генов в рак клеточных линий для изучения набора моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Иммунофенотипирование ортотопическая Homograft (сингенных) из мышиных первичной КЗК аденокарциномы поджелудочной железы протоковой подачей Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Изоляция и характеристика пациента полученных поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома ОрганоидНые Модели

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ультразвуковая ортотопическая имплантация мурин поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Мышиная модель для исследования роли связанных с раком фибробластов в росте опухоли

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Трехмерная сфероидная модель для исследования опухоле-стромального взаимодействия при гепатоцеллюлярной карциноме

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Расширение понимания микроокружения опухоли с помощью масс-спектрометрической визуализации формалин-фиксированных и парафин-внедренных образцов тканей

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Индустриализированная лазерная микродиссекция с искусственным интеллектом для микромасштабированного протеомного анализа микроокружения опухоли

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Личинки данио-рерио как модель для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...