Name: visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00
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Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging, USA, unterstützt (Z01-AG000746–08). J.H. wird von den National Natural Science Foundations of China (21708007 und 31871365 unterstützt.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Tag 1<ol><li>35-mm-Kulturschalen mit Glasboden mit einer Zellkleberlösung vorbehandeln.</li>
		<li>Legen Sie die Zellen einen Tag vor der Behandlung in die vorbehandelten Schalen. Die Zelle sollte sich am Tag des Experiments aktiv teilen und zu 50–70 % konfluent sein. HINWEIS: HeLa-Zellen wurden in diesem Experiment mit Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM verwendet, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 1x Penicillin / Streptomycin. Es gibt keine Beschränkung für adhärente ...

<ol>
	<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly.">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks.">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li><li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+An+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).</li><li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues.">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li><li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks.">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li><li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing.">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li><li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells:+step+by+step.">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li><li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site.">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li><li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks.">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li><li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility.">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li><li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts.">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li><li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP/SLX4.">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li><li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair.">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li><li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psoralens.+An+historical+perspective.">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks.">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li><li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays.">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR,+FANCM,+and+FANCD2.">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts.">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).</li><li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+kinase+ATR:+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome.">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li><li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases.">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li><li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging.">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).</li><li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NPAT,+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2,+promotes+S-phase+entry.">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes &amp; Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li></ol>

Obwohl die PLA eine sehr leistungsfähige Technik ist, gibt es technische Bedenken, die gelöst werden müssen, um klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Antikörper müssen eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Darüber hinaus ist es wichtig, die unspezifischen Hintergrundsignale so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben festgestellt, dass Membranen und Zelltrümmer zum Hintergrund beitragen, und wir haben sie so weit wie möglich entfernt. Das Waschen mit Waschmittel, das Puffer enthält, v...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche ist dank einer Reihe von immer leistungsfähigeren Methoden zur Lenkung von Brüchen an bestimmte genomische Stellen gut dokumentiert 1,2,3. Die Lokalisationssicherheit ermöglicht eine eindeutige Charakterisierung von Proteinen und anderen Faktoren, die sich an der Stelle ansammeln und an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt sind, wodurch die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) angesteuert werden, die Brüche reparieren. Natürlich werden viele Brüche durch Agenzien wie Strahlung und chemische Spezies verursacht, die bestimmte Sequenzen nicht angreifen4. Für diese stehen jedoch Verfahren zur Verfügung, mit denen die Enden in Strukturen umgewandelt werden können, die für das Tagging und die Lokalisierung geeignetsind 5,6. Brüche werden auch durch biologische Prozesse, wie z. B. die Umlagerung von Immunglobulinen, eingeführt, und neuere Technologien ermöglichen ihre Lokalisierung sowie7. Die Beziehung zwischen den reagierenden Faktoren und diesen Stellen kann dann bestimmt werden.
Brüche treten auch als indirekte Folge von Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine inhärenten Brecher sind, aber DNA-Transaktionen wie Transkription und Replikation stören. Sie können als Merkmal der zellulären Reaktion auf diese Obstruktionen gebildet werden, vielleicht während der Reparatur oder weil sie eine Struktur provozieren, die anfällig für Nukleaseangriffe ist. Typischerweise ist die physikalische Beziehung zwischen dem Addukt, dem Bruch und der Assoziation mit antwortenden Faktoren inferenzlich. Zum Beispiel werden ICLs durch Chemotherapeutika wie Cisplatin und MitomycinC8 und als Reaktionsprodukt von abasischen Stellen9 gebildet. ICLs sind als potente Blöcke für Replikationsgabeln10 bekannt, wodurch Gabeln, die durch Nukleasen11 gespalten werden können, blockiert werden. Die kovalente Bindung zwischen den Strängen wird oft durch Signalwege erleichtert, die obligate Brüche als Zwischenprodukteaufweisen 12,13, was eine homologe Rekombination erfordert, um die Replikationsgabel 14 wieder aufzubauen. In den meisten Experimenten verfolgt der Forscher die Reaktion von interessierenden Faktoren auf die Brüche, die stromabwärts der Kollision einer Replikationsgabel mit einer ICL gebildet werden. Da es jedoch keine Technologie zur Lokalisierung einer provokativen Läsion gibt, kann die Nähe des Replisoms und seiner Bestandteile zum ICL nur vermutet werden.
Wir haben eine Strategie entwickelt, die die Analyse von Proteinassoziationen mit nicht-sequenzspezifischen kovalenten Addukten ermöglicht, die hier anhand von ICLs dargestellt werden. In unser System werden diese durch Psoralen eingeführt, ein photoaktives Naturprodukt, das seit Tausenden von Jahren als Therapeutikum bei Hauterkrankungen verwendetwird 15. Unser Ansatz basiert auf zwei wichtigen Merkmalen von Psoralens. Die erste ist ihre hohe Frequenz der Vernetzungsbildung, die 90 % der Addukte überschreiten kann, im Gegensatz zu den weniger als 10 %, die von beliebten Verbindungen wie Cisplatin oder Mitomycin C 8,16 gebildet werden. Die zweite ist die Zugänglichkeit der Verbindung zur Konjugation ohne Verlust der Vernetzungskapazität. Wir haben Trimethylpsoralen kovalent mit Digoxigenin (Dig), einem seit langem etablierten Immuntag, verknüpft. Dies ermöglicht den Nachweis der Psoralen-Addukte in genomischer DNA durch Immunfärbung des Dig-Tags und die Visualisierung durch konventionelle Immunfluoreszenz17.
Dieses Reagenz wurde in unserer früheren Arbeit zur Analyse von Replikationsgabelbegegnungen mit ICLs unter Verwendung eines DNA-Faser-basierten Assays eingesetzt16. In dieser Arbeit fanden wir heraus, dass die Replikation über eine intakte ICL hinaus fortgesetzt werden kann. Dies war abhängig von der ATR-Kinase, die durch Replikationsstress aktiviert wird. Der Neustart der Replikation war angesichts der Struktur der replikativen CMG-Helikase unerwartet. Dieser besteht aus dem MCM-Hetero-Hexamer (M), das einen versetzten Gap-Ring um den Templat-Strang für die Leitstrangsynthese bildet, der von den Proteinen des GINS-Komplexes (G, bestehend aus PSF1, 2, 3 und SLD5) und CDC45 (C)18 eingeschlossen wird. Der Vorschlag, dass die Replikation auf der Seite der ICL distal zur Seite der Replisomkollision neu gestartet werden könnte, sprach für eine Änderung der Struktur des Replisoms. Um der Frage nachzugehen, welche Komponenten zum Zeitpunkt der Begegnung mit einer ICL im Replikom waren, haben wir den hier beschriebenen Ansatz entwickelt. Wir nutzten den Dig-Tag als Partner in Proximity-Ligation-Assays (PLA)19 , um die enge Assoziation der ICL mit Proteinen des Replisoms20 zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10011</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates with glass 1.5 coverslip</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10001</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>1900-0012</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDC45 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126762</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell adhesive</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>354240</td>
			<td>for cell-TAK solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikkon</td>
			<td>Nikon TE2000 spinning disk microscope</td>
			<td>equiped with Volocity software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab420</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig-TMP</td>
			<td>synthesized in the Seidman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Amplification reagents (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82010</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ detection reagents</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28906</td>
			<td>for fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31873</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>open source</td>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>works for analysis of single plane images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software-license required</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td>Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase (1 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation reagent (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM2 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4461</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM5 antibody (rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab75975</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Lab ALLEY</td>
			<td>A2076</td>
			<td>pre-cold at -20&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109271</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase (10 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold mounting media with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSF1 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181112</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A 100 mg/ml</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software</td>
			<td>open source</td>
			<td>R studio</td>
			<td>ggplot2 package for generation of dot plot and box plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software-license required</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>Sigmaplot V13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMP (trioxalen)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6137_1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787_250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416_100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Southern New England Ultraviolet</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV test Chamber</td>
			<td>Opsytec</td>
			<td>UV TEST CHAMBER BS-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-821</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8007</td>
			<td>final concentrtion is 1&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion

Es gibt einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch Nukleasen, Strahlung und andere DNA-Brecher induziert werden. Dies spiegelt zum Teil die Verfügbarkeit von Methoden zur Identifizierung von Bruchstellen und zur Charakterisierung von Faktoren wider, die an diesen Sequenzen an DSBs rekrutiert werden. DSBs treten jedoch auch als Zwischenprodukte bei der Verarbeitung von DNA-Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine direkten Brüche verursachen und nicht an bestimmten Sequenzstellen reagieren. Folglich sind für die meisten dieser Wirkstoffe Technologien, die die Analyse von Bindungsinteraktionen mit Reaktionsfaktoren und Reparaturproteinen ermöglichen, unbekannt. Zum Beispiel können DNA-Interstrangvernetzungen (ICLs) Brüche nach Begegnungen mit Replikationsgabeln hervorrufen. Obwohl sie aus Medikamenten bestehen, die häufig als Chemotherapeutika für Krebs verwendet werden, gibt es bisher keine Methodik zur Überwachung ihrer Wechselwirkungen mit Replikationsproteinen.
In dieser Arbeit beschreiben wir unsere Strategie, um die zelluläre Reaktion auf Gabelkollisionen mit diesen herausfordernden Addukten zu verfolgen. Wir haben ein Steroidantigen mit Psoralen verknüpft, das Photoaktivierungs-abhängige ICLs in Zellkernen lebender Zellen bildet. Die ICLs wurden mittels Immunfluoreszenz gegen den Antigen-Tag sichtbar gemacht. Der Tag kann auch ein Partner im Proximity-Ligation-Assay (PLA) sein, der die enge Assoziation zweier Antigene meldet. Die PLA wurde ausgenutzt, um Proteine, die eng mit den markierten ICLs assoziiert waren, von solchen zu unterscheiden, die dies nicht waren. Es war möglich, Replisome-Proteine zu definieren, die nach Begegnungen mit ICLs zurückblieben, und andere, die verloren gingen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist auf jede Struktur oder jedes DNA-Addukt anwendbar, das immunologisch nachgewiesen werden kann.

PLA von Dig-TMP mit Replisomproteinen Der Aufbau des Dig-TMP ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Details der Synthese, bei der Trimethylpsoralen durch einen Glykollinker an Digoxigenin konjugiert wurde, wurden bereits diskutiert17,21. Die Inkubation von Zellen mit der Verbindung und anschließende Bestrahlung mit 365 nm Licht (UVA) photoaktiviert die Verbindung und treibt die Vernetzungsreaktion an. Etwas mehr als...

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Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Während Replikationsgabelkollisionen mit DNA-Addukten Doppelstrangbrüche induzieren können, ist über die Interaktion zwischen Replisomen und blockierenden Läsionen weniger bekannt. Wir haben den Proximity-Ligations-Assay verwendet, um diese Begegnungen zu visualisieren und die Konsequenzen für die Replisomenzusammensetzung zu charakterisieren.

Visualisierung von Replisom-Begegnungen mit einer Antigen-markierten blockierenden Läsion

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

Diese Technik erleichtert die Visualisierung von Replisom-Antigen-markierten DNA-Addukt-Begegnungen und kann auf die Wechselwirkungen eines beliebigen Proteins mit einer DNA-Struktur oder -Läsion ausgeweitet werden, die für den Immunnachweis geeignet ist. Diese Methode kann verwendet werden, um Interaktionshäufigkeiten innerhalb einzelner Zellen und nicht über eine Population hinweg zu untersuchen, und ermöglicht die Visualisierung von zellzyklusabhängigen Interaktionen in situ, ohne Zellen zu schädigen. Ishani Majumdar, Postdoktorandin am Seidman Laboratory, demonstriert das Verfahren.Am Tag vor dem Experiment werden 1,5 mal 10 bis fünfte Zellen in zwei Millilitern Medium auf 35 Millimeter große Glasbodenkulturschalen gesät, die mit Zellkleberlösung vorbehandelt sind. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jeder Schale durch 37 Grad Celsius Five mikromolaren Dig TMP-supplementiertes Medium in die 50 bis 70 % konfluenten Zellkulturen und geben Sie die Platten für 30 Minuten in den Zellkulturinkubator zurück, damit sich das Dig TMP ausgleichen kann. Während der Inkubation der Zellen wird eine UV-Box auf 37 Grad Celsius vorgewärmt.Übertragen Sie die Platten am Ende des Äquilibrierens in die vorgewärmte Box, um die Zellen einer fünfminütigen UVA-Lichtdosis von drei Joule pro Quadratzentimeter auszusetzen, und ersetzen Sie die Überstände durch zwei Milliliter frisches, vorgewärmtes Nährmedium, bevor Sie die Platten für eine Stunde in den Zellkulturinkubator zurückgeben. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Kulturen vorsichtig mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,1%igem Formaldehyd in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation einmal mit PBS, bevor Sie die Zellen zweimal mit 80 Mikrolitern Zytoskelett-Extraktionspuffer behandeln, der mit RNase angereichert ist, für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Behandlung, um das Zytoplasma zu entfernen.Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Milliliter PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 4%igem Formaldehyd 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS fixieren. Nach der zweiten Fixierung werden die Zellen wie gezeigt dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Behandlung mit einem Milliliter kaltem 100%igem Methanol für 20 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in zwei Millilitern PBS, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in 80 Mikrolitern von fünf millimolaren Triton X-100 bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 100 Mikrolitern fünfmillimolarem EDTA in PBS, ergänzt mit einem Mikroliter 100 Milligramm pro Milliliter RNase A. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in PBS, bevor Sie sie in 5 % Kälberserumalbumin und 10 % Eselsserum in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Feuchtkammer lagern. Um einen Proximity-Ligationstest durchzuführen, geben Sie 40 Mikroliter der primären Antikörperlösung von Interesse in die Mitte jeder Platte und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius.Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal mit zwei Millilitern PBST, bevor Sie 40 Mikroliter frisch zubereitete PLA-Sondenlösung für eine einstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator in jede Schale geben. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit drei 10-minütigen Waschgängen in zwei Millilitern Puffer A auf einer kippbaren Plattform bei Raumtemperatur. Nach dem letzten Waschgang geben Sie 40 Mikroliter frisch zubereitete Ligaturmischung für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius auf jede Platte, gefolgt von drei zweiminütigen Waschgängen in Puffer A auf der Kippplattform.Geben Sie nach dem letzten Waschgang 40 Mikroliter frisch zubereitete Amplifikationslösung in jede Platte für eine 100-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation sechsmal mit frischem Puffer B für 10 Minuten pro Waschgang auf der Kippplattform. Waschen Sie die Zellen nach der letzten Puffer-B-Wäsche einmal mit 0,01-fachem Puffer B für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie sie mit den entsprechenden Sekundärantikörpern in der Feuchtkammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius markieren.Am Ende der Inkubation werden die Proben mit drei 10-minütigen Waschgängen auf einer Kippplattform in PBST bei Raumtemperatur gewaschen, bevor sie in ein mit DAPI ergänztes Eindeckmedium eingelagert werden. Innerhalb von vier Tagen nach der Montage mindestens 100 Beobachtungen pro Probe oder Bedingungszellen auf einem Epifluoreszenz- oder konfokalen Mikroskop abbilden, wobei die gleichen Belichtungseinstellungen für Versuchs- und Kontrollproben verwendet werden. Der Dig-Tag kann durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden, um das Vorhandensein von Interstrang-Querverbindungen im gesamten Zellkern aufzudecken.Um die Wechselwirkung von Replisomen mit Interstrang-Crosslinks zu visualisieren, kann PLA verwendet werden, um die Häufigkeit der Assoziation von MCM5 und dem Dig-Tag eine Stunde nach der Einführung der Interstrang-Crosslink-Vernetzung zu visualisieren. Da Replikationsstress die ATR-Kinase aktiviert, ist die PLA zwischen pMCM und Serin 108 und dem Dig-Tag ebenfalls positiv. Die PLA-Ergebnisse einzelner Kerne können in einer dreidimensionalen Rekonstruktion dargestellt werden, die die Visualisierung von Replisom-Interstrang-Vernetzungsbegegnungen im gesamten Zellkern ermöglicht.Die Replikationsgabelanalyse zeigt, dass Begegnungen mit Interstrang-Vernetzungen ein unerwartetes Phänomen des Replikations-Neustarts aufweisen, da die Proteine des GINS-Komplexes kein PLA-Signal mit den Interstrang-Querverbindungen aufweisen. Im Gegensatz dazu ist der Assay mit CD 45 positiv, was darauf hindeutet, dass das andere Locking-Protein erhalten bleibt. Wenn Zellen mit einem ATR-Inhibitor inkubiert werden, wird der Neustart vollständig unterdrückt und die GINS Dig PLAs stark positiv.Die CSK+R-Behandlung ist für die Reduzierung des Hintergrundsignals unerlässlich. Achten Sie darauf, die Platten mit einem Zellkleber zu beschichten und mit 0,1 % FA zu versehen, da sich die Zellen sonst von der Platte ablösen.

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Forschung

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...