Name: visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion at JoVE.com

מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, המכון הלאומי להזדקנות, ארצות הברית (Z01-AG000746-08). J.H. נתמך על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (21708007 ו -31871365).

1. הכנת תאים
<ol><li>יום 1<ol><li>טפלו מראש בכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בתמיסת הדבקת תאים.</li>
		<li>תאי צלחת במנות שטופלו מראש יום לפני הטיפול. התא צריך להתחלק באופן פעיל ו 50-70% במפגש ביום הניסוי. הערה: תאי HeLa שימשו בניסוי זה עם Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1x פניצילין / סטרפט...

<ol>
	<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly.">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks.">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li><li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+An+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).</li><li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues.">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li><li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks.">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li><li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing.">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li><li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells:+step+by+step.">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li><li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site.">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li><li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks.">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li><li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility.">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li><li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts.">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li><li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP/SLX4.">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li><li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair.">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li><li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psoralens.+An+historical+perspective.">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks.">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li><li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays.">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR,+FANCM,+and+FANCD2.">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts.">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).</li><li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+kinase+ATR:+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome.">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li><li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases.">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li><li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging.">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).</li><li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NPAT,+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2,+promotes+S-phase+entry.">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes &amp; Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li></ol>

למרות שה- PLA היא טכניקה חזקה מאוד, ישנם חששות טכניים שיש לפתור על מנת להשיג תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. הנוגדנים חייבים להיות בעלי זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, חשוב להפחית את אותות הרקע הלא ספציפיים ככל האפשר. גילינו שקרומים ופסולת תאית תורמים לרקע, והסרנו אותם ככל האפשר. השטיפות עם חו?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

התגובה התאית לשברים כפולים מתועדת היטב הודות לרצף של שיטות חזקות יותר ויותר להכוונת הפסקות לאתרים גנומיים ספציפיים 1,2,3. ודאות המיקום מאפשרת אפיון חד משמעי של חלבונים וגורמים אחרים המצטברים באתר ומשתתפים בתגובת הנזק לדנ"א (DDR), ובכך מניעים את מסלולי חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) והקומבינציה ההומולוגית (HR) המתקנים שברים. כמובן, הפסקות רבות מוצגות על ידי סוכנים כגון קרינה ומינים כימיים שאינם תוקפים רצפים ספציפיים4. עם זאת, עבור אלה ישנם נהלים זמינים שיכולים להמיר את הקצוות למבנים מקובלים עבור תיוג לוקליזציה 5,6. הפסקות מוצגות גם על ידי תהליכים ביולוגיים, כגון סידור מחדש של אימונוגלובולינים, והטכנולוגיה העדכנית מאפשרת לוקליזציה שלהם, כמו גם7. לאחר מכן ניתן לקבוע את הקשר בין הגורמים המגיבים לבין אתרים אלה.
הפסקות מופיעות גם כתוצאה עקיפה של אדדוקציות הנוצרות על ידי תרכובות שאינן מפסקות אינהרנטיות אלא משבשות עסקאות DNA כגון שעתוק ושכפול. הם עשויים להיווצר כתכונה של התגובה התאית לחסימות אלה, אולי במהלך תיקון או משום שהם מעוררים מבנה פגיע להתקפת נוקלאז. בדרך כלל, הקשר הפיזי בין האדוקט, ההפסקה והקשר עם גורמים מגיבים הוא היסק. לדוגמה, כילים נוצרים על ידי כימותרפיות כגון ציספלטין ומיטומיצין C8 וכתוצר תגובה של אתרים בסיסיים9. מזלגות כיל ידועים כבלוקים חזקים למזלגות שכפול10, ובכך מעכבים מזלגות שניתן לבקע על ידי נוקלאזות11. הקישור הקוולנטי בין הגדילים מוקל לעתים קרובות על ידי מסלולים שיש להם הפסקות מחייבות כביניים 12,13, מה שמחייב רקומבינציה הומולוגית כדי לבנות מחדש את מזלג השכפול14. ברוב הניסויים עוקב החוקר אחר תגובת הגורמים המעניינים להפסקות הנוצרות במורד הזרם של התנגשות מזלג שכפול עם כיל. עם זאת, מכיוון שלא נמצאה טכנולוגיה ללוקליזציה של נגע פרובוקטיבי, ניתן רק להניח את קרבתו של הרפליזום, וחלקיו המרכיבים, לכיל.
פיתחנו אסטרטגיה המאפשרת ניתוח של אסוציאציות חלבוניות עם אדדוקטים קוולנטיים ספציפיים שאינם רצפים, כפי שמודגם כאן על ידי ICLs. במערכת שלנו אלה מוצגים על ידי psoralen, מוצר טבעי פוטואקטיבי המשמש במשך אלפי שנים כטיפול להפרעות עור15. הגישה שלנו מבוססת על שתי תכונות חשובות של פסאורלן. הראשון הוא התדירות הגבוהה שלהם של היווצרות crosslink, אשר יכול לעלות על 90% של adducts, בניגוד פחות מ 10% שנוצרו על ידי תרכובות פופולריות כגון cisplatin או Mitomycin C 8,16. השני הוא נגישות המתחם לצמידות ללא אובדן יכולת הצלבה. קישרנו באופן קוולנטי בין טרימתיל פסאורלן לדיגוקסיגנין (Dig), אימונוטאג ותיק. זה מאפשר זיהוי של adducts psoralen בדנ"א גנומי על ידי immunostaining של תג Dig, והדמיה על ידי immunofluorescence קונבנציונאלי17.
מגיב זה יושם, בעבודתנו הקודמת, לניתוח מפגשי מזלג שכפול עם כיל באמצעות בדיקה מבוססת סיבי DNA16. בעבודה זו מצאנו כי השכפול יכול להימשך מעבר לכיל שלמה. זה היה תלוי בקינאז ATR, אשר מופעל על ידי מתח שכפול. ההפעלה מחדש של השכפול הייתה בלתי צפויה בהתחשב במבנה של מנחת המסוקים המשוכפל CMG. זה מורכב מהטרו-הקסמר MCM (M) היוצר טבעת פעורת היסט סביב גדיל התבנית לסינתזה מובילה של גדיל אשר ננעל על ידי החלבונים של קומפלקס GINS (G, המורכב מ- PSF1, 2, 3 ו- SLD5) ו- CDC45 (C)18. ההצעה כי השכפול יופעל מחדש בצד הדיסטלי של כיל לצד ההתנגשות של הרפליזום טענה לשינוי במבנה הרפליזום. כדי לענות על השאלה אילו רכיבים היו בתשובה בזמן המפגש עם כיל פיתחנו את הגישה המתוארת כאן. ניצלנו את תג Dig כשותף ב-Proximity Ligation Assays (PLA)19 כדי לחקור את הקשר ההדוק של כיל עם חלבונים של replisome20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10011</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates with glass 1.5 coverslip</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10001</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>1900-0012</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDC45 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126762</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell adhesive</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>354240</td>
			<td>for cell-TAK solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikkon</td>
			<td>Nikon TE2000 spinning disk microscope</td>
			<td>equiped with Volocity software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab420</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig-TMP</td>
			<td>synthesized in the Seidman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Amplification reagents (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82010</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ detection reagents</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28906</td>
			<td>for fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31873</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>open source</td>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>works for analysis of single plane images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software-license required</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td>Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase (1 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation reagent (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM2 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4461</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM5 antibody (rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab75975</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Lab ALLEY</td>
			<td>A2076</td>
			<td>pre-cold at -20&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109271</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase (10 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold mounting media with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSF1 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181112</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A 100 mg/ml</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software</td>
			<td>open source</td>
			<td>R studio</td>
			<td>ggplot2 package for generation of dot plot and box plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software-license required</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>Sigmaplot V13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMP (trioxalen)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6137_1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787_250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416_100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Southern New England Ultraviolet</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV test Chamber</td>
			<td>Opsytec</td>
			<td>UV TEST CHAMBER BS-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-821</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8007</td>
			<td>final concentrtion is 1&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion

תובנה משמעותית קיימת לגבי התגובה התאית לשברי גדיל כפול (DSB), הנגרמים על ידי נוקלאזות, קרינה ומפסקי דנ"א אחרים. בין השאר, הדבר משקף את זמינותן של שיטות לזיהוי אתרי הפסקה, ואת אפיון הגורמים שגויסו ל-DSB ברצפים אלה. עם זאת, DSBs מופיעים גם כמתווכים במהלך עיבוד של צינורות DNA שנוצרו על ידי תרכובות שאינן גורמות ישירות להפסקות, ואינן מגיבות באתרי רצף ספציפיים. כתוצאה מכך, עבור רוב סוכנים אלה, טכנולוגיות המאפשרות ניתוח של אינטראקציות קשירה עם גורמי תגובה וחלבוני תיקון אינם ידועים. לדוגמה, קישורים צולבים בין גדילי דנ"א (ICLs) יכולים לעורר שברים בעקבות מפגשי מזלג שכפול. למרות שנוצרו על ידי תרופות בשימוש נרחב כמו כימותרפיה סרטן, לא היתה מתודולוגיה לניטור האינטראקציות שלהם עם חלבונים שכפול.
כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו לעקוב אחר התגובה התאית להתנגשויות מזלג עם adducts מאתגר אלה. קישרנו אנטיגן סטרואידים לפסורלן, היוצר כיל תלוי פוטואקטיבציה בגרעינים של תאים חיים. הכילים הודגמו על ידי אימונופלואורסנציה כנגד תג האנטיגן. התג יכול גם להיות שותף בבדיקת קשירת הקרבה (PLA) המדווחת על קשר הדוק של שני אנטיגנים. ה-PLA נוצל כדי להבדיל בין חלבונים שהיו קשורים קשר הדוק עם כיל מתויגת לבין חלבונים שלא. ניתן היה להגדיר חלבונים רפליזומיים שנשמרו לאחר מפגשים עם כיל ולזהות חלבונים אחרים שאבדו. גישה זו ישימה לכל מבנה או צינור DNA שניתן לזהות באופן אימונולוגי.

PLA של Dig-TMP עם חלבונים replisome המבנה של Dig-TMP מוצג באיור 1. פרטי הסינתזה, שבה טרימתיל פסאורלן צומד באמצעות מקשר גליקול לדיגוקסיגנין, נדונו בעבר17,21. דגירה של תאים עם התרכובת ואחריה חשיפה לאור 365 ננומטר (UVA) פוטואקטיבית את התרכובת ומניעה את ?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion at JoVE.com

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

טכניקה זו מקלה על הדמיה של מפגשי DNA מתויגים אנטיגן replisome וניתן להרחיב אותה לאינטראקציות של כל חלבון עם מבנה DNA או נגע מקובל על immunodetection. שיטה זו יכולה לשמש להערכת תדרי אינטראקציה בתוך תאים בודדים, ולא על פני אוכלוסייה, ומאפשרת הדמיה של אינטראקציות תלויות מחזור התא באתרן מבלי לפגוע בתאים. מי שידגים את ההליך יהיה אישני מג'ומדר, פוסט-דוקטורנט ממעבדת זיידמן.ביום שלפני הניסוי, זרעו 1.5 כפול 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של בינוני על צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ שטופלו מראש בתמיסת דבק תאים. למחרת, החליפו את הסופרנאטנט בכל צלחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-5 תרביות תאים בנפח 50% עד 70% והחזירו את הצלחות לאינקובטור תרביות התא למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig TMP להתאזן. בזמן שהתאים דוגרים, מחממים מראש קופסת UV ל -37 מעלות צלזיוס.בתום שיווי המשקל, מעבירים את הצלחות לקופסה המחוממת מראש כדי לחשוף את התאים למנת אור UVA של שלוש דקות של שלושה ג'אול לסמ"ר ומחליפים את הסופרנאטנטים בשני מיליליטר של מדיום תרבית טרי שחומם מראש לפני החזרת הצלחות לאינקובטור תרביות התאים למשך שעה. בסוף הדגירה, שטפו בעדינות את התרביות עם PBS וקיבעו את התאים עם מיליליטר אחד של 0.1% פורמלדהיד ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני שטיפלו בתאים פעמיים עם 80 מיקרוליטר של חיץ מיצוי שלד ציטו-שלד בתוספת RNase במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לכל טיפול כדי להסיר את הציטופלסמה.לאחר הדגירה השנייה, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS שלוש פעמים לפני קיבוע התאים עם מיליליטר אחד של 4% פורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע השני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם, ולאחר מכן טיפול עם מיליליטר אחד של מתנול קר 100% במשך 20 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות ב 80 מיקרוליטר של חמישה מילימולרים טריטון X-100 בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לטפל בתאים עם 100 מיקרוליטר של חמישה מילימולר EDTA ב PBS, בתוספת מיקרוליטר אחד של 100 מיליגרם למיליליטר של RNase A במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לפני אחסונם באלבומין בסרום בקר 5% ובסרום חמור 10% ב-PBS בתא לח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לביצוע בדיקת קשירת קרבה, מוסיפים 40 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית המעניינת למרכז כל צלחת ודגרים על הצלחות בתא הלח למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBST לפני הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA טרייה שהוכנה לכל צלחת לדגירת שעה באינקובטור תרביות התא. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שלוש שטיפות של 10 דקות בשני מיליליטר של חיץ A על פלטפורמת הטיה בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תערובת קשירה טרייה לכל צלחת לדגירת 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות של שתי דקות בחיץ A על משטח ההטיה.לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה טרייה לכל צלחת לדגירה של 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח. בתום הדגירה, שטפו את התאים שש פעמים עם חיץ B טרי במשך 10 דקות לכל שטיפה על משטח ההטיה. לאחר שטיפת החיץ B האחרונה, שטפו את התאים פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני התיוג עם הנוגדנים המשניים המתאימים בתא הלח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות של 10 דקות על משטח הטיה ב-PBST בטמפרטורת החדר לפני הרכבתן באמצעי הרכבה בתוספת DAPI. בתוך ארבעה ימים מרגע ההרכבה, צלם לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או התנה תאים במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי, תוך שימוש באותן הגדרות חשיפה הן עבור דגימות ניסוי והן עבור דגימות ביקורת. התג Dig ניתן לדמיין על ידי immunofluorescence כדי לחשוף את נוכחותם של crosslinks interstrand ברחבי הגרעין.כדי להמחיש את האינטראקציה של replisomes עם crosslinks interstrand, PLA יכול להיות מיושם כדי לדמיין את תדירות האסוציאציה של MCM5 ואת התג Dig, שעה לאחר הצגת interstrand crosslink. כאשר לחץ השכפול מפעיל ATR קינאז, ה-PLA בין pMCM שני סרין 108 ותג Dig הוא גם חיובי. תוצאות PLA מגרעינים בודדים יכולות להיות מוצגות בשחזור תלת ממדי המאפשר הדמיה של מפגשי קישור בין-גדילי ברחבי הגרעין.ניתוח Replication Fork מצביע על כך שמפגשים בין גדילי crosslink מדגימים תופעה בלתי צפויה של שכפול מחדש, מכיוון שהחלבונים של קומפלקס GINS אינם מצליחים להציג אות PLA עם הקרוסלינקים הבין-גדיליים. לעומת זאת, הבדיקה עם CD 45 היא חיובית, מה שמצביע על כך שהחלבון הנועל האחר נשמר. כאשר תאים מודגרים עם מעכב ATR, ההפעלה מחדש מדוכאת לחלוטין ואת GINS Dig PLA חיובי מאוד.טיפול CSK+R חיוני להפחתת אות הרקע. הקפידו לצפות את הצלחות בדבק תאים ולבצע קידומת עם 0.1% FA, אחרת התאים יתקלפו מהצלחת.

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...