Name: visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion at JoVE.com

Denna forskning stöddes delvis av NIH: s intramurala forskningsprogram, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746–08). J.H. stöds av National Natural Science Foundations of China (21708007 och 31871365).

1. Förberedelse av celler
<ol><li>Dag 1<ol><li>Förbehandla 35 mm odlingsskålar med glasbotten med en cellhäftande lösning.</li>
		<li>Plattceller i de förbehandlade rätterna en dag före behandling. Cellen ska dela aktivt och 50-70% sammanflytande på experimentets dag. OBS: HeLa-celler användes i detta experiment med Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin. Det finns ingen begränsning för vidhäftande cellinjer. Icke-vidhäftande celler m...

<ol>
	<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly.">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks.">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li><li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+An+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).</li><li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues.">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li><li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks.">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li><li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing.">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li><li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells:+step+by+step.">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li><li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site.">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li><li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks.">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li><li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility.">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li><li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts.">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li><li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP/SLX4.">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li><li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair.">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li><li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psoralens.+An+historical+perspective.">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks.">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li><li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays.">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR,+FANCM,+and+FANCD2.">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts.">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).</li><li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+kinase+ATR:+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome.">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li><li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases.">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li><li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging.">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).</li><li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NPAT,+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2,+promotes+S-phase+entry.">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes &amp; Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li></ol>

Även om PLA är en mycket kraftfull teknik finns det tekniska problem som måste lösas för att få tydliga och reproducerbara resultat. Antikropparna måste ha hög affinitet och specificitet. Dessutom är det viktigt att minska de ospecifika bakgrundssignalerna så mycket som möjligt. Vi har funnit att membran och cellulärt skräp bidrar till bakgrunden, och vi har tagit bort dem så mycket som möjligt. Tvätten med tvättmedel som innehåller buffertar före fixering och tvätten med metanol efter fixering bidrar...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Det cellulära svaret på dubbelsträngbrott är väl dokumenterat på grund av en följd av allt kraftfullare metoder för att rikta raster till specifika genomiska platser 1,2,3. Säkerheten på plats möjliggör entydig karakterisering av proteiner och andra faktorer som ackumuleras på platsen och deltar i DNA Damage Response (DDR) och därigenom driver de icke-homologa ändfogningsvägarna (NHEJ) och homolog rekombination (HR) som reparerar brott. Naturligtvis introduceras många pauser av medel som strålning och kemiska arter som inte attackerar specifika sekvenser4. För dessa finns det dock procedurer tillgängliga som kan konvertera ändarna till strukturer som är mottagliga för märkning och lokalisering 5,6. Avbrott introduceras också genom biologiska processer, såsom immunoglobulinomläggning, och ny teknik tillåter också lokalisering7. Förhållandet mellan svarande faktorer och dessa platser kan sedan bestämmas.
Avbrott uppträder också som en indirekt följd av addukter bildade av föreningar som inte är inneboende brytare men stör DNA-transaktioner som transkription och replikation. De kan bildas som en egenskap hos det cellulära svaret på dessa hinder, kanske under reparation eller för att de provocerar en struktur som är sårbar för nukleasattack. Vanligtvis är det fysiska förhållandet mellan addukten, pausen och föreningen med svarande faktorer inferentiell. Till exempel bildas ICL av kemoterapeutika såsom cisplatin och Mitomycin C8 och som en reaktionsprodukt av abasiska platser9. ICL är välkända som potenta block till replikationsgafflar10, vilket stoppar gafflar som kan klyvas av nukleaser11. Den kovalenta kopplingen mellan strängar lindras ofta av vägar som har obligatoriska brott som intermediärer 12,13, vilket kräver homolog rekombination för att återuppbygga replikationsgaffeln14. I de flesta experiment följer utredaren responsen av faktorer av intresse för de brott som bildas nedströms kollisionen mellan en replikationsgaffel och en ICL. Men eftersom det inte har funnits någon teknik för lokalisering av en provocerande lesion, kan närheten av svaret och dess beståndsdelar till ICL endast antas.
Vi har utvecklat en strategi för att möjliggöra analys av proteinföreningar med icke-sekvensspecifika kovalenta addukter, illustrerad här av ICL. I vårt system introduceras dessa av psoralen, en fotoaktiv naturlig produkt som använts i tusentals år som en terapeutisk behandling för hudsjukdomar15. Vårt tillvägagångssätt bygger på två viktiga egenskaper hos psoralener. Den första är deras höga frekvens av tvärbindningsbildning, som kan överstiga 90% av addukterna, i motsats till de mindre än 10% som bildas av populära föreningar såsom cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den andra är föreningens tillgänglighet till konjugering utan förlust av tvärbindningskapacitet. Vi har kovalent kopplat trimetyl psoralen till Digoxigenin (Dig), en sedan länge etablerad immunotag. Detta möjliggör detektion av psoralenaddukterna i genomiskt DNA genom immunfärgning av Dig-taggen och visualisering genom konventionell immunofluorescens17.
Detta reagens tillämpades, i vårt tidigare arbete, på analys av replikationsgaffelmöten med ICL med hjälp av en DNA-fiberbaserad analys16. I det arbetet fann vi att replikering kunde fortsätta förbi en intakt ICL. Detta var beroende av ATR-kinaset, som aktiveras av replikationsstress. Omstarten av replikeringen var oväntad med tanke på strukturen hos CMG-replikativ helikas. Detta består av MCM-heterohexameren (M) som bildar en offsetgapad ring runt mallsträngen för ledande strängsyntes som är låst av proteinerna i GINS-komplexet (G, bestående av PSF1, 2, 3 och SLD5) och CDC45 (C) 18. Förslaget att replikering skulle kunna återupptas på sidan av ICL distalt till sidan av den svarande kollisionen argumenterade för en förändring av svarets struktur. För att ta itu med frågan om vilka komponenter som var i svaret vid tidpunkten för mötet med en ICL utvecklade vi det tillvägagångssätt som beskrivs här. Vi utnyttjade Dig-taggen som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 för att förhöra ICL: s nära samband med proteiner i repliken20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10011</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates with glass 1.5 coverslip</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10001</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>1900-0012</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDC45 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126762</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell adhesive</td>
			<td>Life Science</td>
			<td>354240</td>
			<td>for cell-TAK solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikkon</td>
			<td>Nikon TE2000 spinning disk microscope</td>
			<td>equiped with Volocity software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab420</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig-TMP</td>
			<td>synthesized in the Seidman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink Amplification reagents (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82010</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ detection reagents</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink in situ wash buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28906</td>
			<td>for fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31873</td>
			<td>Blocking solution, reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>open source</td>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>works for analysis of single plane images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software-license required</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td>Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase (1 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation reagent (5&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM2 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4461</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCM5 antibody (rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab75975</td>
			<td>1 in 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Lab ALLEY</td>
			<td>A2076</td>
			<td>pre-cold at -20&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109271</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase (10 unit/&#956;l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>reagents need to be stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold mounting media with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSF1 antibody (rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181112</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A 100 mg/ml</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>reagents need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software</td>
			<td>open source</td>
			<td>R studio</td>
			<td>ggplot2 package for generation of dot plot and box plots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis and data visualization software-license required</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>Sigmaplot V13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMP (trioxalen)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6137_1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787_250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416_100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV box</td>
			<td>Southern New England Ultraviolet</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV test Chamber</td>
			<td>Opsytec</td>
			<td>UV TEST CHAMBER BS-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-821</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8007</td>
			<td>final concentrtion is 1&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of replisome encounters with an antigen tagged blocking lesion

Betydande insikt finns i det cellulära svaret på dubbelsträngbrott (DSB), inducerade av nukleaser, strålning och andra DNA-brytare. Delvis återspeglar detta tillgången på metoder för identifiering av brytplatser och karakterisering av faktorer som rekryterats till DSB vid dessa sekvenser. DSB uppträder emellertid också som mellanprodukter under bearbetningen av DNA-addukter bildade av föreningar som inte direkt orsakar brott och inte reagerar vid specifika sekvensställen. Följaktligen är tekniker som möjliggör analys av bindningsinteraktioner med responsfaktorer och reparationsproteiner okända för de flesta av dessa medel. Till exempel kan DNA-interstrandtvärbindningar (ICL) provocera avbrott efter replikationsgaffelmöten. Även om det bildas av läkemedel som ofta används som cancerkemoterapeutika, har det inte funnits någon metod för att övervaka deras interaktioner med replikationsproteiner.
Här beskriver vi vår strategi för att följa det cellulära svaret på gaffelkollisioner med dessa utmanande addukter. Vi kopplade ett steroidantigen till psoralen, som bildar fotoaktiveringsberoende ICL i kärnor i levande celler. ICL: erna visualiserades genom immunofluorescens mot antigenmärket. Taggen kan också vara en partner i Proximity Ligation Assay (PLA) som rapporterar nära associering av två antigener. PLA utnyttjades för att skilja proteiner som var nära associerade med de märkta ICL: erna från de som inte var. Det var möjligt att definiera svarande proteiner som behölls efter möten med ICL och identifiera andra som förlorades. Detta tillvägagångssätt är tillämpligt på alla strukturer eller DNA-addukter som kan detekteras immunologiskt.

PLA av Dig-TMP med replisomproteiner Strukturen för Dig-TMP visas i figur 1. Detaljerna i syntesen, där trimetylpsoralen konjugerades genom en glykollänkare till digoxigenin, har diskuterats tidigare17,21. Inkubation av celler med föreningen följt av exponering för 365 nm ljus (UVA) fotoaktiverar föreningen och driver tvärbindningsreaktionen. Något mer än 90% av addukterna är ICL16</su...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion at JoVE.com

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Medan replikationsgaffelkollisioner med DNA-addukter kan inducera dubbelsträngsbrott, är mindre känt om interaktionen mellan replisomer och blockerande lesioner. Vi har använt närhetsligeringsanalysen för att visualisera dessa möten och för att karakterisera konsekvenserna för svarande komposition.

Visualisering av svarande möten med en antigenmärkt blockerande lesion

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

Denna teknik underlättar visualiseringen av svarsamma antigenmärkta DNA-adduktmöten och kan utvidgas till interaktioner mellan vilket protein som helst med en DNA-struktur eller lesion som är mottaglig för immundetektion. Denna metod kan användas för att bedöma interaktionsfrekvenser inom enskilda celler, snarare än över en population, och möjliggör visualisering av cellcykelberoende interaktioner in situ utan att skada celler. Ishani Majumdar, postdoktor från Seidmanlaboratoriet, demonstrerar proceduren.Dagen före experimentet, frö 1,5 gånger 10 till de femte cellerna i två milliliter medium på 35 millimeter glasbottenodlingsrätter förbehandlade med cellhäftlösning. Nästa dag, byt ut supernatanten i varje skål med 37 grader Celsius Fem mikromolar Dig TMP-kompletterat medium till 50 till 70% sammanflytande cellkulturer och återför plattorna till cellodlingsinkubatorn i 30 minuter så att Dig TMP kan balansera. Medan cellerna inkuberar, förvärm en UV-låda till 37 grader Celsius.Vid slutet av jämvikten, överför plattorna till den förvärmda lådan för att exponera cellerna för en fem minuters UVA-ljusdos på tre joule per kvadratcentimeter och ersätt supernatanterna med två milliliter färskt förvärmt odlingsmedium innan plattorna återförs till cellodlingsinkubatorn i en timme. Vid slutet av inkubationen tvättas försiktigt kulturerna med PBS och fixerar cellerna med en milliliter 0,1% formaldehyd i PBS i fem minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna en gång med PBS innan du behandlar cellerna två gånger med 80 mikroliter cytoskelettextraktionsbuffert kompletterad med RNas i fem minuter vid rumstemperatur per behandling för att avlägsna cytoplasman.Efter den andra inkubationen, tvätta cellerna med två milliliter PBS tre gånger innan du fixerar cellerna med en milliliter 4% formaldehyd i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter den andra fixeringen, tvätta cellerna tre gånger med PBS enligt beviset, följt av behandling med en milliliter kall 100% metanol i 20 minuter vid minus 20 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna tre gånger i två milliliter PBS, följt av en 10 minuters inkubation i 80 mikroliter fem millimolar Triton X-100 vid fyra grader Celsius.Vid slutet av inkubationen behandla cellerna med 100 mikroliter fem millimolar EDTA i PBS, kompletterat med en mikroliter 100 milligram per milliliter RNas A i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna tre gånger i PBS innan de förvaras i 5% bovint serumalbumin och 10% åsneserum i PBS i en fuktig kammare över natten vid fyra grader Celsius. För att utföra en närhetsligeringsanalys, tillsätt 40 mikroliter av den primära antikroppslösningen av intresse till mitten av varje platta och inkubera plattorna i den fuktiga kammaren i en timme vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna tre gånger med två milliliter PBST innan du tillsätter 40 mikroliter nyberedd PLA-sondlösning till varje maträtt under en timmes inkubation i cellodlingsinkubatorn. Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna med tre 10-minuters tvättar i två milliliter buffert A på en lutande plattform vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten, tillsätt 40 mikroliter nyberedd ligeringsblandning till varje platta för en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius, följt av tre tvåminuterstvättar i buffert A på lutningsplattformen.Efter den sista tvätten tillsätt 40 mikroliter nyberedd förstärkningslösning till varje platta för en 100-minuters inkubation vid 37 grader Celsius i en fuktig kammare. Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna sex gånger med färsk buffert B i 10 minuter per tvätt på lutningsplattformen. Efter den sista buffert B-tvätten, tvätta cellerna en gång med 0,01x buffert B i en minut vid rumstemperatur innan du märker med lämpliga sekundära antikroppar i den fuktiga kammaren i 30 minuter vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, tvätta proverna med tre 10-minuters tvättar på en lutande plattform i PBST vid rumstemperatur innan du monterar dem i monteringsmedium kompletterat med DAPI. Inom fyra dagar efter monteringen avbildas minst 100 observationer per prov eller konditionsceller i ett epifluorescens- eller konfokalmikroskop, med samma exponeringsinställningar för både experimentella prover och kontrollprover. Dig-taggen kan visualiseras genom immunofluorescens för att avslöja närvaron av interstrandtvärbindningar i hela kärnan.För att visualisera interaktionen mellan svar med interstrandtvärbindningar kan PLA användas för att visualisera frekvensen för association av MCM5 och Dig-taggen, en timme efter introduktionen av interstrandtvärbindningen. Eftersom replikeringsstress aktiverar ATR-kinas är PLA mellan pMCM två serine 108 och Dig-taggen också positiv. PLA-resultaten från enskilda kärnor kan presenteras i en tredimensionell rekonstruktion som möjliggör visualisering av svarande interstrandtvärbindningsmöten i hela kärnan.Replikeringsgaffelanalys indikerar att interstrandtvärbindningsmöten visar ett oväntat fenomen för återstart av replikering, eftersom proteinerna i GINS-komplexet inte uppvisar PLA-signal med interstrandtvärbindningarna. Däremot är analysen med CD 45 positiv, vilket indikerar att det andra låsproteinet behålls. När celler inkuberas med en ATR-hämmare undertrycks omstarten helt och GINS Dig PLAs är starkt positiva.CSK+R-behandling är avgörande för att minska bakgrundssignalen. Var noga med att belägga plattorna med ett celllim och prefix med 0,1% FA, annars kommer cellerna att skala av plattan.

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Icke-invasiv 3D-visualisering med submikrona upplösning Använda Synchrotron-röntgen-tomografi

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Ett steg Rening av Twin-Strep-märkta proteiner och deras komplex på Strep-Tactin Resin tvärbunden med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Visualisering av miniSOG Märkta DNA Reparations Proteiner i kombination med Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualisering av Surface-tjudrade stora DNA-molekyler med ett fluorescerande protein-DNA-bindande peptid

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Med hjälp av pHluorin-märkta receptorer för att övervaka subcellulära lokalisering och handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Visualisering och kvantifiering av mesenkymala Cell adipogena differentiering Potential med en härstamning specifik markör

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Icke-invasiv övervakning av Mållesionens storlek i ett heterologt musmodell för endometrios

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...