Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال مشروع ممول من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي من خلال البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015، الهوية: P_37_668؛ اختصار DIABETER)، منحة من وزارة البحوث والابتكار الرومانية PCCDI- UEFISCDI، رقم المشروع PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 داخل PNCD III والأكاديمية الرومانية. يشكر المؤلفون كيرياكوس كيبريوس (جامعة باتراس، اليونان) على نصيحته السخية والوثيقة الصلة، أوفيديو كرويتو (جامعة الفنون الجميلة، بوخارست، رومانيا) للتصوير، وتحرير الأفلام، والتصميم الرسومي، ومهايلا براتو للحصول على المساعدة التقنية.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

الفيروسات الغدية المؤتلفة هي أداة متعددة الاستخدامات لتسليم الجينات والتعبير12،13،14. للحث على التعبير البروتيني القوي عن طريق النقل الأدينوفيرالي ، يتم إدخال تسلسل ترميز جين الاهتمام في جينوم الفيروس الغدي. نظام AdEasy adenoviral، وضعت في مختبر بيرت فوغلشتاين، ويضم البلازميد العمود الفقري (pAdEasy-1) التي تحتوي على معظم نوع البرية الفيروس الغدي المصلي 5 الجينوم، وناقل مكوك (pAdTrack)، مصممةلاستنساخالجينات 2،10. حذف الجينات الأدينوفيرالية E1 (المسؤولة عن تجميع جزيئات الفيروس المعدية) و E3 (ترميز البروتينات المشاركة في التهرب من مناعة المضيف) خلق مساحة في الجينوم الأدينوفيرالي ، حيث يمكن إدخال جين من الفائدة من 6.5-7.5 كيلوبايت2،3. هذا الحجم يكفي لكثير من الجينات، وخاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم أقصر introns15،16،17. وهناك أيضا الباحثين الإبلاغ عن إنتاج الفيروسات الغدية تحمل cDNA من متحول18،19،20. ومع ذلك، حصلنا على عائد أقل من التعبير المتحول للفيروسات الغدية الحاملة لل CDNA مقارنة بنظرائهم الذين يحملون جينا أو جينا صغيرا (البيانات غير مبينة).
تحسين وتكييف الطرق السابقة2،10،14،18،21، تكنولوجيا لإنتاج أدينوفيرالي يتطلب وقتا أقصر ، وانخفاض التكلفة ، وأقل جهد. يتم الحصول على الحمض النووي الأدينوفيرالي كامل الطول عن طريق إعادة التركيب بين ناقل المكوك والبلازميد pAdEasy-1 في سلالة E. coli المعرضة للتضمين المتجانس ، BJ5183. يتضمن البروتوكول التحول الكيميائي لخلايا AdEasier-1 (بكتيريا BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1). هذه التقنية لا تتطلب مطهر كهربائي قد لا تكون متاحة في بعض المختبرات، هو بسيط جدا، ويزيد من العائد إعادة التركيب، ويقلل من الوقت اللازم للحصول على الخلايا المختصة وإجراء التحول. كما أن الاختيار المسبق للمستنسخين المؤتلفين الذي يقوم به PCR يقلل من الوقت ويخفف من الإجراء بأكمله. تم استخدام إجراء مماثل من قبل تشاو وزملاء العمل22، ومع ذلك ، في البروتوكول ، قمنا بتحسين تسلسل العناوين التمهيدية.
بالنسبة لتغليف وتضخيم فيروس الغدة الحميدة GFP، تم استخدام خط خلايا مشتق HEK293، أي خلايا AD293، التي هي أكثر التزاما بلوحة الثقافة. خطوط الخلايا الأخرى المستخدمة عادة لإنتاج أدينوفيرالي هي التالية: 911، 293FT، pTG6559 (مشتق A549)، PER. C6 (مشتق لها)، GH329 (HeLa مشتق)، N52. E6، وهيلا-E123،24،25،26. في أيدينا، لم يتم الحصول على أي تحسن في إنتاج أدينوفيرالي عندما تم استخدام 911 خلية (البيانات غير مبينة). إن إصابة خلايا AD293 ببللازميد المؤتلف باستخدام كاشف K2 زادت بشكل كبير من كفاءة خطوة التعبئة والتغليف الفيروسية. بعد إنتاج الفيروس الغدي، ما يصل إلى ~ 70٪ من الفيروس الغدي لا يزال داخل الخلايا ويتم إطلاقه من قبل ثلاث دورات تجميد وذوبان الجليد. زيادة عدد الدورات ليست مناسبة لأنه يدمر الفيروس الغدي.
في جميع أنحاء عملية الإنتاج الأدينوفيرالي الروتينية ، يتم إطلاق العديد من الجسيمات الفيروسية في وسط زراعة الخلية. إن التخلص من هذه الوسيلة زراعة الخلية أثناء حصاد خلايا AD293 المصابة سيؤدي إلى فقدان الفيروسية الهامة. لقد قمنا بتحسين البروتوكول الذي وصفه Schagen وزملاء العمل لتنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من وسيط زراعة الخلايا عن طريق هطول الأمطار مع كبريتات الأمونيوم27. هذه الطريقة لديها كفاءة أعلى في استرداد الفيروس الغدي من الخلايا المتوسطة مقارنة مع طريقة استخدام البولي ايثيلين غليكول28. وينبغي تنقية الفيروس الغدي عجلت فورا عن طريق الطرد الفائق أو الاحتفاظ بها في الثلاجة لبضعة أيام ولكن فقط بعد غسيل الكلى، لإزالة فائض الملح. الحفاظ على عجل لفترة أطول من بضع ساعات دون غسيل الكلى ضار للفيروس.
تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية عن طريق الطرد المركزي الفائق التي أجريت في خطوة واحدة يقلل من التلاعب في المخزون أدينوفيرالي ويخفف الإجراء بالمقارنة مع البروتوكولات باستخدام خطوات الطرد الفائق المتعاقبة14،29. غسيل الكلى من الفيروس الغدي المنقى ضروري لإزالة كلوريد السيزيوم التي قد تؤثر بشكل أكبر على النقل. في البروتوكول، استخدمنا مخزن Tris المؤقت الذي يحتوي على MgCl2 ولكن ليس السكروز لغسيل الكلى، لأنه يتطلب كمية ضخمة وغير مبررة من السكروز المطلوبة بخلاف ذلك كمادة حافظة للتجميد. وهكذا، أضفنا السكروز في وقت لاحق، مباشرة إلى مخزونات أدينوفيرالية أعدت للتجميد. لتجنب التجميد المتكرر وذوبان الفيروس الغدي المنقى ، من المستحسن أن يتم تخزين المخزونات الأدينوفيرالية وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم تقييم التيتر الأدينوفيرالي عن طريق قياس التدفق الخلوي بالنظر إلى جين مراسل GFP والنسبة المئوية للخلايا المنقولة لتخفيف فيروسي محدد. هذه الطريقة أسرع بالمقارنة مع "فحص البلاك" الكلاسيكي وهي أكثر ثقة بالمقارنة مع تقييم البروتينات ذات الكبسولات (بطرق مختلفة مثل ELISA أو قياس التدفق الخلوي) والتي لا تكشف عن قدرة عدوى الجسيمات الأدينوفيرالية. ومع ذلك، فإن القياس الكمي القائم على ELISA، أو Q-PCR، أو فحص البلاك باستخدام مجموعات متاحة تجاريا هي طرق بديلة، مفيدة بشكل خاص لتكفير الفيروسات الغدية التي لا تحتوي على متتبع فلوري.
وبالنظر إلى أن الفيروسات الغدية pAdTrack مشتقة من الفيروسات الغدية البشرية من النمط المصلي 5 الذي يعترف به فيروس كوكساكي ومستقبلات فيروس أدينوفيروس (CAR)، أظهرنا قدرة فيروس الغدة الغددية GFP على تحويل الخلايا ذات الأصل البشري (الخلايا البطانية)، ولكن أيضا الخلايا ذات الأصول الأخرى: الأبقار (الخلايا البطانية) ومورين (الخلايا النجمية المتوسطة والخلايا الكبدية). وأظهرت البيانات أن فيروس الغدة الغامرة يمكن أن يحفز على مستوى عال من التعبير عن المتحولين جنسيا.
في الختام، قمنا بتحسين هذه التكنولوجيا الشاقة لتقليل الوقت والتكاليف والجهد اللازم للحصول على الجسيمات الأدينوفيرالية. الفيروس الغدي المعد قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا والحث على التعبير عن جين الاهتمام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من التجارب لأن نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية يمثل واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.
الاختصارات: AdV-GFP، الجسيمات أدينوفيرالية؛ BAEC, الخلايا البطانية الأبهري البقري; CSCl، كلوريد السيزيوم؛ GFP، بروتين فلوري أخضر. MSC, الخلايا النجمية mesenchymal; TU، وحدات التحويل.

الفيروسات الغدية هي فيروسات غير مجسمة تحتوي على نواة جينوم الحمض النووي الخطي المزدوج تقطعت بهم السبل1،2،3. يمكن أن تصيب الفيروسات الغدية مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والعدوى لا تعتمد على انقسام الخلايا المضيفة النشطة. بعد العدوى ، يدخل الفيروس الغدي حمضه النووي الجينومي في نواة الخلية المضيفة ، حيث يبقى epichromosomal ويتم نسخه مع جينات المضيف. وهكذا، يتم تحقيق الحد الأدنى من المخاطر المحتملة لتولد الطفرات الإدراجية أو تنظيم oncogenes4،5،6. لا يتم تكرار الجينوم الأدينوفيرالي جنبا إلى جنب مع الجينوم المضيف ، وبالتالي ، يتم تخفيف الجينات الأدينوفيرالية في مجموعة خلايا منقسمة. ومن بين مزايا النقل الأدينوفيرالي، هناك: '1' مستويات عالية من التعبير المتحول؛ '2' المستويات العالية من التعبير المتحول؛ '2' المستويات العالية من التعبير المتحول؛ '2' المستويات العالية من التعبير المتحول؛ '2' المستويات العالية من التعبير المتحول؛ '2' المستويات العالية من التعبير الجيني '2' تقليل المخاطر المتصلة بدمج الحمض النووي الفيروسي في الجينوم المضيف، بسبب التعبير الظهاري؛ '3' نقل طائفة واسعة من أنواع الخلايا الفاصلة وغير المقسمة. معظم الفيروسات الغدية المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية هي غير متماثلة، تفتقر إلى منطقة E17،8،9. لإنتاجها، مطلوب خط الخلية توريد تسلسل E1 (مثل HEK293). إلى جانب ذلك، تم حذف منطقة غير أساسية لدورة الحياة الفيروسية (E3) للسماح بإدخال متحول في الجينوم الفيروسي. تم حذف مناطق أخرى (E2 و E4) في بعض الفيروسات الغدية ، ولكن في هذه الحالات ، تم الإبلاغ عن انخفاض غلة إنتاج الغدية والتعبير المنخفض عن المتحول7.
هنا، نقدم بروتوكولا محسنا لبناء الفيروسات الغدية وتعبئتها وتنقية باستخدام نظام AdEasy. سمحت هذه التحسينات بتعبئة الفيروس الغدي بطريقة أسرع وأكثر اقتصادا بالمقارنة مع الطريقة الأصلية التي طورها بيرت فوغلشتاين2،10، بسبب المزايا التالية: (1) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا ؛ (2) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا ؛ '2' اختيار المستنسخين المؤتلفين بواسطة PCR؛ '3' نقل 293 AD الخلايا باستخدام نظام العدوى K2 للتغليف أدينوفيرالي؛ '4' هطول الجسيمات الأدينوفيرالية من وسط الاستزراع بعد التعبئة والتضخيم الفيروسيين؛ '5' تنقية الأدينوفيرالية باستخدام جهاز طرد فائق فائق التدرج من كلوريد السيزيوم من خطوة واحدة.
بروتوكول لإنتاج الفيروس الغدي باستخدام نظام AdEasy (الشكل 1) يتضمن الخطوات التالية:
(1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع pAdEasy-1 في بكتيريا BJ5183 (2) تغليف الجسيمات الأدينوفيرالية (3) تضخيم الفيروس الغدي (4) تنقية الجسيمات الأدنوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة (5) المعايرة من الفيروس الغدي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> الشكل 1: تكنولوجيا إنتاج الفيروس الغدي. الخطوات الرئيسية لتكنولوجيا أدينوفيرالي هي: (1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع البلازميد pAdEasy-1 في بكتيريا BJ5183. يتم تضخيم البلازميدات المختارة التي أعيد تركيبها في بكتيريا DH5α ثم تنقيتها. (2) تغليف الجسيمات الأدينوفيرالية في خلايا AD293، التي تنتج بروتينات أدينو-E1؛ (3) تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293؛ (4) تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية ووسط الثقافة عن طريق الطرد المركزي الفائق على تدرج كثافة CsCl؛ (5) المعايرة من الفيروس الغدي والاختبار الوظيفي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في هذا البروتوكول، قمنا بأمثلة على تكنولوجيا إنتاج الفيروس الغدي، والتي يمكن أن تحفز التعبير عن GFP في الخلايا المضيفة. يتم إدراج GFP بالفعل في العمود الفقري لمتجه المكوك pAdTrack-CMV (أدجين #16405) ، تحت مروج CMV الثاني ويستخدم كجين مراسل(الشكل 1). لهذا السبب، قمنا هنا بتعيين المتجه pAdTrack-CMV ك pAdTrack-GFP وقيمنا التعبير عن GFP لأغراض إثباتية. وإلى جانب التعبير عن GFP، يمكن استخدام النظام للتعبير عن جين مثير للاهتمام، والذي يمكن استنساخه في مواقع الاستنساخ المتعددة ل pAdTrack-CMV. الجين أو المستنسخة في pAdTrack-CMV عادة ما تكون أكثر كفاءة للتحريض التعبير بالمقارنة مع cDNA11. وأظهرت البيانات تعبير GFP قوية في الخلايا المنقولة (مثل خلايا الكبد والخلايا البطانية) من مصادر مختلفة (الإنسان والأبقار والمورين). يمثل نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

إن النقل الأدينوفيرالي له ميزة الحث القوي والعابرة للتعبير عن جين الاهتمام في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأعضاء. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيا الأدينوفيرالية المؤتلفة شاقة وتستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هنا، نقدم بروتوكول محسن باستخدام نظام pAdEasy للحصول على جزيئات أدينوفيرالية نقية يمكن أن تحفز على تعبير بروتين فلوري أخضر قوي (GFP) في الخلايا المنقولة. مزايا هذه الطريقة المحسنة هي إعداد أسرع وانخفاض تكلفة الإنتاج مقارنة مع الطريقة الأصلية التي وضعها بيرت فوغلشتاين. الخطوات الرئيسية لتكنولوجيا أدينوفيرالي هي: (1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع pAdEasy-1 plasmid في البكتيريا BJ5183; (2) التعبئة والتغليف من الجسيمات أدينوفيرالية؛ (3) تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293؛ (4) تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة؛ و (5) المعايرة الفيروسية والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي. تتكون التحسينات على الطريقة الأصلية من (1) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا؛ و (2) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا؛ و (2) إعادة التركيب في BJ5183-1 بواسطة التحويل الكيميائي للبكتيريا. '2' اختيار المستنسخين المستنسخين المستنسخين ب "سالب" و"إيجابي" من حيث ال PCR؛ '3' نقل 293 AD الخلايا باستخدام نظام العدوى K2 للتغليف أدينوفيرالي؛ '4' هطول الأمطار باستخدام كبريتات الأمونيوم للجسيمات الفيروسية التي تطلقها خلايا AD293 في وسط زراعة الخلايا؛ و(5) تنقية الفيروس عن طريق التدرج المتقطع من كلوريد السيزيوم من خطوة واحدة. تم الحصول على تعبير قوي عن جين الاهتمام (في هذه الحالة ، GFP) في أنواع مختلفة من الخلايا المنقولة (مثل خلايا الكبد والخلايا البطانية) من مصادر مختلفة (الإنسان والأبقار والمورين). يمثل نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.

قمنا بتعديل وتحسين بروتوكول Vogelstein الأصلي من أجل تحقيق إنتاج الفيروس الغدي بشكل أسرع وأكثر كفاءة. أولا، قمنا بمراجعة المنهجية لتحقيق اختيار أسهل للمتألفين. بعد إعادة التركيب، تم اختبار الحيوانات المستنسخة البكتيرية BJ5183 من قبل "PCR السلبية" لتقييم سلامة pAdTrack-GFP كمؤشر على عدم إعادة التركيب(الشكل 3A)،أو عن طريق "PCR إيجابية" لتحديد جين الفائدة، واستيعابها في حالتنا إلى GFP (الشكل 3B). في كل من "سلبية" و "إيجابية" PCRs، استخدمنا pAdTrack-GFP كقالب التحكم، الذي أعطى الفرقة من 986 bp لسلامة pAdTrack (الشكل 3A، حارة 1)، وعصابة من 264 نقطة أساس لGFP (الشكل 3B، حارة 3). تم تصميم البادئات المستخدمة في "PCR السلبية" لتضخيم جزء من 986 bp يحتوي على موقع PmeI في pAdTrack-GFP. يتم توسيع جزء الحمض النووي هذا بشكل كبير بعد إعادة التركيب ولا يتم تضخيمه في المستنسخين المؤتلفين الإيجابيين. يتم تمثيل المستنسخات السالبة لإعادة التركيب ، والتي ظلت فيها pAdTrack-GFP سليمة ، في الشكل 3Aوالممرات 3 و 4 و 6. التمهيديات على تسلسل الحمض النووي المجاور لموقع إعادة التركيب. وأعربت المستنسخات المؤتلفة الإيجابية المحتملة(الشكل 3 ألف،الممرات 2 و 5) عن GFP كما هو مبين في الشكل 3B، حارة 1 ، و 2. تم عزل الحمض النووي البلازميد من هذه المستنسخات واستخدامها لتحويل DH5α للحصول على كمية أعلى من الحمض النووي. ثم تم اختبار هذه البلازميدات المؤتلفة المحددة مسبقا التي تم تضخيمها في DH5α عن طريق الهضم الأنزيمي. في الشكل 3C-E ويتضح نتائج الهضم الأنزيمي لاستنساخ واحد المؤتلف إيجابية هضمها مع هند الثالث، PstI، BamHI تقييد الإنزيمات (الشكل 3C، D، E حارة 2). كانت أنماط الهضم HindIII و PstI للاستنساخ المؤتلف مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها لpAdEasy-1 منذ HindIII و PstI قطع pAdEasy-1 plasmid 24 و 25 مرة ، على التوالي ، (الشكل 3C و D، حارة 3)؛ قطع HindIII مرة واحدة وقطع PstI أربعة أضعاف ناقلات pAdTrack-GFP (الشكل 3C و D، حارة 1). BamHI قطع مرتين pAdEasy-1 ناقلات (الشكل 3C, حارة 3), ومرة واحدة pAdTrack-GFP (الشكل 3C, حارة 1).
قطع PacI جزء من 4.5 كيلوبايت من البلازميد المؤتلف(الشكل 3F، حارة 2) ، جزء من 2863 bp من pAdTrack-GFP (الشكل 3F، حارة 1) ، وخطيا متجه pAdEasy-1 (الشكل 3F، حارة 3). يتم تمثيل سلم الحمض النووي في الشكل 3C-F، في الممرات 4. تم هضم البلازميد المؤتلف مع Pac I لمزيد من الاستخدام ل AD293 transfection.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> الشكل 3: إعادة تركيب pAdTrack-GFP مع pAdEasy-1 البلازميد. تم اختبار البلازميدات التي تم الحصول عليها بعد إعادة دمج pAdTrack-GFP و pAdEasy-1 بواسطة PCR "سلبي" لسلامة pAdTrack-GFP (A). وقد تجلت المستنسخات غير المؤتلفة من خلال وجود نطاق 986 نقطة أساس مطابق للتسلسل الذي تم تضخيمه من pAdTrack-GFP plasmid (A والممرات 3 و 4 و 6). كما تم الحصول على المستنسخات التي يحتمل أن تكون إيجابية لإعادة التركيب (A، الممران 2 و5). عندما تم استخدام المتجه pAdTrack-GFP كقالب، تم الحصول على نطاق من 986 bp ل pAdTrack-GFP (A، lane 1). وقد تم اختبار المستنسخين المؤتلفين الذين يحتمل أن يكونوا إيجابيين للتعبير عن GFP عن طريق PCR "الإيجابي" (B)؛ يظهر نطاق من 264 نقطة أساس لكل من المستنسخين الذين يحتمل إعادة دمجهم (B، حارة 1 و 2)، وكذلك لpAdTrack-GFP plasmid. تم اختبار الحمض النووي من استنساخ واحد المؤتلف المحتملة مع HindIII، PstI، BamHI، وانزيم تقييد PacI (C-F، الممرات 2). في عناصر التحكم، تم هضم ناقل pAdEasy-1 (C-F، الممرات 3) وبلازميد pAdTrack-GFP (C-F، الممرات 1) بنفس الإنزيمات. يتم تمثيل سلم الحمض النووي في C-F حارة 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم إجراء التعبئة والتغليف الأدينوفيرالي والتضخيم في خلايا AD293. تم تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية (AdV-GFP) من lysate الخلية AD293 وكذلك من وسيط زراعة الخلية ، حيث تم إطلاقها من قبل الخلايا المصابة. لتركيز الفيروس الغدي الموجود في وسط زراعة الخلية ، تم تسريع الجسيمات مع كبريتات الأمونيوم ثم أعيد إنفاقها في 10 mM Tris HCl pH 8 مع 2 mM MgCl2، وهو نفس العازلة المستخدمة لتحلل الخلية. في وقت لاحق، تم تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية ومن وسيط الثقافة من قبل CsCl التدرج الانقطاع الطرد الفائق. بعد الطرد الفائق، تم الحصول على نطاق قوي من AdV-GFP المنقى، كما هو موضح في الشكل 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> الشكل 4: تنقية أدينوفيرالية بواسطة الطرد المركزي الفائق على تدرج CSCl متقطع. وقد تعرضت تجانس الخلية وفيروس الغدة الراسب من الوسط لطارد فائق التركيز على تدرج متقطع تشكله حلول CSCl منخفضة وعالية الكثافة. وجرى إثبات وجود نطاقات قوية من الفيروس الغدي GFP- في كلتا الحالتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لتحديد التيتر الفيروسي المعبر عنه في وحدات التحويل لكل مل واحد (TU/mL)، أصيبت خلايا AD293 بتمييع متسلسل ل AdV-GFP. بعد 48 ساعة ، عبرت الخلايا المصابة عن GFP ، في ارتباط عكسي مع عامل التخفيف للتعليق الفيروسي. وقد لوحظ ذلك عن طريق المجهر الفلوري، وتم تحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP من خلال قياس التدفق الخلوي(الشكل 5). لحساب التيتر ، تم النظر في التخفيف الفيروسي الذي تسبب في 5 - 20 ٪ من الخلايا الإيجابية GFP(الشكل 5C). عادة، نحصل على titer الفيروسية من ~ 1010 (TU / مل) لفيروس الغدة الحميدة GFP.
فيما يلي، نقدم مثالا على حساب التأر الغدي لدفعة أدينوفيرالية محددة تم فيها تحويل 300000 خلية (C) بمحلول أدينوفيرالي واحد مل (V)، عند عامل تمييع 106 (D)، والذي تم الحصول على 6٪ من الخلايا الإيجابية GFP (F):
تيتر (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 × 6/100 × 300000/1 = 1.8 × 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> الشكل 5: تقييم التيتر الأدينوفيرالي. أصيبت خلايا AD293 بتمييعات أدينوفيرالية مختلفة. بعد 48 ساعة، لوحظت الخلايا عن طريق المجهر الفلوري وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP الناجمة عن تخفيفات أدينوفيرالية مختلفة (A-D). لإنشاء بوابة لقياس التدفق الخلوي، تم تحليل الخلايا غير المنقولة أيضا (E). كان titer محسوبا لعامل التخفيف 106، عندما كانت 6٪ من الخلايا إيجابية GFP 1.8 × 1010 TU / mL. لوحات A-E، أشرطة: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لاختبار إمكانات نقل الفيروس الغدي المعد ، تم استخدام أربعة خطوط خلايا: الخلايا البطانية البشرية (EA.hy926) ، والخلايا البطانية الأبهري البقري (BAEC) ، والخلايا الكبدية المورينية (Hepa 1-6) ، والخلايا النجمية المتوسطة المورين (MSC). تم تحويل الخلايا البطانية (EA.hy926 وBAEC) مع 25 TU / الخلية ، وتم نقل خلايا الكبد مع 5 TU / الخلية وتم نقل MSC مع 250 TU / الخلية.
وفيما يلي مثال على كيفية حساب حجم التعليق الأدينوفيرالي اللازم لإصابة 3 ×10 6 خلايا ب 25 وحدة تو/خلية، باستخدام التعليق الأدينوفيرالي مع 1.8 ×10 10 TU/mL.
ل1 خلية .............. 25 تو 3 × 106 خلايا .............. x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x =75 × 106 TU إذا كان المخزون الفيروسي يحتوي على 1.8 × 1010 TU .............. 1 مل 75 × 106 TU .............. y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y = 4.2 × 10-3 مل = 4.2μL من المخزون الفيروسي
بعد 48 ساعة من التحويل، تم تحليل الخلايا عن طريق المجهر الفلوري. وكما هو مبين في الشكل 6،تم نقل الخلايا البطانية البشرية أو البقرية بكفاءة جيدة (~ 50٪) ل25 TU/cell (الشكل 6 EA.hy926 وBAEC). تم نقل خلايا الكبد مورين (هيبا 1-6) بكفاءة من قبل الفيروس الغدي في كمية منخفضة من جزيئات الفيروس الغدي (5 TU/cell)، لكنها حساسة أيضا للفيروس الغدي منذ أن تم تسجيل نسبة أعلى من الخلايا الميتة (الخلايا الإيجابية PI) (~ 16٪) بالمقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى. وكانت الخلايا النجمية Mesenchymal الأكثر صعوبة في التحويل (الشكل 6) ، بسبب عدم وجود مستقبلات أدينوفيرالية محددة (بيانات غير منشورة).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> الشكل 6: عدوى الفيروس الغدي وتحريض تعبير GFP في الخلايا المنقولة. تم تحويل الخلايا البطانية البشرية (EA.hy926) والخلايا البطانية الأبهري البقرية (BAEC) والخلايا الكبدية المورينية (Hepa 1-6) والخلايا النجمية المتوسطة المرينية (MSC) مع الكمية المشار إليها من الفيروس الغدي. تم الكشف عن GFP عن طريق المجهر الفلوري وتم تحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. تظهر الخلايا الإيجابية PI التي يحددها قياس التدفق الخلوي وفيات الخلايا التي يحددها النقل الفيروسي. EA.hy926 الخلايا، والخلايا البطانية الأبهري البقري، وخلايا هيبا 1-6 تم نقلها بشكل كبير من قبل الفيروس الغدي، وعائد النقل تتراوح بين 41-52٪. بالنسبة ل MSC ، فإن كمية أعلى من الفيروس (250 TU / الخلايا) تسببت فقط في 27٪ من GFP إيجابية من الخلايا المنقولة. أشرطة: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

هنا، نقدم بروتوكول لإنتاج الفيروس الغدي باستخدام نظام pAdEasy. وتشمل هذه التكنولوجيا إعادة دمج pAdTrack وpAdEasy-1 plasmids، والتعبئة والتغليف الفيروس الغدي والتضخيم، وتنقية الجسيمات أدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة، والحلمة الفيروسية، والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي.

طريقة فعالة لإنتاج فيروس أدينو

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

مرحبا بكم في معهد البيولوجيا الخلوية وعلم الأمراض، نيكولاي سيميونيسكو من بوخارست، رومانيا. هنا في مختبر النقل الفيروسي، نعرض جزءا من إنتاج الجسيمات الغدية باستخدام منهجية محسنة تستند إلى نظام AdEasy الذي طوره البروفيسور فوغلشتاين. الخطوات الرئيسية للتكنولوجيا لإنتاج هذه الفيروسات الغدية هي، واحد، إعادة دمج pAdTrack التي تحتوي على GFP مع pAdEasy-1 البلازميد في البكتيريا BJ5183.اثنين، التعبئة والتغليف الجسيمات أدينوفيرالية. ثالثا، تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293. أربعة، تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.خمسة، المعايرة الفيروسية والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي. وهنا، سنقدم خطوة هامة في المنهجية. تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.يبدأ تنقية الفيروس الغدي بحصاد الخلايا المنتجة للفيروس والمتوسط. تم تحويل خلايا AD293 مع البلازميد المؤتلف وكما تم حزم الفيروس الغدي. ثم تم تضخيم الفيروس الغدي من قبل الثقافات الكبيرة المتعاقبة.هنا، حصلنا على 25 لوحة T175، وبدأنا تنقية الفيروس الغدي من lysate الخلية ووسط الثقافة. أولا، تحققنا من الفلورسينس الأخضر ل GFP الذي تعبر عنه الخلايا المنقولة. إذا كانت الخلايا لا تزال متصلة، وسوف فصل لهم عن طريق النقر على طبق الثقافة أو باستخدام مكشطة طويلة.يتم جمع الخلايا والمتوسطة. يتم غسل قوارير مع برنامج تلفزيوني، والتي يتم جمعها أيضا في أنابيب فالكون. يتم كريات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.الحفاظ على بيليه الخلية وكذلك وسيلة لمزيد من تنقية الفيروس الغدي. وفي هذه الخطوة، تحظى مساعدة زميل بتقدير كبير لتسريع عملية الحصاد. بيليه الخلية خضراء بسبب التعبير GFP.يتم إعادة إنفاق بيليه في العازلة تريس hypertonic، والتي من شأنها تسهيل تعطيل الخلايا. بالنسبة لتحلل الخلايا، نستخدم النيتروجين السائل والغاز الجاف الذي يصل درجة حرارته إلى 37 درجة. لا تؤدي أكثر من ثلاث دورات لأن الفيروس سوف يتلف.لزيادة كفاءة تعطيل الخلية تمر بعناية الخلية تجانس من خلال إبرة حقنة قياس 23. الطرد المركزي الخلية lysate في 9، 600 × ز لمدة 12 دقيقة. تمرير supernatant في أنابيب جديدة والتخلص من الكريات.الحفاظ على supernatant على الجليد لمزيد من المعالجة عن طريق أجهزة الطرد المركزي للغاية. الآن، نعالج وسيط الثقافة لعزل الفيروس الغدي المنبعث من الخلايا. لهذا، أولا، نحن الوزن الكمية اللازمة من كبريتات الأمونيوم وإضافته إلى الزجاجة التي تم جمعها في المتوسط الثقافة.الزجاجة تهتز بقوة حتى يتم إذابة البلورات تماما. يتم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ونصف. ثم ينقسم تعليق الراسب إلى أنابيب فالكون.جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 1, 600 x g. بعد الطرد المركزي ، يتم التخلص من الناموستة العملاقة ويتم إعادة إنفاق بيليه في 10 ملليمولار تريس العازلة. إذا كان لا يمكن للمرء أن يستمر في تنقية الفيروس الغدي مع خطوة الطرد المركزي الفائق ، يمكن الاحتفاظ المرسب لبضعة أيام في أربع درجات ، ولكن فقط بعد غسيل الكلى لإزالة كبريتات الأمونيوم.هنا، قدمنا خطوة غسيل الكلى. نحن نستخدم حقنة لإدخال التعليق في كاسيت مبلل سابقا. يتم الاتصال بالعينات مقابل 10 ملليمولار تريس العازلة بين عشية وضحاها في أربع درجات.وتمثل الخطوة الأخيرة من تنقية خطوة الطرد الفائق على التدرج كلوريد السيزيوم متقطعة. لتشكيل التدرج، أولا، نحن ماصة ثلاثة ملليلتر من محلول الكثافة العالية من كلوريد السيزيوم. فوق هذه الطبقة، صب بلطف ثلاثة ملليلتر من كلوريد السيزيوم منخفض الكثافة.تعليق الجسيمات أدينوفيرالي من lysate الخلية أو الوسط الثقافة ثم يتم تراكب على رأس التدرج. تمتلئ الأنابيب بالزيت المعدني ويتم إدخالها في دلاء SW41. بعد التوازن ، يتم تحميل الأنابيب بشكل متناظر في الدوار ، والذي يتم إدخاله في جهاز الطرد المركزي الفائق.يعمل جهاز الطرد المركزي على 35,000 دورة في الدقيقة وأربع درجات لمدة 18 ساعة دون انقطاع. بعد الطرد الفائق ، يتم وضع الأنابيب على حامل مع ورقة سوداء خلفها من أجل حصاد العصابات. يتم التخلص من المرحلة العليا واضحة وحطام الخلية في حاوية النفايات مع محلول التبييض.يتم حصاد أدنى نطاق يحتوي على الفيروس الغدي الكامل مع طرف ماصة ويتم جمعها في أنبوب Eppendorf معقم. بعد غسيل الكلى، يضاف السكروز إلى التعليق الفيروسي إلى تركيز نهائي بنسبة 4٪، ويتم الاحتفاظ بالعليكوت الفيروسي مجمدا عند ناقص 80 درجة. في قسم النتائج، أظهرنا تعبير GFP في الخلايا التي تم نقلها مع الفيروس الغدي الحصول على.بعد 48 ساعة من التحويل ، يتم التعبير عن GFP بواسطة الخلايا المنقولة كما هو موضح في المجهر الفلوري. يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا التعبير عن GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. حوالي 50٪ من الخلايا البطانية البشرية والأبقار المنقولة مع 25 وحدة نقل لكل خلية إيجابية GFP.تم الحصول على نفس العائد من الترواية لخلايا الكبد المورين عندما تم استخدام خمس وحدات تحويل فقط لكل خلية ، ولكن هذا يرتبط بارتفاع معدل الوفيات بسبب حساسية الخلية. تم الحصول على تخفيض إلى التعبير GFP عن طريق نقل الخلايا النجمية mesenchymal بسبب التعبير المنخفض عن مستقبلات محددة. ملاحظات ختامية.نحن تحسين هذه التكنولوجيا الشاقة للحد من الوقت والتكاليف والجهد اللازم للحصول على الجسيمات أدينوفيرالية. الفيروس الغدي المعد قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا وحفز التعبير عن جين الاهتمام.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

منهج Decellularization لإنتاج وغير خلوي الطبيعية المعوية ماتريكس

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

لتحسين طرق الاختبارات الميكانيكية لتقييم العظم زرع مرسى

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

الإنتاج واستهداف الأحادي التكافؤ الكم النقاط

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

وضع بروتوكول فعال وقابل لإعادة الإنتاج لالهاء تكون العظم في نموذج الفئران مما أدى إلى عظم الفخذ المجددة الوظيفية

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

جيل نانوليبوسوميس الموجبة لتسليم كفاءة في المختبر نسخها رسول الجيش الملكي النيبالي

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...