Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et projekt, der medfinansieres af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling gennem det operationelle program for konkurrenceevne 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronym DIABETER), en bevilling fra det rumænske ministerium for forskning og innovation PCCDI- UEFISCDI, projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 inden for PNCD III og af det rumænske akademi. Forfatterne takker Kyriakos Kypreos (University of Patras, Grækenland) for hans generøse og relevante råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bukarest, Rumænien) for at filme, filmredigering og grafisk design, og Mihaela Bratu for teknisk bistand.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Rekombinant adenovirus er et alsidigt værktøj til genlevering og udtryk12,13,14. For at fremkalde stærkt proteinudtryk ved adenoviral transduktion indsættes kodningssekvensen af det pågældende gen i adenovirusgen. AdEasy adenoviral system, udviklet i laboratoriet af Bert Vogelstein, består af en rygrad plasmid (pAdEasy-1), der indeholder de fleste af de vilde-type adenovirus serotype 5 genom, og en shuttle vektor (pAdTrack), designet til gen kloning2,10. Sletningen af adenoviral gener E1 (ansvarlig for samling af infektiøse viruspartikler) og E3 (kodning af proteiner, der er involveret i at undgå værtsimmunitet) skabte et rum i det adenovirale genom, hvor et gen af interesse på 6,5-7,5 kb kan indsættes2,3. Denne størrelse er tilstrækkelig til mange gener, især for dem med kortere introner15,16,17. Der er også forskere, der rapporterer om produktion af adenovirus , der bærer cDNA af en transgene18,19,20. Vi opnåede dog et lavere udbytte af transgenekspression for cDNA-bærende adenovirus end for deres modparter, der bærer et gen eller et minigen (data vises ikke).
Forbedring og tilpasning af de tidligere metoder2,10,14,18,21, teknologien til adenoviral produktion kræver kortere tid, lavere omkostninger og mindre indsats. Den fulde længde adenoviral DNA opnås ved rekombination mellem shuttle vektor og pAdEasy-1 plasmid i homolog rekombination udsat E. coli stamme, BJ5183. Protokollen indebærer den kemiske transformation af AdEasier-1 celler (BJ5183 bakterier, der indeholder pAdEasy-1). Denne teknik kræver ikke en elektroporator, der muligvis ikke er tilgængelig i nogle laboratorier, er meget enkel, øger rekombinationsudbyttet og reducerer den tid, der er nødvendig for at opnå kompetente celler og udføre transformationen. Forvalget af rekombinante kloner udført af PCR forkorter tiden yderligere og letter hele proceduren. En lignende procedure blev brugt af Zhao og kolleger22, men i protokollen optimerede vi primernes sekvenser.
Til GFP-adenovirusemballage og forstærkning blev der anvendt en HEK293 afledt cellelinje, nemlig AD293-celler, som er mere klæbende til kulturpladen. Andre cellelinjer, der almindeligvis anvendes til adenoviral produktion, er følgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa afledte), N52. E6, og HeLa-E123,24,25,26. I vores hænder blev der ikke opnået nogen forbedring i adenoviralproduktionen, da der blev brugt 911 celler (data vises ikke). Transfekten af AD293-celler med rekombinant plasmid ved hjælp af K2-reagens øgede i høj grad effektiviteten af det virale emballagetrin. Efter adenovirus produktion, op til ~ 70% af adenovirus er stadig inde i cellerne og frigives af tre frysning og optøning cykler. At øge antallet af cyklusser er ikke egnet, fordi det ødelægger adenovirus.
Gennem hele den rutinemæssige adenoviral produktionsproces frigives mange virale partikler i cellekulturmediet. Kassering af dette cellekulturmedium under høsten af de inficerede AD293-celler ville resultere i et vigtigt viralt tab. Vi optimerede protokollen beskrevet af Schagen og kolleger for at rense adenoviralpartiklerne fra cellekulturmediet ved nedbør med ammoniumsulfat27. Denne metode har en højere effektivitet i adenovirusgenvinding fra cellekulturmediet sammenlignet med metoden ved hjælp af polyethylenglycol28. Den udfældede adenovirus skal renses straks ved ultracentrifugering eller opbevares i køleskabet i et par dage, men kun efter dialyse, for at fjerne saltoversvømmelsen. At holde bundfaldet længere end et par timer uden dialyse er skadeligt for virussen.
Rensning af adenoviral partikler ved ultracentrifugering udført i et trin reducerer manipulationen af adenoviralbestanden og letter proceduren sammenlignet med protokollerne ved hjælp af successive ultracentrifugeringstrin14,29. Dialyse af den rensede adenovirus er nødvendig for at fjerne cæsiumchlorid, der yderligere kan påvirke transduktionen. I protokollen brugte vi Tris buffer indeholdende MgCl2, men ikke saccharose til dialyse, da det kræver en enorm, uberettiget mængde saccharose, der ellers er nødvendig som konserveringsmiddel til frysning. Således tilføjede vi saccharose senere direkte i de adenovirale lagre, der var forberedt til frysning. For at undgå hyppig frysning og optøning af den rensede adenovirus anbefales det at aliquot adenoviralbestandene og opbevare dem ved -80 °C. Adenoviral titer blev evalueret af flowcytometry i betragtning af GFP reporter genet og procentdelen af transducerede celler for en bestemt viral fortynding. Denne metode er hurtigere sammenlignet med den klassiske "plaque assay" og er mere tillidsfuld sammenlignet med evalueringen af capsidproteiner (ved forskellige metoder som ELISA eller flow cytometry), som ikke afslører infektionskapaciteten hos adenoviralpartiklerne. Elisa-baseret kvantificering, Q-PCR eller plakanalyse ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits er imidlertid alternative metoder, især nyttige til titrering af adenovirus, som ikke indeholder et fluorescerende sporstof.
I betragtning af at pAdTrack adenovirus er afledt af humane adenoviruses serotype 5, som er anerkendt af Coxsackievirus og Adenovirus Receptors (CAR), demonstrerede vi GFP-adenovirussens evne til at transduce celler af menneskelig oprindelse (endothelialceller), men også celler af anden oprindelse: kvæg (endothelialceller) og murin (mesenchymale stromale celler og heocpatytter). Dataene viste, at GFP-adenovirus kan fremkalde et højt udtryk for en transgene.
Afslutningsvis optimerede vi denne besværlige teknologi for at reducere tiden, omkostningerne og den indsats, der er nødvendig for at opnå de adenovirale partikler. Den forberedte adenovirus er i stand til at inficere forskellige celletyper og fremkalde ekspressionen af det af interessegenet. Denne protokol kan anvendes i en række forsøg, da den adenoviral-medierede genoverførsel udgør et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.
FORKORTELSER: AdV-GFP, adenoviral partikler; BAEC, akreortatiske endotelceller; CsCl, cæsiumchlorid; GFP, grønt fluorescerende protein; MSC, mesenchymale stromale celler; TU, transducerende enheder.

Adenovirus er ikke-vidtrækkende vira, der indeholder en nucleocapsid og et dobbeltstrenget lineært DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan inficere en bred vifte af celletyper, og infektion er ikke afhængig af aktiv værtscelledeling. Efter infektion introducerer adenovirus sit genomiske DNA i værtscellens kerne, hvor det forbliver epikromosomalt og transskriberes sammen med værtens gener. Således opnås en minimal potentiel risiko for insertional mutagenesis eller oncogenes regulering4,5,6. Det adenovirale genom replikeres ikke sammen med værtsgenomet, og dermed fortyndes adenovirale gener i en dividere cellepopulation. Blandt fordelene ved adenoviral transduktion er der: (i) høje niveauer af transgene udtryk; ii) reducerede risici i forbindelse med integreringen af det virale DNA i værtsgenomet på grund af episomalt udtryk — transduktion af en lang række celletyper, der deler sig og ikke deler sig. De fleste adenovirus , der anvendes i biomedicinsk forskning , er ikke-repliktive og mangler E1-region7,8,9. Til deres produktion kræves en cellelinje, der leverer E1-sekvensen (f.eks. Desuden blev en ikke-væsentlig region for den virale livscyklus (E3) slettet for at tillade indsættelse af en transgen i det virale genom; andre regioner (E2 og E4) blev yderligere slettet i nogle adenovirus, men i disse tilfælde blev der rapporteret om et nedsat udbytte af adenoviralproduktionen og et lavt udtryk for transgenet7.
Her præsenterer vi en forbedret protokol til konstruktion, emballering og rensning af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet. Disse forbedringer gjorde det muligt at pakke adenovirus på en hurtigere og mere økonomisk måde sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein2,10, på grund af følgende fordele: (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk transformation af bakterier; ii) pcr's valg af rekombinantklon — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning af adenovirale partikler fra dyrkningsmediet efter viral emballage og forstærkning — adenoviralrensning ved hjælp af et trins cæsiumchlorid (CSCl) gradient ultracentrifugering.
Protokollen for produktion af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet (figur 1) omfatter følgende trin:
(1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier 2) Emballering af adenoviralpartiklerne 3) Forstærkning af adenovirus (4) Rensning af adenovirale partikler fra celle lysat og dyrkning medium (5) Adenovirus titrering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> Figur 1: Adenovirusproduktionsteknologien. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier. De udvalgte rekombinerede plasmider forstærkes i DH5α bakterier og renses derefter; (2) Emballering af adenovirale partikler i AD293-celler, der producerer adeno-E1-proteiner; (3) Forstærkning af adenovirus i AD293-celler; (4) Rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysatet og dyrkningsmediet ved ultracentrifugering på en CSCl-tæthedsgradient; (5) Titreringen af adenovirus og den funktionelle test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
I denne protokol eksemplificerede vi teknologien til produktion af adenovirus, som kan fremkalde udtrykket af GFP i værtscellerne. GFP er allerede indsat i rygraden i pAdTrack-CMV shuttle vektor (Addgene #16405), under en anden CMV promotor og bruges som en reporter gen (Figur 1). Derfor udpegede vi her pAdTrack-CMV-vektoren som pAdTrack-GFP, og vi vurderede GFP's udtryk til demonstrative formål. Udover GFP-udtryk kan systemet bruges til at overekspressere et gen af interesse, som kan klones på pAdTrack-CMV's mange kloningssteder. Et gen eller en minigen klonet i pAdTrack-CMV er normalt mere effektiv til ekspressionsinduktion sammenlignet med cDNA11. Dataene viste et stærkt GFP-udtryk i transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

Adenoviral transduktion har den fordel, at en stærk og forbigående induktion af ekspressionen af interessegenet i en bred vifte af celletyper og organer. Men rekombinant adenoviral teknologi er besværlig, tidskrævende og dyrt. Her præsenterer vi en forbedret protokol ved hjælp af pAdEasy-systemet til at opnå rensede adenovirale partikler, der kan fremkalde et stærkt grønt fluorescerende protein (GFP) udtryk i transducerede celler. Fordelene ved denne forbedrede metode er hurtigere forberedelse og lavere produktionsomkostninger sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier; 2) emballering af adenoviralpartiklerne 3) forstærkning af adenovirus i AD293-celler 4) rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og dyrkningsmedium og 5) virustitrering og funktionel testning af adenovirus. Forbedringerne af den oprindelige metode består af (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk omdannelse af bakterier; ii) udvælgelse af rekombinante kloner ved hjælp af "negative" og "positive" PCR — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning med ammoniumsulfat af de viruspartikler, der frigives af AD293-celler i cellekulturmedium og v) rensning af virusset ved hjælp af et trins cæsiumchlorid diskontinuerlig gradient ultracentrifugering. Et stærkt udtryk for interessegenet (i dette tilfælde GFP) blev opnået i forskellige typer transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.

Vi ændrede og forbedrede den oprindelige Vogelsteins protokol for at opnå hurtigere og mere effektiv adenovirusproduktion. For det første reviderede vi metoden for at opnå en lettere udvælgelse af rekombinanter. Efter rekombination blev BJ5183 bakterieklonerne testet af "negativ PCR" for at vurdere integriteten af pAdTrack-GFP som en indikator for manglen på rekombination (Figur 3A) eller ved "positiv PCR" for at identificere det gen af interesse, der i vores tilfælde er ligestillet med GFP (Figur 3B). I både "negative" og "positive" PCR'er brugte vi pAdTrack-GFP som en kontrolskabelon, som gav et bånd på 986 bp for pAdTrack-integritet(Figur 3A, bane 1) og et bånd på 264 bp for GFP (Figur 3B, bane 3). De primere, der anvendes til den "negative PCR" var designet til at forstærke et fragment af 986 bp indeholder PmeI site i pAdTrack-GFP. Dette DNA-fragment forstørres drastisk efter rekombination og forstærkes ikke i de positive rekombinante kloner. Negative kloner til rekombination, hvor pAdTrack-GFP forblev intakt, er repræsenteret i figur 3A, bane 3, 4 og 6. Primerne anneal på DNA-sekvenserne støder op til rekombination site. Potentielle positive rekombinante kloner (Figur 3A, bane 2 og 5) udtrykte GFP som vist i figur 3B,bane 1 og 2. Plasmid DNA fra disse kloner blev isoleret og brugt til DH5α transformation for at opnå en højere mængde DNA. Disse forudvalgte rekombinante plasmider forstærket i DH5α blev derefter testet ved enzymatisk fordøjelse. I figur 3erC-E illustreret resultaterne af den enzymatiske fordøjelse af en rekombinant-positiv klon fordøjet med Hind III, PstI, BamHI restriktion enzymer(Figur 3C, D, E lane 2). HindIII- og PstI-fordøjelsesmønstrene for rekombinantklonen svarede til dem, der blev opnået for pAdEasy-1, da hindIII og pstI skar henholdsvis pAdEasy-1 plasmid 24 og 25 gange(figur 3C og D, bane 3); HindIII skære én gang og PstI skære fire gange pAdTrack-GFP vektor(Figur 3C og D,lane 1). BamHI skæres to gange pAdEasy-1 vektor(Figur 3C,vognbane 3), og en gang pAdTrack-GFP(Figur 3C, vognbane 1).
PacI skåret ud et fragment på 4,5 kb fra rekombinant plasmid (Figur 3F, lane 2), et fragment af 2863 bp fra pAdTrack-GFP(Figur 3F, lane 1), og linearized den pAdEasy-1 vektor (Figur 3F, lane 3). DNA-stigen er repræsenteret i figur 3C-Fi vognbane 4. Den rekombinant plasmid blev fordøjet med Pac I til videre brug for AD293 transfekt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> Figur 3: Rekombinationen af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid. Plasmiderne opnået efter rekombinationen af pAdTrack-GFP og pAdEasy-1 blev testet af "negativ" PCR for pAdTrack-GFP integritet (A). De ikke-rekombinante kloner blev tydeligt ved tilstedeværelsen af et 986 bp-bånd svarende til sekvensen forstærket fra pAdTrack-GFP plasmid (A, bane 3, 4 og 6). Klonerne, der potentielt var positive for rekombination (A, bane 2 og 5), blev også opnået. Da pAdTrack-GFP-vektoren blev brugt som skabelon, blev der opnået et bånd på 986 bp for pAdTrack-GFP (A, vognbane 1). De potentielt positive rekombinante kloner blev testet for GFP-udtryk af "positiv" PCR (B); et bånd på 264 bp vises for både potentielt rekombinerede kloner (B, bane 1 og 2), samt for pAdTrack-GFP plasmid. DNA'et fra en potentiel rekombinant klon blev testet med HindIII, PstI, BamHI og PacI restriktionsenzym (C-F, bane 2). I kontrollerne blev pAdEasy-1-vektoren (C-F, bane 3) og pAdTrack-GFP plasmid (C-F, bane 1) fordøjet med de samme enzymer. DNA-stigen er repræsenteret i C-F bane 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Adenoviralemballagen og forstærkningen blev udført i AD293-celler. Adenoviralpartiklerne (AdV-GFP) blev renset fra AD293 celle lysate såvel som fra cellekulturmediet, hvor de var blevet frigivet af de inficerede celler. For at koncentrere adenovirus fundet i cellekulturmediet blev partiklerne udfældet med ammoniumsulfat og derefter genopfrisket i 10 mM Tris HCl pH 8 med 2 mM MgCl2, den samme buffer som den, der bruges til celle lysis. Efterfølgende blev adenoviralpartiklerne fra cellelysatet og fra kulturmediet renset af CsCl diskontinuerlig gradient ultracentrifugering. Efter ultracentrifugering blev der opnået et stærkt bånd af renset AdV-GFP, som vist i figur 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> Figur 4: Adenoviral rensning ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig CSCl-gradient. Cellen homogeniseres, og den adenovirus, der blev udfældet fra mediet, blev udsat for ultracentrifugering på en diskontinuerlig gradient dannet af CsCl-opløsninger med lav og høj densitet. Stærke bånd af GFP-adenovirus blev dokumenteret i begge tilfælde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at bestemme virustitæren udtrykt i transducerende enheder pr. mL (TU/mL) blev AD293-cellerne inficeret med serielle fortyndinger af AdV-GFP. Efter 48 timer udtrykte de inficerede celler GFP i en omvendt korrelation med fortyndingsfaktoren for virussuspensionen. Dette blev observeret ved fluorescensmikroskopi, og procentdelen af GFP-positive celler blev bestemt af flowcytometry (figur 5). For at beregne titeren blev den virale fortynding, der inducerede 5 - 20% af GFP-positive celler, overvejet (Figur 5C). Normalt får vi en viral titer på ~ 1010 (TU / mL) for GFP-adenovirus.
Nedenfor giver vi et eksempel på en adenoviral titer beregning for et bestemt adenoviralt parti, hvor 300000 celler (C) blev transduceret med 1 ml adenoviral opløsning (V), ved en fortyndingsfaktor på 106 (D), for hvilken 6% GFP-positive celler (F) blev opnået:
Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> Figur 5: Vurderingen af adenoviral titer. AD293 celler blev inficeret med forskellige adenoviral fortyndinger. 48 timer senere blev cellerne observeret ved fluorescensmikroskopi og analyseret ved flowcytometry for at bestemme procentdelen af GFP-positive celler induceret af forskellige adenoviral fortyndinger (A-D). For at etablere porten til flowcytometry blev ikke-transducerede celler også analyseret (E). Titeren beregnet for fortyndingsfaktoren 106, når 6% af cellerne var GFP positive, var 1,8 x10 10 TU /mL. For paneler A-E, barer: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at teste transduktionspotentialet for den forberedte adenovirus blev der anvendt fire cellelinjer: humane endotelceller (EA.hy926), kvægaortateldotelceller (BAEC), murine hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC). Endotelceller (EA.hy926 og BAEC) blev transduceret med 25 TU/celle, hepatocytterne blev transduceret med 5 TU/celle, og MSC blev transduceret med 250 TU/celle.
Her er et eksempel på, hvordan mængden af adenoviral suspension er nødvendig for at inficere 3 x 106 celler med 25 TU / celle, ved hjælp af adenoviral suspension med 1,8 x 1010 TU / mL, blev beregnet.
For 1 celle .............. 25 TU 3 x 106 celler .............. x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x=75 x 106 TU Hvis viruslageret indeholder 1,8 x 1010 TU .............. 1 mL 75 x 106 TU .............. y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y= 4,2 x 10-3 mL = 4,2μL viral bestand
48 timer efter transduktion blev cellerne analyseret ved fluorescensmikroskopi. Som det fremgår af figur 6, blev humane eller kvæg endotelceller transduceret med god effektivitet (~50%) for 25 TU/celle(figur 6 EA.hy926 og BAEC). Murine hepatocytter (Hepa 1-6) blev effektivt transduceret af adenovirus ved en lav mængde adenoviruspartikler (5 TU / celle), men de er også følsomme over for adenovirus, da en højere procentdel af døde celler (PI-positive celler) blev registreret (~ 16%) sammenlignet med de andre celletyper. Mesenchymale stromale celler var de sværeste at transduce (Figur 6), på grund af manglen på specifikke adenoviral receptorer (ikke-offentliggjorte data).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> Figur 6: Adenovirussens infektivitet og induktion af GFP-ekspression i transducerede celler. Humane endotelceller (EA.hy926), kvægaortateldikale celler (BAEC), murin hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC) blev transduceret med den angivne mængde adenovirus. GFP blev opdaget ved fluorescensmikroskopi, og procentdelen af GFP-positive celler blev analyseret af flowcytometry. PI-positive celler bestemt af flowcytometry viser celledødeligheden bestemt ved viral transduktion. EA.hy926 celler, kvæg aorta endotelceller, og Hepa 1-6 celler var stærkt transduceret af adenovirus, udbyttet af transduktion spænder fra 41 - 52%. For MSC fremkaldte en større mængde virus (250 TU/celler) kun 27% GFP-positiv af de transducerede celler. Søjler: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

Her præsenterer vi en protokol for adenovirusproduktion ved hjælp af pAdEasy-systemet. Teknologien omfatter rekombination af pAdTrack og pAdEasy-1 plasmider, adenovirusemballage og forstærkning, rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og kulturmedie, virustitrering og funktionel test af adenovirus.

En effektiv metode til produktion af Adenovirus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Velkommen til Institut for Cellulær Biologi og Patologi, Nicolae Simionescu fra Bukarest, Rumænien. Her i Viral Transduktion Laboratory, Vi viser en del af adenoviral partikelproduktion ved hjælp af en optimeret metode baseret på AdEasy system udviklet af professor Vogelstein. De vigtigste trin i teknologien til fremstilling af denne adenovirus er, en, en rekombination af pAdTrack indeholder GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier.To, emballere adenoviral partikler. Tre, forstærkning af adenovirus i AD293 celler. Fire, rensning af adenoviral partikler fra celle lysat og kultur medium.Fem, viral titrering og funktionel test af adenovirus. Her vil vi præsentere et vigtigt skridt i metoden. Rensning af adenoviral partikler fra celle lysat og kultur medium.Rensningen af adenovirus starter med at høste de virusproducerende celler og mediet. AD293 celler blev transfected med rekombinant plasmid og som adenovirus blev pakket. Derefter blev adenovirus forstærket af successive større kulturer.Her fik vi 25 T175 plader, og vi startede rensningen af adenovirus fra celle lysatet og kulturmediet. Først kontrollerede vi GFP's grønne fluorescens udtrykt af de transducerede celler. Hvis cellerne stadig er fastgjort, løsner vi dem ved at trykke på kulturretten eller ved at bruge en lang skraber.Cellerne og mediet indsamles. Kolberne vaskes med PBS, som også opsamles i Falcon-rør. Cellerne er pelleted af centrifugering.Hold cellepille samt medium for yderligere rensning af adenovirus. På dette trin er hjælpen fra en kollega godt værdsat for at fremskynde høstprocessen. Cellepillen er grøn på grund af GFP-udtrykket.Pellet er resuspended i hypertoniske Tris buffer, hvilket ville lette afbrydelsen af cellerne. Til celle lysis bruger vi flydende nitrogen og tørgassen opvarmet op til 37 grader. Udfør ikke mere end tre cyklusser, da virussen ville blive beskadiget.For at øge effektiviteten af celleforstyrrelser forsigtigt passere cellen homogenisere gennem en 23 gauge sprøjte nål. Centrifuge cellen lysat på 9, 600 x g i 12 minutter. Pass supernatanten i nye rør og kassér pellets.Hold supernatanten på is til videre behandling med ultracentrifuge. Nu behandler vi kulturmediet for at isolere den adenovirus, der frigives fra cellerne. Til dette vægter vi for det første den nødvendige mængde ammoniumsulfat og tilføjer det til flasken, hvor kulturmediet blev indsamlet.Flasken rystes kraftigt, indtil krystallerne er helt opløst. Blandingen inkuberes ved stuetemperatur i to timer og halvdelen. Derefter opdeles suspensionen af bundfaldet i Falcon-rør.Centrifuge i 15 minutter ved 1.600 x g. Efter centrifugeringen kasseres supernatanten, og pelleten genbruges i 10 millimolar Tris buffer. Hvis man ikke kan fortsætte rensningen af adenovirus med ultracentrifugationstrinnet, kan bundfaldet opbevares i et par dage ved fire grader, men først efter dialyse for at fjerne ammoniumsulfat.Her præsenterede vi dialysetrinnet. Vi bruger en sprøjte til at introducere suspensionen i en tidligere våd kassette. Prøverne er dialyzed mod 10 millimolar Tris buffer natten over ved fire grader.Det sidste trin i rensningen repræsenteres af ultracentrifugationstrinnet på en cæsiumchlorid diskontinuerlig gradient. For at danne gradienten pipetter vi for det første tre milliliter af høj densitetsopløsningen af cæsiumchlorid. Oven på dette lag hældes forsigtigt tre milliliter cæsiumchlorid med lav densitet.Den adenoviral partikel suspension fra cellen lysat eller kulturmediet er derefter overlejret på toppen af gradienten. Rørene er fyldt med mineralsk olie og introduceret i SW41 spande. Efter ækvilibrering indlæses rørene symmetrisk i rotoren, som introduceres i ultracentrifuge.Centrifuge kører en 35.000 RPM og fire grader i 18 timer uden pause. Efter ultracentrifugering placeres rørene på et stativ med et sort papir bag for at høste båndene. Den klare øverste fase og celleaffaldet kasseres i en affaldsbeholder med en blegeopløsning.Det laveste bånd, der indeholder den komplette adenovirus, høstes med en pipettespids og opsamles i et sterilt Eppendorf-rør. Efter dialyse tilsættes saccharose til virussuspensionen til en 4%-endelig koncentration, og viral aliquot holdes frosset ved minus 80 grader. I resultatafsnittet viste vi GFP-udtrykket i celler transduceret med opnå adenovirus.48 timer efter transduktion udtrykkes GFP af de transducerede celler som vist ved fluorescensmikroskopi. Procentdelen af GFP- udtrykscellerne bestemmes af flowcytometry. Omkring 50% af de humane og kvæg endotelceller transduceret med 25 transduktion enheder per celle er GFP positive.Det samme transduktionsudbytte blev opnået for murin-hepatocytter, når der kun blev anvendt fem transduktionsenheder pr. celle, men dette er forbundet med højere dødelighed på grund af cellefølsomheden. Reduceret til GFP-udtryk blev opnået ved transduktion af mesenchymale stromale celler på grund af det lave udtryk for de specifikke receptorer. Afsluttende bemærkninger.Vi optimerer disse besværlige teknologi til at reducere den tid, de omkostninger, og den indsats, der er nødvendig for at opnå adenoviral partikler. Den forberedte adenovirus er i stand til at inficere forskellige celletyper og fremkalde ekspressionen af det af interessegen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

En Decellularization metoden til udarbejdelse af en naturlig Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

En forbedret Mekanisk testning metode til at vurdere Bone-implantat Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion og Målretning af Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produktion af Cancer Cell Sfæroider med en vandig tofasesystem for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

En effektiv og reproducerbare protokol for distraktion Osteogenesis i en rotte Model fører til en funktionel folier lårben

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation af kationiske Nanoliposomes til effektiv levering af In Vitro transskriberet Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...