Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט במימון משותף של הקרן האירופית לפיתוח אזורי באמצעות התוכנית התפעולית התחרותית 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, מזהה: P_37_668; ראשי תיבות DIABETER), מענק של משרד המחקר והחדשנות הרומני PCCDI- UEFISCDI, פרויקט מספר PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 בתוך PNCD III ועל ידי האקדמיה הרומנית. המחברים מודים לקיריאקוס קיפריוס (אוניברסיטת פטרס, יוון) על עצתו הנדיבה וה הרלוונטית, אובידיו קרויטורו (האוניברסיטה לאמנויות יפות, בוקרשט, רומניה) על הצילומים, עריכת הסרטים והעיצוב הגרפי, ומיכאלה ברטו על סיוע טכני.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אדנווירוסים רקומביננטיים הם כלי רב-תכליתי להעברת גנים וביטוי12,13,14. כדי לגרום לביטוי חלבון חזק על ידי התמרה אדנו-ויראלית, רצף הקידוד של גן העניין מוכנס לגנום של אדנווירוס. המערכת האדנו-ויראלית AdEasy, שפותחה במעבדתו של ברט פוגלשטיין, כוללת פלסמיד עמוד שדרה (pAdEasy-1) המכיל את רוב הגנום אדנווירוס מסוג פראי 5, וקטור מעבורת (pAdTrack), המיועד לשיבוטגנים 2,10. מחיקת הגנים האדנו-ויראליים E1 (האחראים להרכבת חלקיקי וירוסים זיהומיים) ו- E3 (קידוד חלבונים המעורבים בהתחמקות מחסינות מארח) יצרו מרחב בגנום האדנו-ויראלי, שבו ניתן להכניס גן מעניין של 6.5-7.5 ק"ג2,3. גודל זה מספיק עבור גנים רבים, במיוחד עבור אלה עם מבוא קצר יותר15,16,17. ישנם גם חוקרים המדווחים על ייצור אדנווירוסים הנושאים את ה- cDNA של טרנסג'ין18,19,20. עם זאת, השגנו תשואה נמוכה יותר של ביטוי transgene עבור אדנווירוסים נושאי cDNA מאשר עבור עמיתיהם הנושאים גן או מיני גן (נתונים לא מוצגים).
שיפור והתאמת השיטות הקודמות2,10,14,18,21, הטכנולוגיה לייצור אדנו-ויראלי דורשת זמן קצר יותר, עלות נמוכה יותר ופחות מאמץ. ה- DNA אדנו-ויראלי באורך מלא מתקבל על ידי שילוב מחדש בין וקטור המעבורת לבין pAdEasy-1 plasmid ב זן recombination הומולוגי נוטה E. coli, BJ5183. הפרוטוקול מרמז על הטרנספורמציה הכימית של תאי AdEasier-1 (חיידקי BJ5183 המכילים pAdEasy-1). טכניקה זו אינה דורשת electroporator כי לא יכול להיות זמין במעבדות מסוימות, הוא פשוט מאוד, מגביר את התשואה רקומביניזציה, ומפחית את הזמן הדרוש כדי להשיג תאים מוסמכים ולבצע את השינוי. בחירתם המוקדמת של שיבוטים רקומביננטיים המבוצעים על ידי PCR מקצרת עוד יותר את הזמן ומקלה על ההליך כולו. הליך דומה שימש את זאו ועמיתים לעבודה22, עם זאת, בפרוטוקול, אנחנו אופטימיזציה הרצפים של פרייומרים.
עבור האריזה וההגברה של GFP-adenovirus, נעשה שימוש בקו תאים נגזר HEK293, כלומר תאי AD293, אשר חסידים יותר לצלחת התרבות. קווי תאים אחרים המשמשים בדרך כלל לייצור אדנו-ויראלי הם כדלקמן: 911, 293FT, pTG6559 (נגזרת A549), PER. C6 (נגזרת שלה), GH329 (נגזרת HeLa), N52. ה6, והלה-E123,24,25,26. בידינו, לא הושג שיפור בייצור אדנו-ויראלי כאשר נעשה שימוש בתאי 911 (נתונים שלא הוצגו). transfection של תאי AD293 עם פלסמיד רקומביננטי באמצעות מגיב K2 מאוד הגדיל את היעילות של שלב האריזה ויראלי. לאחר ייצור אדנווירוס, עד ~ 70% של אדנווירוס הוא עדיין בתוך התאים והוא שוחרר על ידי שלושה מחזורי הקפאה והפשרה. הגדלת מספר המחזורים אינה מתאימה כי זה הורס את אדנווירוס.
לאורך כל תהליך הייצור השגרתי אדנו-ויראלי, חלקיקים נגיפיים רבים משתחררים במדיום תרבות התא. השלכת מדיום תרבות התא הזה במהלך הקציר של התאים הנגועים AD293 יגרום לאובדן ויראלי חשוב. אופטימיזציה הפרוטוקול המתואר על ידי שיגן ועמיתים לעבודה כדי לטהר את החלקיקים אדנו-ויראלי מן המדיום תרבות התא על ידי משקעים עם אמוניום גופרתי27. שיטה זו יש יעילות גבוהה יותר התאוששות אדנווירוס מן המדיום תרבות התא לעומת השיטה באמצעות פוליאתילן גליקול28. אדנווירוס מזרז צריך להיות מטוהר מיד על ידי ultracentrifugation או לשמור במקרר במשך כמה ימים, אבל רק לאחר דיאליזה, כדי להסיר את עודף מלח. שמירה על משקעים יותר מכמה שעות ללא דיאליזה מזיקה לנגיף.
טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים על ידי אולטרה-צנטריפוגציה המבוצעת בצעד אחד מפחית את המניפולציה של המלאי האדנו-ויראלי ומקל על ההליך בהשוואה לפרוטוקולים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה רצופים שלבים14,29. דיאליזה של אדנווירוס מטוהר יש צורך להסיר צסיום כלורי שעלול להשפיע עוד יותר על התמרה. בפרוטוקול, השתמשנו במאגר Tris המכיל MgCl2 אך לא סוכרוז לדיאליזה, שכן הוא דורש כמות עצומה ולא מוצדקת של סוכרוז הדרושה אחרת כחומר משמר להקפאה. לכן, הוספנו סוכרוז מאוחר יותר, ישירות לתוך המניות אדנווירי מוכן להקפאה. כדי למנוע הקפאה תכופה והפשרה של אדנווירוס מטוהרים, מומלץ aliquot את המניות adenoviral ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס. טיטר אדנו-ויראלי הוערך על ידי cytometry זרימה בהתחשב בגן כתב GFP ואת אחוז התאים transduced עבור דילול ויראלי ספציפי. שיטה זו מהירה יותר בהשוואה ל"פלאק אסאי" הקלאסי והיא אמינה יותר בהשוואה להערכת החלבונים הקפסידים (בשיטות שונות כגון ELISA או cytometry זרימה) שאינה חושפת את יכולת ההדבקה של החלקיקים האדנו-ויראליים. עם זאת, כימות מבוסס ELISA, Q-PCR, או פלאק assay באמצעות ערכות זמינות מסחרית הן שיטות חלופיות, שימושי במיוחד עבור titration של אדנווירוסים אשר אינם מכילים מעקב פלואורסצנטי.
בהתחשב בכך אדנווירוסים pAdTrack נגזרים adenoviruses אנושי serotype 5 אשר מוכר על ידי קולטני Coxsackievirus ו אדנווירוס (CAR), הדגמנו את היכולת של GFP-עדן וירוס כדי לתמר תאים ממוצא אנושי (תאי אנדותל), אלא גם תאים ממוצאים אחרים: שור (תאי אנדותל) ו murine (תאים סטרומה mesenchymal ו hepatocytes). הנתונים הראו כי GFP-אדנווירוס יכול לגרום לרמה גבוהה של ביטוי של טרנסג'ין.
לסיכום, אופטימיזציה זו טכנולוגיה מייגעת כדי להפחית את הזמן, את העלויות, ואת המאמץ הדרוש כדי להשיג את החלקיקים adenoviral. אדנווירוס מוכן הוא מסוגל להדביק סוגי תאים שונים כדי לגרום לביטוי של הגן של עניין. פרוטוקול זה עשוי לשמש במגוון ניסויים מאז העברת גנים בתיווך אדנו-ויראלי מייצג את אחד הכלים העיקריים לפיתוח טיפולים גנטיים מודרניים.
קיצורים: AdV-GFP, חלקיקים אדנו-ויראליים; BAEC, תאי אנדותל שלאבי העורקים; CsCl, צסיום כלוריד; GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSC, תאים סטרומה mesenchymal; TU, יחידות מתמרות.

אדנווירוסים הם וירוסים שאינם מופצים המכילים נוקלאוקפסיד וגנום DNA ליניארי דו-גדילי1,2,3. אדנווירוסים יכולים להדביק מגוון רחב של סוגי תאים וזיהום אינו תלוי בחטיבת תאים מארחים פעילים. לאחר ההדבקה, אדנווירוס מציג את הדנ"א הגנומי שלו לגרעין התא המארח, שם הוא נשאר אפיפרומוסומלי ומתמלל יחד עם הגנים של המארח. לכן, סיכון פוטנציאלי מינימלי עבור רגולציה mutagenesis הכנסה או oncogenes מושגת4,5,6. הגנום האדנו-ויראלי אינו משוכפל יחד עם הגנום המארח ולכן הגנים האדנו-ויראליים מדוללים באוכלוסיית תאים מפרידה. בין היתרונות של התמרה אדנו-ויראלית, יש: (i) רמות גבוהות של ביטוי transgene; (ii) סיכונים מופחתים הקשורים לשילוב הדנ"א הנגיפי בגנום המארח, עקב ביטוי אפיזומלי; (iii) התמרת מגוון רחב של סוגי תאים מתחלקים ולא מפרידים. רוב האדנווירוסים המשמשים במחקר ביו-רפואי אינם משכפלים, ללא אזור E17,8,9. עבור הייצור שלהם, קו תא המספק את רצף E1 (כגון HEK293) נדרש. חוץ מזה, אזור לא חיוני למחזור החיים הנגיפי (E3) נמחק כדי לאפשר החדרה של טרנסג'ין בגנום הנגיפי; אזורים אחרים (E2 ו- E4) נמחקו עוד יותר בכמה אדנווירוסים, אך במקרים אלה, ירידה בתפוקה של ייצור אדנו-ויראלי וביטוי נמוך של הטרנסג'ין דווחו7.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול משופר לבנייה, אריזה וטיהור אדנווירוסים באמצעות מערכת AdEasy. שיפורים אלה אפשרו את האריזה של אדנווירוס בצורה מהירה וחסכונית יותר בהשוואה לשיטה המקורית שפותחה על ידי ברט פוגלשטיין2,10, בשל היתרונות הבאים: (i) שילוב מחדש ב pAdEasy-1 המכיל BJ5183 על ידי טרנספורמציה כימית של חיידקים; (ii) הבחירה של שיבוטים רקומביננטי על ידי PCR; (iii) ההעתקה של תאי AD293 באמצעות מערכת transfection K2 לאריזה אדנו-ויראלית; (iv) משקעים של חלקיקים אדנו-ויראליים מדיום תרבות לאחר אריזה והגברה ויראליות; (v) הטיהור האדנו-ויראלי באמצעות שיפוע צסיום כלוריד (CsCl) חד-שלבי.
הפרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת AdEasy (איור 1) כולל את השלבים הבאים:
(1) שילוב מחדש של pAdTrack-GFP עם pAdEasy-1 בחיידק BJ5183 (2) אריזת החלקיקים האדנו-ויראליים (3) הגברה של אדנווירוס (4) טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות (5) טיטרציה אדנווירוס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> איור 1: טכנולוגיית הייצור של אדנווירוס. השלבים העיקריים של הטכנולוגיה adenoviral הם: (1) שילוב מחדש של pAdTrack-GFP עם pAdEasy-1 פלסמיד בחיידקים BJ5183. הפלסמידים המקומבינים שנבחרו מוגברים בחיידקי DH5α ולאחר מכן מטוהרים; (2) האריזה של החלקיקים אדנו-ויראלי בתאי AD293, המייצרים חלבוני אדנו-E1; (3) הגברה של אדנווירוס בתאי AD293; (4) טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות על ידי אולטרה-צנטריפוגציה במעבר צבע של צפיפות CsCl; (5) הטיטרציה של אדנווירוס והבדיקות הפונקציונליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בפרוטוקול זה, אנו מדגים את הטכנולוגיה לייצור אדנווירוס, אשר יכול לגרום לביטוי של GFP בתאים המארחים. GFP כבר מוכנס לעמוד השדרה של וקטור המעבורת pAdTrack-CMV (Addgene #16405), תחת מקדם CMV שני ומשמש כגן כתב(איור 1). מסיבה זו, כאן ייעדנו את וקטור pAdTrack-CMV כ- pAdTrack-GFP והערכנו את הביטוי של GFP למטרות הפגנה. מלבד ביטוי GFP, המערכת יכולה לשמש כדי להגזים בגן מעניין, אשר עשוי להיות משובט באתרי שיבוט מרובים של pAdTrack-CMV. גן או מיניגן משובטים pAdTrack-CMV הוא בדרך כלל יעיל יותר עבור אינדוקציה ביטוי לעומת cDNA11. הנתונים הראו ביטוי GFP חזק בתאים transduced (כגון hepatocytes, תאי אנדותל) ממקורות שונים (אנושי, שור, מורין). העברת גנים בתיווך אדנו-ויראלי מייצגת את אחד הכלים העיקריים לפיתוח טיפולים גנטיים מודרניים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

טרנסדוקציה אדנו-ויראלית יש את היתרון של אינדוקציה חזקה וחולפת של הביטוי של הגן של עניין לתוך מגוון רחב של סוגי תאים ואיברים. עם זאת, טכנולוגיה אדנו-ויראלית רקומביננטית היא מייגעת, גוזלת זמן ויקרה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול משופר באמצעות מערכת pAdEasy כדי להשיג חלקיקים אדנו-ויראליים מטוהרים שיכולים לגרום לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק חזק (GFP) בתאים שעברו חילוף. היתרונות של שיטה משופרת זו הם הכנה מהירה יותר וירידה בעלות הייצור בהשוואה לשיטה המקורית שפותחה על ידי ברט פוגלשטיין. השלבים העיקריים של הטכנולוגיה adenoviral הם: (1) שילוב מחדש של pAdTrack-GFP עם pAdEasy-1 פלסמיד בחיידקים BJ5183; (2) האריזה של חלקיקי אדנו-ויראלי; (3) הגברה של אדנווירוס בתאי AD293; (4) טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות; ו-(5) הטיטרציה הנגיפית והבדיקות הפונקציונליות של אדנווירוס. השיפורים בשיטה המקורית מורכבים (i) מהשילוב מחדש ב- pAdEasy-1 המכיל BJ5183 על ידי טרנספורמציה כימית של חיידקים; (ii) הבחירה של שיבוטים רקומביננטיים על ידי PCR "שלילי" ו "חיובי"; (iii) ההעתקה של תאי AD293 באמצעות מערכת transfection K2 לאריזה אדנו-ויראלית; (iv) המשקעים עם אמוניום גופרתי של החלקיקים הנגיפיים שפורסמו על ידי תאי AD293 במדיום תרבות התא; ו-(v) טיהור הנגיף על ידי צסיום כלוריד חד-שלבי לא רציף אולטרה-צנטריפוגציה. ביטוי חזק של הגן של עניין (במקרה זה, GFP) הושג בסוגים שונים של תאים transduced (כגון hepatocytes, תאי אנדותל) ממקורות שונים (אדם, שור, מורין). העברת גנים בתיווך אדנו-ויראלי מייצגת את אחד הכלים העיקריים לפיתוח טיפולים גנטיים מודרניים.

שינינו ושיפרנו את הפרוטוקול המקורי של פוגלשטיין על מנת להשיג ייצור אדנווירוס מהיר ויעיל יותר. ראשית, שינינו את המתודולוגיה כדי להשיג מבחר קל יותר של רקומביננטים. לאחר שילוב מחדש, שיבוטי החיידקים BJ5183 נבדקו על ידי "PCR שלילי" כדי להעריך את שלמות pAdTrack-GFP כאינדיקטור לחוסר שילוב מחדש (איור 3A), או על ידי "PCR חיובי" כדי לזהות את גן העניין, מוטמע במקרה שלנו ל- GFP (איור 3B). הן ב- PCRs "שליליים" והן ב- PCRs "חיוביים", השתמשנו ב- pAdTrack-GFP כתבנית בקרה, שנתנה רצועה של 986 bp עבור שלמות pAdTrack (איור 3A, נתיב 1), ולהקה של 264 bp עבור GFP (איור 3B, נתיב 3). פריימרים המשמשים "PCR שלילי" נועדו להגביר קטע של 986 bp המכיל את אתר PmeI ב pAdTrack-GFP. שבר DNA זה מוגדל באופן דרסטי לאחר רקומבינציה ואינו מוגבר בשיבוטים רקומביננטיים חיוביים. שיבוטים שליליים לשילוב מחדש, שבהם pAdTrack-GFP נשאר שלם, מיוצגים באיור 3A, נתיבים 3, 4 ו-6. פריימרי anneal על רצפי ה-DNA הסמוכים לאתר רקומביניזציה. שיבוטים רקומביננטיים חיוביים פוטנציאליים(איור 3A, נתיבים 2 ו-5) הביעו GFP כפי שמוצג באיור 3B, נתיב 1 ו-2. DNA פלסמיד מן השיבוטים האלה היה מבודד ושימש עבור טרנספורמציה DH5α כדי לקבל כמות גבוהה יותר של DNA. פלסמידים רקומביננטיים אלה שנבחרו מראש מוגברת ב- DH5α נבדקו לאחר מכן על ידי עיכול אנזימטי. באיור 3C-E מודגמים תוצאות העיכול האנזימטי של שיבוט אחד חיובי רקומביננטי מתעכל עם Hind III, PstI, אנזימי הגבלה BamHI(איור 3C, D, E נתיב 2). דפוסי העיכול ההינדית וה-PstI של השיבוט הרקומביננטי היו דומים לאלה שהושגו עבור pAdEasy-1 מאז HindIII ו- PstI חתכו את הפלסמיד pAdEasy-1 24 ו-25 פעמים, בהתאמה,(איור 3C ו- D, נתיב 3); הינדיל חותכים פעם אחת ו-PstI חותכים פי ארבעה מהווקטור pAdTrack-GFP(איור 3C ו-D, נתיב 1). BamHI חתך פעמיים את הווקטור PAdEasy-1(איור 3C, נתיב 3) ופעם pAdTrack-GFP(איור 3C, נתיב 1).
PacI חתך קטע של 4.5 קילו-בייט מהפלסמיד הרקומביננטי(איור 3F, נתיב 2), שבר של 2863 bp מ- pAdTrack-GFP(איור 3F, נתיב 1) ו- vector pAdEasy-1(איור 3F, נתיב 3). סולם הדנ"א מיוצג באיור 3C-F, בנתיבים 4. פלסמיד רקומביננטי היה מתעכל עם Pac I לשימוש נוסף עבור TRANSFection AD293.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> איור 3: שילוב מחדש של pAdTrack-GFP עם הפלסמיד pAdEasy-1. הפלסמידים שהושגו לאחר שילוב מחדש של pAdTrack-GFP ו pAdEasy-1 נבדקו על ידי PCR "שלילי" עבור שלמות pAdTrack-GFP (A). השיבוטים שאינם רקומביננטיים הוכחו על ידי נוכחות של רצועת 986 bp המתאימה לרצף המוגבר מהפלסמיד pAdTrack-GFP (A, נתיבים 3, 4 ו - 6). השיבוטים שעשויים להיות חיוביים לשילוב מחדש (A, נתיבים 2 ו -5) התקבלו גם כן. כאשר וקטור pAdTrack-GFP שימש כתבנית, הושגה רצועה של 986 bp עבור pAdTrack-GFP (A, נתיב 1). שיבוטים רקומביננטיים חיוביים פוטנציאליים נבדקו עבור ביטוי GFP על ידי PCR "חיובי" (B); להקה של 264 bp מופיעה הן עבור שיבוטים שעשויים להיות משולבים מחדש (B, נתיב 1 ו- 2), כמו גם עבור פלסמיד pAdTrack-GFP. הדנ"א של שיבוט רקומביננטי פוטנציאלי אחד נבדק עם הינדיל, PstI, BamHI, ואנזים הגבלת PacI (C-F, נתיבים 2). בפקדים, הווקטור pAdEasy-1 (C-F, נתיבים 3) ופלסמיד pAdTrack-GFP (C-F, נתיבים 1) התעכלו עם אותם אנזימים. סולם הדנ"א מיוצג בנתיב סי-אף 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
האריזה וההגברה האדנו-ויראלית בוצעו בתאי AD293. החלקיקים האדנו-ויראליים (AdV-GFP) טוהרו מן lysate התא AD293, כמו גם מן המדיום תרבות התא, שם הם שוחררו על ידי התאים הנגועים. כדי לרכז את אדנווירוס נמצא במדיום תרבות התא, החלקיקים היו זירז עם אמוניום גופרתי ולאחר מכן resuspended ב 10 mM Tris HCl pH 8 עם 2 mM MgCl2, אותו חיץ כמו זה המשמש תמוגה התא. לאחר מכן, החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגציה לא רציפה של CsCl. לאחר התרכזות, הושגה רצועה חזקה של AdV-GFP מטוהרת, כפי שמוצג באיור 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> איור 4: הטיהור האדנו-ויראלי על-ידי אולטרה-צנטריפוגה במעבר צבע לא רציף של CsCl. הומוגנט התא ואת אדנווירוס זירז מן המדיום היו נתונים ultracentrifugation על שיפוע רציפה שנוצר על ידי פתרונות CsCl בצפיפות נמוכה וגבוהה. להקות חזקות של GFP- אדנווירוס הוכחו בשני המקרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לקבוע את titer ויראלי לידי ביטוי יחידות מתמר לכל mL אחד (TU / mL), התאים AD293 היו נגועים בדילול סדרתי של AdV-GFP. לאחר 48 שעות, התאים הנגועים הביעו GFP, בקורלציה הפוכה עם גורם הדילול של ההשעיה הנגיפית. זה נצפתה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואחוז התאים החיוביים של GFP נקבע על ידי ציטומטריית זרימה(איור 5). כדי לחשב את הטיטר, נחשב הדילול הנגיפי שגרם ל-5 - 20% מהתאים החיוביים של GFP (איור 5C). בדרך כלל, אנו מקבלים טיטר ויראלי של ~ 1010 (TU / mL) עבור GFP-אדנווירוס.
להלן, אנו מספקים דוגמה לחישוב טיטר אדנו-ויראלי עבור אצווה אדנו-ויראלית ספציפית שבה 300000 תאים (C) הועברו עם פתרון אדנו-ויראלי 1 מ"ל (V), בגורם דילול של 106 (D), שעבורו התקבלו 6% תאים חיוביים ל- GFP (F):
טיטר (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1.8 x 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> איור 5: הערכת הטיטר האדנו-ויראלי. תאי AD293 היו נגועים בדילול אדנו-ויראלי שונים. ארבעים ושמונה שעות מאוחר יותר, התאים נצפו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ונותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים GFP המושרה על ידי דילול אדנו-ויראלי שונה (A-D). כדי להקים את השער עבור cytometry זרימה, תאים שאינם transduced נותחו גם (E). Titer מחושב עבור גורם הדילול 106, כאשר 6% מהתאים היו חיוביים GFP היה 1.8 x 1010 TU / mL. עבור לוחות A-E, עמודות: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
כדי לבדוק את פוטנציאל התמרה של אדנווירוס מוכן, ארבעה קווי תאים שימשו: תאי אנדותל אנושיים (EA.hy926), תאי אנדותל שלאבי העורקים (BAEC), hepatocytes מורין (Hepa 1-6), ותאי סטרומה mesenchymal מורין (MSC). תאי אנדותל (EA.hy926 ו BAEC) היו transduced עם 25 TU / תא, hepatocytes היו transduced עם 5 TU / תא MSC היו transduced עם 250 TU / תא.
הנה דוגמה כיצד נפח ההשעיה אדנו-ויראלי צריך להדביק 3 x 106 תאים עם 25 TU / תא, באמצעות השעיה אדנו-ויראלי עם 1.8 x 1010 TU / mL, חושב.
לתא אחד .............. 25 TU 3 x 106 תאים .............. x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x =75 x 106 TU אם המניה הנגיפית מכילה 1.8 x 1010 TU .............. 1 מ"ל 75 x 106 TU .............. y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y = 4.2 x 10-3 מ"ל = 4.2μL של מלאי ויראלי
ארבעים ושמונה שעות לאחר ההשתנות, התאים נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שמוצג באיור 6, תאי אנדותל אנושיים או שור הועברו ביעילות טובה (~ 50%) עבור 25 TU/תא(איור 6 EA.hy926 ו-BAEC). Hepatocytes מורין (Hepa 1-6) הועברו ביעילות על ידי אדנווירוס בכמות נמוכה של חלקיקי אדנווירוס (5 TU / תא), אבל הם גם רגישים אדנווירוס מאז אחוז גבוה יותר של תאים מתים (תאים חיוביים PI) נרשם (~ 16%) בהשוואה לסוגי התאים האחרים. תאים סטרומה Mesenchymal היו הקשים ביותר לתמר (איור 6), בשל היעדר קולטנים אדנו-ויראליים ספציפיים (נתונים שלא פורסמו).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> איור 6: ההדבקה של אדנווירוס והאינקדוקציה של ביטוי GFP בתאים שעברו עירוי. תאי אנדותל אנושיים (EA.hy926), תאי אנדותל שלאבי העורקים (BAEC), הפטוציטים מורין (Hepa 1-6) ותאי סטרומה מסנצ'ימליים מורין (MSC) הועברו עם הכמות המצוינת של אדנווירוס. GFP זוהה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואחוז התאים החיוביים של GFP נותח על ידי ציטומטריית זרימה. תאים חיוביים PI שנקבעו על ידי cytometry זרימה להראות את תמותת התא נקבע על ידי התמרות נגיפית. תאי EA.hy926, תאי אנדותל שלאבי העורקים, ותאי Hepa 1-6 הועברו מאוד על ידי אדנווירוס, התשואה של התמרה הנעה בין 41 - 52%. עבור MSC, כמות גבוהה יותר של וירוס (250 TU /תאים) המושרה רק 27% GFP חיובי של התאים transduced. עמודות: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת pAdEasy. הטכנולוגיה כוללת שילוב מחדש של pAdTrack ו pAdEasy-1 פלסמידים, האריזה וההגברה אדנווירוס, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מן מדיום lysate ותרבות התא, titration ויראלי, ואת הבדיקה הפונקציונלית של אדנווירוס.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

ברוכים הבאים למכון לביולוגיה ופתולוגיה תאית, ניקולאי סימיונסקו מבוקרשט, רומניה. כאן במעבדת התמרה הנגיפית, אנו מראים חלק מייצור החלקיקים האדנו-ויראליים באמצעות מתודולוגיה ממוטבת המבוססת על מערכת AdEasy שפותחה על ידי פרופסור פוגלשטיין. השלבים העיקריים של הטכנולוגיה לייצור אדנווירוסים זה הם, אחד, שילוב מחדש של pAdTrack המכיל GFP עם pAdEasy-1 פלסמיד בחיידקים BJ5183.שתיים, לארוז את החלקיקים האדנו-ויראליים. שלוש, הגברה של אדנווירוס בתאי AD293. ארבעה, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מתא ליזלת ותרבות בינונית.חמש, טיטרציה ויראלית ובדיקות תפקודיות של אדנווירוס. כאן, נציג צעד חשוב של המתודולוגיה. טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות.הטיהור של אדנווירוס מתחיל עם קצירת התאים המייצרים וירוסים ואת המדיום. תאי AD293 הודבקו עם פלסמיד רקומביננטי וכפי אדנווירוס נארז. ואז אדנווירוס הוגבר על ידי תרבויות גדולות יותר רצופות.כאן, השגנו 25 צלחות T175, והתחלנו את הטיהור של אדנווירוס מן lysate התא ואת המדיום התרבותי. ראשית, בדקנו את הפלואורסצנטיות הירוקה של GFP לידי ביטוי על ידי התאים transduced. אם התאים עדיין מחוברים, אנו ננתק אותם על ידי הקשה על צלחת התרבות או באמצעות מגרד ארוך.התאים והמדיום נאספים. הבקבוקים נשטפים עם PBS, שנאסף גם בצינורות פלקון. התאים הם גלולות על ידי צנטריפוגה.שמור את גלולת התא, כמו גם את המדיום לטיהור נוסף של אדנווירוס. בשלב זה, העזרה של עמית מוערך היטב כדי להאיץ את תהליך הקציר. גלולת התא ירוקה עקב ביטוי GFP.גלולה הוא resuspended במאגר Tris היפרטוני, אשר יקל על ההפרעה של התאים. עבור תמוגה של תאים, אנו משתמשים בחנקן נוזלי והגז היבש התחמם עד 37 מעלות. אין לבצע יותר משלושה מחזורים מאז הנגיף ייפגע.כדי להגביר את היעילות של הפרעה לתאים בזהירות לעבור את התא הומוגניזציה דרך מחט מזרק 23 מד. צנטריפוגה התא lysate ב 9, 600 x g במשך 12 דקות. להעביר את supernatant בצינורות חדשים להשליך את כדורי.שמור את supernatant על הקרח לעיבוד נוסף על ידי ultracentrifuge. עכשיו, אנחנו מעבדים את מדיום התרבות כדי לבודד את אדנווירוס ששוחרר מהתאים. לכך, ראשית, אנו שוקלים את הכמות הדרושה של אמוניום גופרתי ומוסיפים אותו לבקבוק שבו נאסף מדיום התרבות.הבקבוק רועד במרץ עד שהקריסטלים מומסים לחלוטין. התערובת דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים וחצי. ואז ההשעיה של המשקעים מחולקת לצינורות פלקון.צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1, 600 x g. לאחר הצנטריפוגה, supernatant מושלך ואת גלולה הוא respended ב 10 חיץ Tris מילימולאר. אם אחד לא יכול להמשיך את הטיהור של אדנווירוס עם צעד ultracentrifugation, משקעים ניתן לשמור במשך כמה ימים בארבע מעלות, אבל רק לאחר דיאליזה כדי להסיר את אמוניום גופרתי.כאן, הצגנו את שלב הדיאליזה. אנו משתמשים במזרק כדי להכניס את ההשעיה לקלטת רטובה בעבר. הדגימות מחויגות כנגד חיץ Tris 10 מילימולאר לילה בארבע מעלות.השלב האחרון של הטיהור מיוצג על ידי צעד ultracentrifugation על שיפוע צסיום כלוריד רציפה. כדי ליצור את השיפוע, ראשית, אנחנו פיפט שלושה מיליליטר של פתרון צפיפות גבוהה של צסיום כלוריד. על גבי שכבה זו, בעדינות לשפוך שלושה מיליליטר של צסיום כלוריד בצפיפות נמוכה.השעיית החלקיקים אדנו-ויראלי מן lysate התא או מדיום התרבות הוא מכוסה לאחר מכן על גבי השיפוע. הצינורות מלאים בשמן מינרלי ומוצגים בדליי SW41. לאחר שיווי המשקל, הצינורות נטענים באופן סימטרי לתוך הרוטור, אשר מוצג ultracentrifuge.הצנטריפוגה פועלת 35, 000 סל"ד וארבע מעלות במשך 18 שעות ללא הפסקה. לאחר ultracentrifugation, הצינורות ממוקמים על דוכן עם נייר שחור מאחור על מנת לקצור את הרצועות. השלב העליון הברור ופסולת התא מושלכים במיכל פסולת עם פתרון הלבנה.הרצועה הנמוכה ביותר המכילה את אדנווירוס השלם נקצרת עם קצה פיפטה ונאספת בצינור אפנדורף סטרילי. לאחר הדיאליזה, סוכרוז מתווסף להשעיה הנגיפית לריכוז סופי של 4%, ו aliquot ויראלי נשמרים קפואים במינוס 80 מעלות. בסעיף התוצאות, הראינו את הביטוי GFP בתאים transduced עם להשיג אדנווירוס.48 שעות לאחר התמרה, GFP מתבטא על ידי התאים transduced כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אחוז התאים המבטאים GFP נקבע על-ידי ציטומטריית זרימה. כ-50% מתאי האנדותל האנושיים והשיחים שעברו חילוף עם 25 יחידות התמרה לכל תא הם חיוביים של GFP.אותה תשואת התמרה הושגה עבור hepatocytes מורין כאשר רק חמש יחידות התמרה לכל תא שימשו, אבל זה קשור לתמותה גבוהה יותר בשל רגישות התא. מופחת לביטוי GFP הושג על ידי התמרים של תאים סטרומה mesenchymal בשל הביטוי הנמוך של הקולטנים הספציפיים. סיכום הערות.אנו מייעלים את הטכנולוגיה המפרכה כדי להפחית את הזמן, העלויות והמאמץ הדרוש להשגת החלקיקים האדנו-ויראליים. אדנווירוס מוכן הוא מסוגל להדביק סוגי תאים שונים כדי לגרום לביטוי של הגן של עניין.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

מכונות בדיקת שיטה משופרת להערכת Anchorage עצם השתל

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

ייצור ומיקוד של חד-אנרגיה קוונטית נקודות

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הארכת במודל חולדה המוביל אל עצם הירך Regenerated פונקציונלי

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...