Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
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इस काम को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से प्रतिस्पर्धात्मकता परिचालन कार्यक्रम 2014-2020 (पीओसी-ए-1-ए.1.1.4-ई-2015, के माध्यम से सह-वित्तपोषित परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। आईडी: P_37_668; परिवर्णी शब्द DIABETER), रोमानियाई अनुसंधान और नवाचार पीसीसीडीआई मंत्रालय का अनुदान-UEFISCDI, परियोजना संख्या पीएन-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 पीएनसीडी III के भीतर और रोमानियाई अकादमी द्वारा । लेखक अपनी उदार और प्रासंगिक सलाह के लिए किरियाकोस काइप्रोस (पासास विश्वविद्यालय, ग्रीस) को धन्यवाद देते हैं, ओविडियू क्रोइटू (ललित कला विश्वविद्यालय, बुखारेस्ट, रोमानिया) फिल्मांकन, फिल्म संपादन और ग्राफिकल डिजाइन, और तकनीकी सहायता के लिए मिहेला ब्रातु।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

जीन वितरण और अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी उपकरण है12 , 13,14. एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन द्वारा मजबूत प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, ब्याज के जीन का एन्कोडिंग अनुक्रम एडेनोवायरस के जीनोम में डाला जाता है। बर्ट वोगेलस्टीन की प्रयोगशाला में विकसित एडीसी एडेनोवायरल सिस्टम में एक बैकबोन प्लाज्मिड (पीएडीसी-1) शामिल है जिसमें अधिकांश जंगली प्रकार के एडेनोवायरस सेरोटाइप 5 जीनोम, और एक शटल वेक्टर (pAdTrack), जीन क्लोनिंग2,10के लिए डिज़ाइन किया गया है। एडेनोवायरल जीन E1 (संक्रामक वायरस कणों की असेंबली के लिए जिम्मेदार) और E3 (मेजबान प्रतिरक्षा से बचने में शामिल एन्कोडिंग प्रोटीन) के विलोपन ने एडेनोवायरल जीनोम में एक स्थान बनाया, जिसमें 6.5-7.5 केबी के हित का जीन2,3डाला जा सकता है। यह आकार कई जीनों के लिए पर्याप्त है, खासकर छोटे इंट्रोन15,16, 17वाले लोगोंकेलिए। शोधकर्ता भी हैं जो ट्रांसजीन18 , 19,20के सीडीएनए को ले जाने वाले एडेनोवायरस के उत्पादन की सूचना दे रहे हैं । हालांकि, हमने सीडीएनए-ले जाने वाले एडेनोवायरस के लिए ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की कम उपज प्राप्त की, जो उनके समकक्षों के लिए जीन या एक मिनी-जीन (डेटा नहीं दिखाया गया) ले जा रहा है।
पिछले तरीकों में सुधार और अनुकूल2,10,14,18,21,एडेनोवायरल उत्पादन के लिए प्रौद्योगिकी के लिए कम समय, कम लागत और कम प्रयास की आवश्यकता होती है। पूर्ण लंबाई adenoviral डीएनए शटल वेक्टर और अनुरूप पुनर्संयोजन प्रवण ई. कोलाई तनाव, BJ5183 में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के बीच पुनर्संयोजन द्वारा प्राप्त किया जाता है । प्रोटोकॉल AdEasier-1 कोशिकाओं (BJ5183 pAdEasy-1 युक्त बैक्टीरिया) के रासायनिक परिवर्तन का तात्पर्य है । इस तकनीक के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेटर की आवश्यकता नहीं होती है जो कुछ प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकती है, बहुत सरल है, पुनर्संयोजन उपज को बढ़ाती है, और सक्षम कोशिकाओं को प्राप्त करने और परिवर्तन करने के लिए आवश्यक समय को कम करती है। पीसीआर द्वारा किए गए पुनर्संयोजन क्लोन का चयन समय को और छोटा करता है और पूरी प्रक्रिया को आसान बनाता है। इसीतरहकी प्रक्रिया का उपयोग झाओ और सहकर्मियों द्वारा किया गया था, हालांकि, प्रोटोकॉल में, हमने प्राइमर के दृश्यों को अनुकूलित किया।
जीएफपी-एडेनोवायरस पैकेजिंग और प्रवर्धन के लिए, एक HEK293 व्युत्पन्न सेल लाइन का उपयोग किया गया था, अर्थात् AD293 कोशिकाएं, जो संस्कृति प्लेट के अधिक अनुयायी हैं। आमतौर पर एडेनोवायरल उत्पादन के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य सेल लाइनें निम्नलिखित हैं: 911, 293FT, pTG6559 (A549 व्युत्पन्न), प्रति। C6 (उसे व्युत्पन्न), GH329 (HeLa व्युत्पन्न), N52 । E6, और HeLa-E123,24,25,26। हमारे हाथों में, एडेनोवायरल उत्पादन में कोई सुधार प्राप्त नहीं किया गया था जब 911 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)। K2 रिएजेंट का उपयोग करके पुनर्संयोजन प्लाज्मिड के साथ AD293 कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन ने वायरल पैकेजिंग चरण की दक्षता में अत्यधिक वृद्धि की। एडेनोवायरस उत्पादन के बाद, एडीनोवायरस का ~ 70% तक अभी भी कोशिकाओं के अंदर है और तीन ठंड और विगलन चक्रों द्वारा जारी किया जाता है। चक्रों की संख्या बढ़ाना उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह एडेनोवायरस को नष्ट कर देता है।
नियमित एडेनोवायरल उत्पादन प्रक्रिया के दौरान, सेल संस्कृति माध्यम में कई वायरल कण जारी किए जाते हैं। संक्रमित AD293 कोशिकाओं की कटाई के दौरान इस सेल संस्कृति माध्यम को त्यागने से एक महत्वपूर्ण वायरल नुकसान होगा। हमने अमोनियम सल्फेट27के साथ वर्षा करके सेल संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों को शुद्ध करने के लिए Schagen और सहकर्मियों द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। पॉलीथीन ग्लाइकोल28का उपयोग करने की विधि की तुलना में सेल कल्चर माध्यम से एडेनोवायरस रिकवरी में इस विधि की दक्षता अधिक होती है । उपजी एडेनोवायरस को अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा तुरंत शुद्ध किया जाना चाहिए या कुछ दिनों के लिए फ्रिज में रखा जाना चाहिए लेकिन डायलिसिस के बाद ही नमक की अधिकता को दूर करना चाहिए। डायलिसिस के बिना कुछ घंटों से अधिक समय तक अवाण करना वायरस के लिए हानिकारक है।
एक चरण में किए गए अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा एडेनोवायरल कणों का शुद्धिकरण एडेनोविरल स्टॉक के हेरफेर को कम करता है और लगातार अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन चरणों का उपयोग करके प्रोटोकॉल की तुलना में प्रक्रिया को आसान बनाता है14,29। सीज़ियम क्लोराइड को हटाने के लिए शुद्ध एडेनोवायरस का डायलिसिस आवश्यक है जो आगे लेनदेन को प्रभावित कर सकता है। प्रोटोकॉल में, हमने एमजीसीएल2 वाले ट्रिस बफर का उपयोग किया, लेकिन डायलिसिस के लिए सुक्रोज नहीं, क्योंकि इसके लिए एक विशाल, अनुचित मात्रा में सुक्रोज की आवश्यकता होती है जिसे ठंड के लिए परिरक्षक के रूप में अन्यथा आवश्यक है। इस प्रकार, हमने बाद में सुक्रोज को ठंड के लिए तैयार एडेनोवायरल स्टॉक्स में सीधे जोड़ा। शुद्ध एडेनोवायरस की लगातार ठंड और विगलन से बचने के लिए, एडेनोवायरल स्टॉक को अलीकोट करने और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सलाह दी जाती है। एडेनोवायरल टाइटर का मूल्यांकन जीएफपी रिपोर्टर जीन और एक विशिष्ट वायरल कमजोर पड़ने के लिए ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं के प्रतिशत पर विचार करते हुए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था । यह विधि शास्त्रीय "पट्टिका परख" की तुलना में तेज है और कैप्सिड प्रोटीन (एलिसा या प्रवाह साइटोमेट्री जैसे विभिन्न तरीकों से) के मूल्यांकन की तुलना में अधिक विश्वसनीय है जो एडेनोवायरल कणों के संक्रमण की क्षमता को प्रकट नहीं करता है। हालांकि, एलिसा-आधारित मात्राकरण, क्यू-पीसीआर, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके पट्टिका परख वैकल्पिक तरीके हैं, विशेष रूप से एडेनोवायरस के टिटरेशन के लिए उपयोगी हैं जिनमें फ्लोरोसेंट ट्रेसर नहीं होता है।
यह देखते हुए कि pAdTrack adenoviruses मानव adenoviruses से प्राप्त कर रहे हैं जो कॉक्ससैकीवायरस और एडेनोवायरस रिसेप्टर्स (सीएआर) द्वारा मान्यता प्राप्त है, हमने जीएफपी-ए की क्षमता का प्रदर्शन किया मानव मूल (एंडोथेलियल कोशिकाओं) की कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिएडेनोवायरस, लेकिन अन्य मूल की कोशिकाएं भी: गोजातीय (एंडोथेलियल कोशिकाएं) और मुरीन (मेसेन्चिमल स्ट्रोमल कोशिकाएं और हेपेटोसाइट्स)। आंकड़ों से पता चला है कि जीएफपी-एडेनोवायरस ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्रेरित कर सकता है ।
अंत में, हम समय, लागत को कम करने के लिए इस श्रमसाध्य प्रौद्योगिकी का अनुकूलन किया, और adenoviral कणों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रयास । तैयार एडेनोवायरस विभिन्न कोशिका प्रकारों को संक्रमित करने और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में सक्षम है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रयोगों में किया जा सकता है क्योंकि एडेनोवायरल-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन उपचारों के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है।
संक्षिप्त रूप: AdV-GFP, adenoviral कणों; बीएईसी, गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं; सीएससीएल, सीज़ियम क्लोराइड; जीएफपी, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एमएससी, मेसेंचिमल स्ट्रोमल सेल; टीयू, ट्रांसड्यूसिंग इकाइयां।

एडेनोवायरस गैर - वेलोपिड वायरस हैं जिनमें न्यूक्लियोकैप्सिड और डबल-फंसे रैखिक डीएनए जीनोम1,2,3होते हैं । Adenoviruses सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित कर सकते हैं और संक्रमण सक्रिय मेजबान सेल डिवीजन पर निर्भर नहीं है। संक्रमण के बाद, एडेनोवायरस मेजबान कोशिका नाभिक में अपने जीनोमिक डीएनए का परिचय देता है, जहां यह एपीक्रोमोसोमल रहता है और मेजबान के जीन के साथ एक साथ लिखित है । इस प्रकार , सम्मिलित म्यूटेनेसिस या ओन्कोजीन विनियमन के लिए न्यूनतम संभावित जोखिम4, 5,6प्राप्तहोताहै । एडेनोवायरल जीनोम को मेजबान जीनोम के साथ दोहराया नहीं जाता है और इस प्रकार, एडेनोवायरल जीन को विभाजित कोशिका आबादी में पतला किया जाता है। एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन के फायदों में से, वहां हैं: (i) ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर; (ii) एपिसोमल अभिव्यक्ति के कारण, मेजबान जीनोम में वायरल डीएनए के एकीकरण से संबंधित जोखिमों को कम करना; (iii) विभिन्न प्रकार के विभाजन और गैर-विभाजन कोशिका प्रकारों का विभाजन। जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एडेनोवायरस गैर-प्रतिकृति हैं, जिसमें ई 1 क्षेत्र7,8,9की कमी है। उनके उत्पादन के लिए, E1 अनुक्रम (जैसे HEK293) की आपूर्ति करने वाली सेल लाइन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वायरल जीवन चक्र (E3) के लिए एक गैर-आवश्यक क्षेत्र वायरल जीनोम में ट्रांसजीन के सम्मिलन की अनुमति देने के लिए हटा दिया गया था; अन्य क्षेत्रों (E2 और E4) को आगे कुछ adenoviruses में हटा दिया गया था, लेकिन इन मामलों में, एडेनोवायरल उत्पादन की कम उपज और ट्रांसजीन की कम अभिव्यक्ति7की सूचना दी गई ।
यहां, हम एडीईसी सिस्टम का उपयोग करके एडेनोवायरस के निर्माण, पैकेजिंग और शुद्ध करने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन सुधारों ने निम्नलिखित फायदों के कारण बर्ट वोगेलस्टीन2,10द्वारा विकसित मूल विधि की तुलना में एडेनोवायरस की पैकिंग को तेज और अधिक किफायती तरीके से अनुमति दी: (i) बैक्टीरिया के रासायनिक परिवर्तन द्वारा बीजे 5183-युक्त pAdEasy-1 में पुनर्संयोजन; (ii) पीसीआर द्वारा पुनर्संयोजन क्लोन का चयन; (iii) एडेनोवायरल पैकेजिंग के लिए K2 ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग करके AD293 कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन; (iv) वायरल पैकेजिंग और प्रवर्धन के बाद संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की वर्षा; (v) एक-चरण सीज़ियम क्लोराइड (सीएससीएल) रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके एडेनोवायरल शुद्धिकरण।
एडीईसी सिस्टम(चित्रा 1)का उपयोग करके एडेनोवायरस उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल में निम्नलिखित कदम शामिल हैं:
(1) BJ5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन (2) एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग (3) एडेनोवायरस का प्रवर्धन (4) कोशिका ओंटेत और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि (5) एडेनोवायरस टाइट्रेशन।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> चित्रा 1: एडेनोवायरस उत्पादन प्रौद्योगिकी। एडेनोवायरल तकनीक के मुख्य कदम हैं: (1) बीजे5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ PAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन। चयनित पुनः संयोजन प्लाज्मिड DH5α बैक्टीरिया में परिलक्षित होते हैं और फिर शुद्ध होते हैं; (2) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग, जो एडेनो-E1 प्रोटीन का उत्पादन कर रहे हैं; (3) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरस का प्रवर्धन; (4) सीएससीएल घनत्व ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा कोशिका ओंटेत और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि; (5) एडेनोवायरस का टाइटेशन और फंक्शनल टेस्टिंग । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
इस प्रोटोकॉल में, हमने एडेनोवायरस के उत्पादन के लिए प्रौद्योगिकी का उदाहरण दिया, जो मेजबान कोशिकाओं में जीएफपी की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। GFP पहले से ही एक दूसरे CMV प्रमोटर के तहत pAdTrack-CMV शटल वेक्टर (Addgene #16405) की रीढ़ में डाला जाता है और एक रिपोर्टर जीन(चित्रा 1)के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस कारण से, यहां हमने पीएडट्रैक-सीएमवी वेक्टर को पीएडट्रैक-जीएफपी के रूप में नामित किया और हमने प्रदर्शनात्मक उद्देश्यों के लिए जीएफपी की अभिव्यक्ति का आकलन किया। जीएफपी अभिव्यक्ति के अलावा, सिस्टम का उपयोग ब्याज के जीन को अधिक प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है, जिसे पीएडट्रैक-सीएमवी की कई क्लोनिंग साइटों में क्लोन किया जा सकता है। पीएडीट्रैक-सीएमवी में क्लोन किया गया जीन या मिनीजीन आमतौर पर सीडीएनए11की तुलना में अभिव्यक्ति प्रेरण के लिए अधिक कुशल होता है। आंकड़ों ने विभिन्न स्रोतों (मानव, गोजातीय, मुरीन) से ट्रांसड्यूडिक कोशिकाओं (जैसे हेपेटोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं) में एक मजबूत जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाई। Adenoviral-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन चिकित्सा के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन में ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को कोशिका प्रकारों और अंगों की एक व्यापक विविधता में मजबूत और क्षणिक प्रेरण का लाभ होता है। हालांकि, पुनः संयोजन एडेनोवायरल तकनीक श्रमसाध्य, समय लेने वाली और महंगी है। यहां, हम शुद्ध एडेनोविराल कणों को प्राप्त करने के लिए pAdEasy प्रणाली का उपयोग करके एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो ट्रांसड्यूड कोशिकाओं में एक मजबूत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। इस बेहतर विधि के फायदे तेजी से तैयारी कर रहे हैं और बर्ट वोगेलस्टीन द्वारा विकसित मूल विधि की तुलना में उत्पादन लागत में कमी आई है। एडेनोवायरल तकनीक के मुख्य कदम हैं: (1) बीजे5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन; (2) एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग; (3) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरस का प्रवर्धन; (4) कोशिका ओंटे और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि; और (5) एडेनोवायरस का वायरल टाइट्रेशन और कार्यात्मक परीक्षण। मूल विधि में सुधार बैक्टीरिया के रासायनिक परिवर्तन द्वारा BJ5183-युक्त pAdEasy-1 में पुनर्संयोजन (i) से मिलकर बनता है; (ii) "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआर द्वारा पुनर्संयोजन क्लोन का चयन; (iii) एडेनोवायरल पैकेजिंग के लिए K2 ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग करके AD293 कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन; (iv) कोशिका संस्कृति माध्यम में AD293 कोशिकाओं द्वारा जारी वायरल कणों के अमोनियम सल्फेट के साथ वर्षा; और (v) एक कदम सीजियम क्लोराइड असतत ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा वायरस का शुद्धिकरण । विभिन्न स्रोतों (मानव, गोजातीय, मुरीन) से विभिन्न प्रकार की ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं (जैसे हेपेटोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं) में ब्याज के जीन की एक मजबूत अभिव्यक्ति प्राप्त की गई थी। Adenoviral-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन चिकित्सा के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है ।

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An Efficient Method for Adenovirus Production

यहां, हम pAdEasy प्रणाली का उपयोग कर adenovirus उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस तकनीक में पेडट्रैक और पैडैसी-1 प्लाज्मिड्स का पुनर्संयोजन, एडेनोवायरस पैकेजिंग और प्रवर्धन, सेल लैसट और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों का शुद्धिकरण, वायरल टाइटेशन और एडेनोवायरस का कार्यात्मक परीक्षण शामिल है।

एडेनोवायरस उत्पादन के लिए एक कुशल विधि

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

सेलुलर जीव विज्ञान और पैथोलॉजी संस्थान में आपका स्वागत है, बुखारेस्ट, रोमानिया से निकोले सिमिएनेस्कू। यहां वायरल ट्रांसडक्शन प्रयोगशाला में, हम प्रोफेसर वोगेलस्टीन द्वारा विकसित एडीईसी प्रणाली के आधार पर एक अनुकूलित पद्धति का उपयोग करके एडेनोवायरल कण उत्पादन का एक हिस्सा दिखाते हैं। इस एडेनोवायरस के उत्पादन के लिए प्रौद्योगिकी के मुख्य कदम, एक, बीजे 5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ GFP युक्त pAdTrack का पुनर्संयोजन हैं।दो, एडेनोविराल कणों की पैकेजिंग। तीन, AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरस का प्रवर्धन। चार, कोशिका ओं और संस्कृति माध्यम से एडेनोविराल कणों की शुद्धि।पांच, वायरल टाइट्रेशन और एडेनोवायरस का कार्यात्मक परीक्षण। यहां हम कार्यप्रणाली का एक महत्वपूर्ण कदम पेश करेंगे । कोशिका ओं और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि।एडेनोवायरस की शुद्धि वायरस पैदा करने वाली कोशिकाओं और माध्यम की कटाई के साथ शुरू होती है। AD293 कोशिकाओं को पुनर्संयोजन प्लाज्मिड से संक्रमित किया गया था और एडेनोवायरस के रूप में पैक किया गया था। तब एडेनोवायरस को लगातार बड़ी संस्कृतियों द्वारा परिलक्षित किया गया था।यहां हमने 25 T175 प्लेटें प्राप्त कीं और हमने सेल लिएट और कल्चर मीडियम से एडेनोवायरस की शुद्धि शुरू की। सबसे पहले, हमने ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त जीएफपी के हरे रंग के फ्लोरेसेंस की जांच की। यदि कोशिकाएं अभी भी जुड़ी हुई हैं, तो हम संस्कृति पकवान का दोहन करके या एक लंबे स्क्रैपर का उपयोग करके उन्हें अलग कर देंगे।कोशिकाओं और माध्यम एकत्र कर रहे हैं। फ्लास्क को पीबीएस से धोया जाता है, जिसे फाल्कन ट्यूब्स में भी एकत्र किया जाता है । कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र द्वारा गोली मार रहे हैं।एडेनोवायरस के आगे शुद्धिकरण के लिए सेल पेलेट के साथ-साथ माध्यम रखें। इस कदम पर, कटाई की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए एक सहकर्मी की मदद की अच्छी तरह से सराहना की जाती है। जीएफपी एक्सप्रेशन के कारण सेल पेलेट हरा होता है।गोली हाइपरटॉनिक ट्रिस बफर में फिर से निलंबित है, जो कोशिकाओं के व्यवधान की सुविधा होगी । सेल लाइसिस के लिए हम लिक्विड नाइट्रोजन का इस्तेमाल करते हैं और सूखी गैस 37 डिग्री तक गर्म होती है। वायरस क्षतिग्रस्त हो जाएगा के बाद से तीन से अधिक चक्र प्रदर्शन न करें।सेल व्यवधान की दक्षता बढ़ाने के लिए ध्यान से सेल एक 23 गेज सिरिंज सुई के माध्यम से समरूप गुजरती हैं। सेंट्रलाइज सेल 12 मिनट के लिए 9, 600 एक्स ग्राम पर lysate। नई ट्यूबों में सुपरनैंट पास करें और छर्रों को त्यागें।अल्ट्रासेंट्रफ्यूज द्वारा आगे की प्रक्रिया के लिए बर्फ पर सुपरनेट रखें। अब, हम कोशिकाओं से जारी एडेनोवायरस को अलग करने के लिए संस्कृति माध्यम को संसाधित करते हैं। इसके लिए सबसे पहले हम अमोनियम सल्फेट की जरूरी मात्रा को वजन करते हैं और उसे उस बोतल में जोड़ते हैं, जिसमें कल्चर मीडियम इकट्ठा किया जाता था।बोतल को तब तक जोर से हिलाया जाता है जब तक कि क्रिस्टल पूरी तरह से भंग न हो जाएं। मिश्रण दो घंटे और आधे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटेड है । फिर वर्षा के निलंबन को फाल्कन ट्यूबों में विभाजित किया जाता है।1, 600 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को छोड़ दिया जाता है और 10 मिलीमोलर ट्राइस बफर में गोली को फिर से निलंबित कर दिया जाता है। यदि कोई अतिकेंद्रित कदम के साथ एडेनोवायरस की शुद्धि जारी नहीं रख सकता है, तो वर्षा को कुछ दिनों के लिए चार डिग्री पर रखा जा सकता है, लेकिन डायलिसिस के बाद ही अमोनियम सल्फेट को दूर करने के लिए।यहां हमने डायलिसिस स्टेप पेश किया। हम पहले से गीले कैसेट में निलंबन पेश करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करते हैं। नमूनों को चार डिग्री पर रात भर 10 मिलीमोलर ट्रिस बफर के खिलाफ डायलिज किया जाता है ।शुद्धिकरण के अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व सीज़ियम क्लोराइड असतत ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन चरण द्वारा किया जाता है। ढाल बनाने के लिए, सबसे पहले, हम सीज़ियम क्लोराइड के उच्च घनत्व समाधान के तीन मिलीलीटर पिपेट करते हैं। इस परत के शीर्ष पर, धीरे-धीरे कम घनत्व वाले सीज़ियम क्लोराइड के तीन मिलीलीटर डालें।कोशिका लाइसेट या संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कण निलंबन फिर ढाल के शीर्ष पर मढ़ा जाता है। ट्यूब खनिज तेल से भरे हुए हैं और SW41 बाल्टी में पेश किए जाते हैं। संतुलन के बाद, ट्यूबों को रोटर में सममित रूप से लोड किया जाता है, जिसे अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में पेश किया जाता है।सेंट्रलाइज बिना ब्रेक के 18 घंटे तक ३५, ० आरपीएम और चार डिग्री चलाता है । अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन के बाद, बैंड की कटाई के लिए ट्यूबों को पीछे एक काले कागज के साथ एक स्टैंड पर रखा जाता है। स्पष्ट ऊपरी चरण और सेल मलबे को ब्लीचिंग समाधान के साथ अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दिया जाता है।पूरा एडेनोवायरस युक्त सबसे कम बैंड एक पिपेट टिप के साथ काटा जाता है और एक बाँझ Eppendorf ट्यूब में एकत्र किया जाता है। डायलिसिस के बाद, सुक्रोज को वायरल निलंबन में 4% अंतिम एकाग्रता में जोड़ा जाता है और वायरल एलिकोट को शून्य से 80 डिग्री पर जमे हुए रखा जाता है। परिणाम अनुभाग में, हमने प्राप्त एडेनोवायरस के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाई।ट्रांसडक्शन के 48 घंटे बाद, जीएफपी को ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है जैसा कि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है। जीएफपी व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रति सेल 25 ट्रांसडक्शन यूनिट्स के साथ ट्रांसड्यूस किए गए मानव और गोजातीय एंडोथेलियल कोशिकाओं में से लगभग 50% जीएफपी सकारात्मक हैं।एक ही ट्रांसडक्शन यील्ड मुरीन हेपेटोसाइट्स के लिए प्राप्त की गई थी जब प्रति सेल केवल पांच ट्रांसडक्शन यूनिट का उपयोग किया गया था, लेकिन यह सेल संवेदनशीलता के कारण उच्च मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है। विशिष्ट रिसेप्टर्स की कम अभिव्यक्ति के कारण मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन द्वारा जीएफपी अभिव्यक्ति को कम किया गया था। समापन टिप्पणी।हम समय, लागत को कम करने के लिए इन श्रमसाध्य प्रौद्योगिकी का अनुकूलन करते हैं, और एडेनोवायरल कणों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रयास करते हैं। तैयार एडेनोवायरस विभिन्न कोशिका प्रकारों को संक्रमित करने और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में सक्षम है।

Research

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