Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
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この作業は、欧州地域開発基金から競争力運用プログラム2014-2020(POC-A.1-A.1.1.4-E-2015)を通じて共同出資されたプロジェクトによって支援されました。 ID: P_37_668; 頭字語 DIABETER, 頭字語, 研究イノベーションのルーマニア省PCCDI - UEFISCDI, プロジェクト番号PN-III-P1-1.2-PCCDI-PCCDI-2017-0697内 PNCD III 内およびルーマニアアカデミーによって.著者らは、キリアコス・キプレオス(ギリシャのパトラス大学)に対する寛大で関連性の高いアドバイス、オビディウ・クロワトル(ルーマニアのブカレスト美術大学)の撮影、映画編集、グラフィカルデザイン、技術支援のためのミハエラ・ブラトゥに感謝する。

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	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. 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著者らは開示するものは何もない。

組換えアデノウイルスは、遺伝子の送達および発現12、13、14のための汎用性の高いツールです。アデノウイルス伝達によって強力なタンパク質発現を誘導するために、対象となる遺伝子のコード配列がアデノウイルスのゲノムに挿入される。バート・フォーゲルシュタインの研究室で開発されたAdEasyアデノウイルスシステムは、野生型アデノウイルス血清型5ゲノムの大部分を含む骨格プラスミド(pAdEasy-1)と、遺伝子クローニング2、10用に設計されたシャトルベクター(pAdTrack)を含む。アデノウイルス遺伝子E1(感染性ウイルス粒子の集合を担う)およびE3(宿主免疫の回避に関与するタンパク質をコードする)の欠失は、6.5〜7.5kbの目的遺伝子を挿入することができるアデノウイルスゲノムに空間を作り出した。このサイズは、特に短いイントロン15、16、17を持つもののために、多くの遺伝子のために十分です。また、トランスジーン18、19、20のcDNAを運ぶアデノウイルスの産生を報告する研究者もあります。しかし、cDNAを運ぶアデノウイルスに対するトランスジーン発現の収率は、遺伝子やミニ遺伝子を運ぶ相手よりも低い(データは示されていない)。
前の方法2、10、14、18、21を改善し、適応させる、アデノウイルス生産のための技術は、より短い時間、より低コスト、およびより少ない労力を必要とする。全長アデノウイルスDNAは、相同組換えが起こりやすい大腸菌株BJ5183におけるシャトルベクターとpAdEasy-1プラスミドとの間の再結合によって得られる。このプロトコルは、Adeasy-1細胞(pAdEasy-1を含むBJ5183バクテリア)の化学変換を意味します。この技術は、いくつかの実験室では利用できない可能性のあるエレクトロポレーターを必要とせず、非常に単純であり、再結合収率を増加させ、そして有能な細胞を得るために必要な時間を短縮し、変換を行うために必要な時間を短縮する。PCRによって行われる組換えクローンの事前選択は、さらに時間を短縮し、全体の手順を容易にします。Zhaoと同僚22でも同様の手順を使用したが、プロトコルではプライマーの配列を最適化した。
GFP-アデノウイルスの包装および増幅のために、HEK293誘導細胞株、すなわちAD293細胞を使用し、これはより培養プレートに付着している。アデノウイルス産生に一般的に使用される他の細胞株は、以下である:911、293FT、pTG6559(A549誘導体)、PER。C6(HER誘導体)、GH329(HeLa誘導体)、N52。E6、およびHeLa-E1 23、24、25、26。我々の手では、911細胞を使用した場合、アデノウイルス産生の改善は得られなかった(データは示されていない)。K2試薬を用いた組換えプラスミドを用いたAD293細胞のトランスフェクションは、ウイルス包装工程の効率を高めた。アデノウイルス産生後、アデノウイルスの70%までは細胞内に残り、3回の凍結および解凍サイクルによって放出される。サイクル数を増やすことは、アデノウイルスを破壊するので適していません。
ルーチンのアデノウイルス産生プロセスを通して、多数のウイルス粒子が細胞培養培地中に放出される。感染したAD293細胞の収穫中にこの細胞培地を廃棄することは、重要なウイルス損失をもたらすであろう。我々は、Schagenと同僚が記述したプロトコルを最適化し、硫酸アンモニウム27で沈殿することにより、細胞培養培地からアデノウイルス粒子を精製する。この方法は、ポリエチレングリコール28を用いた方法に比べて、細胞培養培地からのアデノウイルス回収において高い効率を有する。沈殿したアデノウイルスは、超遠心分離によって直ちに精製するか、または数日間冷蔵庫に保管する必要がありますが、透析後にのみ、塩過剰を除去する必要があります。透析なしで数時間よりも長く沈殿物を維持することは、ウイルスに有害です。
1段階で行われる超遠心分離によるアデノウイルス粒子の精製は、アデノウイルスストックの操作を減少させ、連続する超遠心分離ステップ14、29を用いたプロトコルと比較して手順を容易にする。精製されたアデノウイルスの透析は、さらにトランスダクションに影響を与える可能性のある塩化セシウムを除去する必要がある。プロトコルでは、凍結のための防腐剤として必要とされる膨大で不当な量のスクロースが必要なため、透析にはMgCl2を含むトリスバッファーを使用しましたが、透析にはスクロースは使用しませんでした。したがって、後で、凍結のために準備されたアデノウイルス株に直接スクロースを加えた。精製されたアデノウイルスの頻繁な凍結および解凍を避けるために、アデノウイルスストックをアリクォートし、−80°Cで貯蔵することが推奨される。 アデノウイルス力価は、GFPレポーター遺伝子と特異的なウイルス希釈に対するトランスデューセ細胞の割合を考慮したフローサイトメトリーによって評価した。この方法は、古典的な「プラークアッセイ」と比較して速く、アデノウイルス粒子の感染能力を明らかにしていない(ELISAやフローサイトメトリーなどの様々な方法による)カプシドタンパク質の評価と比較して信頼できます。しかしながら、市販キットを用いたELISAベースの定量法、Q-PCR、またはプラークアッセイは代替方法であり、特に蛍光トレーサを含まないアデノウイルスの滴定に有用である。
pAdTrackアデノウイルスは、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体(CAR)によって認識されるヒトアデノウイルス血清型5に由来することを考慮して、ヒト起源の細胞(内皮細胞)をトランスデュースするGFP-アデノウイルスの能力を実証したが、他の起源の細胞であるウシ(内皮細胞)およびマウス(mesenalals)およびマウス(mesenalals)細胞も実証した。このデータは、GFP-アデノウイルスが高レベルのトランスジーンの発現を誘導できることを示した。
結論として、我々は時間、コスト、およびアデノウイルス粒子を得るために必要な労力を削減するために、この骨の多い技術を最適化しました。調製されたアデノウイルスは、様々な細胞型に感染し、目的の遺伝子の発現を誘導することができる。アデノウイルス媒介遺伝子導入は、現代の遺伝子治療を開発するための主要なツールの1つを表すので、このプロトコルは、様々な実験で使用することができる。
略語: AdV-GFP, アデノウイルス粒子;BAEC, ウシ大動脈内皮細胞;CsCl、塩化セシウム;GFP, 緑色蛍光タンパク質;MSC, 間葉間質細胞;TU、トランスデューシングユニット。

アデノウイルスは、ヌクレオキャプシドと二本鎖直鎖DNAゲノム1、2、3を含む非エンベロープウイルスである。アデノウイルスは広範囲の細胞タイプに感染し、感染は活性宿主細胞分裂に依存しない。感染後、アデノウイルスはゲノムDNAを宿主細胞核に導入し、エピクロモソームのままで宿主の遺伝子と共に転写される。したがって、挿入突然変異誘発または癌遺伝子調節のための最小限の潜在的リスクは、4、5、6を達成する。このアデノウイルスゲノムは宿主ゲノムと共に複製されず、従って、アデノウイルス遺伝子は分裂細胞集団中で希釈される。アデノウイルス伝達の利点の中には、(i)高レベルの遺伝子導入発現があります。(ii) ウイルスDNAの宿主ゲノムへの統合に関連するリスクが減少し、エピソーム発現によるもの。(iii)多種多様な分割細胞タイプおよび非分裂細胞型の伝達。生物医学研究で使用されるほとんどのアデノウイルスは非複製性であり、E1領域7、8、9を欠いている。それらの生産のために、E1配列を供給する細胞株(HEK293など)が必要である。また、ウイルスのライフサイクル(E3)のための非必須領域は、ウイルスゲノムにトランスジーンの挿入を可能にするために削除されました。他の領域(E2およびE4)は、いくつかのアデノウイルスでさらに削除されたが、これらの場合、アデノウイルス産生の収率低下およびトランスジーンの低発現が報告された7。
ここでは、AdEasyシステムを使用してアデノウイルスを構築、パッケージ化、および精製するための改良されたプロトコルを紹介します。これらの改善は、次の利点のためにBert Vogelstein2,10によって開発された元の方法と比較して、より速く、より経済的な方法でアデノウイルスのパッキングを可能にしました: (i) 細菌の化学変換によるBJ5183含有pAdEasy-1の再結合;(ii) PCRによる組換えクローンの選択;(iii) アデノウイルスパッケージング用のK2トランスフェクションシステムを用いたAD293細胞のトランスフェクション;(iv) ウイルスの包装および増幅後の培地からのアデノウイルス粒子の沈殿;(v)一段階塩化セシウム(CsCl)勾配超遠心化を用いたアデノウイルス精製。
AdEasy システムを使用したアデノウイルスの生産プロトコル (図 1) は、次の手順で構成されています。
(1) BJ5183細菌におけるpAdTrack-GFPとpAdEasy-1の再結合 (2)アデノウイルス粒子の包装 (3) アデノウイルスの増幅 (4) 細胞リセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製 (5) アデノウイルス滴定。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> 図1:アデノウイルス産生技術アデノウイルス技術の主なステップは次のとおりです: (1) BJ5183細菌のpAdEasy-1プラスミドとpAdTrack-GFPの組み換え。選択された再結合プラスミドはDH5α細菌で増幅され、次いで精製される。(2)AD293細胞におけるアデノウイルス粒子の包材、すなわちアデノ-E1タンパク質を産生している。(3) AD293細胞におけるアデノウイルスの増幅;(4)細胞リセートからのアデノウイルス粒子の精製と、CsCl密度勾配上の超遠心分離による培養液。(5) アデノウイルスの滴定と機能検査。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
本プロトコルでは、宿主細胞におけるGFPの発現を誘導できるアデノウイルスの産生技術を例示した。GFPは、pAdTrack-CMVシャトルベクター(Addgene #16405)の骨格に既に挿入されており、第2CMVプロモーターの下で、レポーター遺伝子として使用されている(図1)。このため、ここでは pAdTrack-CMV ベクターを pAdTrack-GFP として指定し、デモンストレーション目的で GFP の発現を評価しました。GFP発現に加えて、このシステムは、pAdTrack-CMVの複数のクローニング部位でクローン化され得る、目的の遺伝子を過剰発現するために使用することができる。pAdTrack-CMVでクローン化された遺伝子またはミニジーンは、通常、cDNA11と比較して発現誘導の効率が高い。データは、様々な供給源(ヒト、ウシ、マウス)からトランスデューセ細胞(例えば肝細胞、内皮細胞)における強いGFP発現を示した。アデノウイルス媒介遺伝子導入は、現代の遺伝子治療を開発するための主要なツールの1つです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

アデノウイルス伝達は、対象遺伝子の発現を幅広い種類の細胞タイプおよび器官に強く一過性誘導するという利点を有する。しかし、組換えアデノウイルス技術は、手間がかかり、時間がかかり、高価です。ここでは、pAdEasyシステムを用いて、強力な緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を誘導できる精製されたアデノウイルス粒子を、トランスデューセ細胞に誘導する改良されたプロトコルを提示する。この改良された方法の利点は、Bert Vogelsteinが開発した元の方法と比較して、より速い準備と生産コストの減少です。アデノウイルス技術の主なステップは次のとおりです: (1) BJ5183細菌のpAdEasy-1プラスミドとpAdTrack-GFPの再結合;(2)アデノウイルス粒子の包装;(3) AD293細胞におけるアデノウイルスの増幅;(4)細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製;(5)アデノウイルスのウイルス滴定および機能試験。元の方法の改良は、(i)細菌の化学変換によるBJ5183含有pAdEasy-1の組換えで構成されています。(ii) 組換えクローンの選択を「陰性」および「陽性」PCR(iii) アデノウイルスパッケージング用のK2トランスフェクションシステムを用いたAD293細胞のトランスフェクション;(iv)細胞培養培地中のAD293細胞によって放出されるウイルス粒子の硫酸アンモニウムによる沈殿;(v)一段階の塩化セシウムによるウイルスの浄化不連続勾配超遠心分離。目的の遺伝子の強い発現(この場合、GFP)は、様々な供給源(ヒト、ウシ、マウス)から異なるタイプのトランスデューセ細胞(例えば肝細胞、内皮細胞)で得られた。アデノウイルス媒介遺伝子導入は、現代の遺伝子治療を開発するための主要なツールの1つです。

より速く、より効率的なアデノウイルスの生産を達成するために、元のフォーゲルシュタインのプロトコルを変更し、改善しました。まず、組換え組換えの選択を容易にするために方法論を改訂した。再結合後、BJ5183細菌クローンは、再結合の欠如の指標としてpAdTrack-GFPの完全性を評価するために「陰性PCR」によって試験された(図3A)、または「陽性PCR」によって、対象遺伝子を同定し、我々の場合GFPに同化した(図3B)。「ネガティブ」と「ポジティブ」の両方のPDRにおいて、pAdTrack-GFPを制御テンプレートとして使用し、pAdTrackの完全性に対して986 bpのバンドを与えました(図3A、レーン1)、GFPのバンド264 bp(図3B、レーン3)を使用しました。「負のPCR」に使用されるプライマーは、pAdTrack-GFPにPmeI部位を含む986bpの断片を増幅するように設計された。このDNA断片は、組み換え後に大幅に拡大され、正の組換えクローンでは増幅されない。pAdTrack-GFPがそのまま残った組換え用の陰性クローンは、図3A、レーン3、4、および6に示されています。このプライマーは、組換え部位に隣接するDNA配列上でアニールする。図3B、レーン1、および2に示すように、潜在的陽性組換えクローン(図3A、レーン2および5)がGFPを発現する。これらのクローンからプラスミドDNAを単離し、DH5α変換に用い、より多くのDNAを得た。これらの事前選択された組換えプラスミドをDH5αで増幅し、酵素消化により試験した。図3においてC-Eは、ヒンドIII、PstI、BamHI制限酵素(図3C、D、Eレーン2)で消化された1つの組換え陽性クローンの酵素消化の結果を示す。組換えクローンのHindIIIおよびPstI消化パターンは、それぞれpAdEasy-1プラスミドを24回および25回切断した後、pAdEasy-1のために得られたものと類似していた(図3CおよびD、レーン3)。HindIIIは1回カットし、PstIはpAdTrack-GFPベクトルの4倍をカットした(図3CおよびD、レーン1)。bamHIは、pAdEasy-1ベクター(図3C、レーン3)を2回切断し、1回pAdTrack-GFP(図3C、レーン1)を切断した。
PacIは、組換えプラスミド(図3F、レーン2)から4.5kbの断片を切り取り、pAdTrack-GFPから2863bpの断片(図3F、レーン1)を切り取り、pAdEasy-1ベクター(図3F、レーン3)を直線化した。DNAラダーは 、図3C-Fで、レーン4で表される。組換えプラスミドを、AD293トランスフェクションに対して更に使用するためにPac Iで消化した。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> 図3:pAdEasy-1プラスミドとのpAdTrack-GFPの組み換え。pAdTrack-GFPとpAdEasy-1の再結合後に得られたプラスミドを、pAdTrack-GFP完全性(A)に対する「陰性」PCRによって試験した。非組換えクローンは、pAdTrack-GFPプラスミド(A、レーン3、4、および6)から増幅された配列に対応する986bpバンドの存在によって証明された。再結合に対して潜在的に陽性のクローン(A、レーン2および5)も得られた。pAdTrack-GFP ベクターをテンプレートとして使用した場合、pAdTrack-GFP (A, レーン 1) に対して 986 bp のバンドが得られた。潜在的に陽性の組換えクローンを「陽性」PCR(B)によってGFP発現について試験した。264 bp のバンドは、潜在的に再結合されたクローン (B、レーン 1、2) と pAdTrack-GFP プラスミドの両方に対して現れます。1つの潜在的な組換えクローンからのDNAを、HindIII、PstI、BamHI、およびPacI制限酵素(C-F、レーン2)で試験した。コントロールでは、pAdEasy-1ベクター(C-F、レーン3)およびpAdTrack-GFPプラスミド(C-F、レーン1)を同じ酵素で消化した。DNAラダーはC-Fレーン4で表される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このアデノウイルスの包装および増幅は、AD293細胞で行った。このアデノウイルス粒子(AdV-GFP)をAD293細胞リセートと細胞培養培地から精製し、感染細胞によって放出された。細胞培地に見られるアデノウイルスを濃縮するために、粒子を硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いで2 mMMgCl2で10 mM Tris HCl pH 8に再懸濁し、細胞リシスに使用したのと同じバッファーを含む。続いて、細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子を、超遠心分離のCsCl不連続勾配で精製した。超遠心分離後、 図4に示すように、精製されたAdV-GFPの強力なバンドが得られた。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> 図4:不連続なCsCl勾配上の超遠心分離によるアデノウイルス精製。培地から沈殿した細胞ホモジネートおよびアデノウイルスは、低密度および高密度のCsCl溶液によって形成された不連続勾配上で超遠心分離を行った。GFP-アデノウイルスの強いバンドは、両方のケースで証明された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1 mL当たりのトランスデューシングユニット(TU/mL)で発現するウイルス価を決定するために、AD293細胞にAdV-GFPの連続希釈液を感染させた。48時間後、感染細胞はGFPを発現し、ウイルス懸濁液の希釈因子との逆相関を有する。これを観察した蛍光顕微鏡とGFP陽性細胞の割合は、フローサイトメトリー(図5)によって決定した。力価を算出するために、GFP陽性細胞の5~20%を誘導したウイルス希釈が考慮された(図5C)。通常、GFP-アデノウイルスに対して、〜1010(TU/mL) のウイルス用タイターを取得します。
以下に、300000細胞(C)を1 mLアデノウイルス溶液(V)で導入した特定のアデノウイルスバッチに対するアデノウイルス価数計算の例を示し、希釈係数106(D) で、6%GFP陽性細胞(F)が得られた。
タイター (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1.8 x10 10 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> 図5:アデノウイルス用の評価AD293細胞は、各種のアデノウイルス希釈液に感染した。48時間後、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、フローサイトメトリーで分析し、異なる腺ウイルス希釈によって誘導されたGFP陽性細胞の割合(A-D)を決定した。フローサイトメトリーのゲートを確立するために、非導入細胞も解析した(E)。希釈因子106について算出した価価率は、細胞の6%がGFP陽性であった場合、1.8 x10 10 TU/mLであった。パネルA-Eの場合、バー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
調製されたアデノウイルスの伝達電位を試験するために、ヒト内皮細胞(EA.hy926)、ウシの大動脈内皮細胞(BAEC)、マウス肝細胞(Hepa 1-6)、マウス中葉間質細胞(MSC)の4つの細胞株を使用した。内皮細胞(EA.hy926およびBAEC)を25TU/細胞で導入し、肝細胞を5TU/細胞で導入し、MSCを250 TU/細胞で導入した。
ここでは、3 x 106 細胞を25 TU/細胞で感染させるために必要なアデノウイルス懸濁液の体積を、1.8 x 1010 TU/mLでアデノウイルス懸濁液を用いて、どのように計算したかの例を示す。
1 セルの場合.25 TU 3 x 106 細胞 .x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x=75 x 106 TU ウイルスストックに含まれている場合 1.8 x 1010 TU .1 mL 75 x 106 TU .y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y= 4.2 x 10-3 mL = 4.2μL のウイルスストック
導入から48時間後、細胞を蛍光顕微鏡で解析した。図6に示すように、ヒトまたはウシ内皮細胞を良好な効率で導入した(〜50%)25 TU/セル(図6 EA.hy926およびBAEC)用。マウス肝細胞(Hepa 1-6)は、アデノウイルス粒子(5TU/細胞)の低い量で効率よくアデノウイルスによってトランスタイズされたが、死細胞(PI陽性細胞)の割合が高いためアデノウイルスにも感受性である(〜16%)他のセルの種類と比較して。間葉間質細胞は、特定のアデノウイルス受容体(未発表データ)がないため、トランスデュースが最も困難であった(図6)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> 図6:トランスデューセ細胞におけるアデノウイルスの感染性とGFP発現の誘導。ヒト内皮細胞(EA.hy926)、ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)、マウス肝細胞(Hepa 1-6)、及びマウス間葉間質細胞(MSC)を、アデノウイルスの所示量でトランスミタイズした。GFPは蛍光顕微鏡で検出し、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーによって決定されるPI陽性細胞は、ウイルス伝達によって決定される細胞死亡率を示す。EA.hy926細胞、ウシ大動脈内皮細胞、およびヘパ1-6細胞をアデノウイルスによって高度にトランステーションし、41〜52%の範囲のトランスダクションの収率を示した。MSCの場合、より多くのウイルス(250 TU/細胞)が、トランスデューセド細胞のGFP陽性の27%しか誘導しなかなかった。バー:100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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An Efficient Method for Adenovirus Production

ここでは、pAdEasyシステムを用いたアデノウイルス産生プロトコルを紹介する。この技術には、pAdTrackおよびpAdEasy-1プラスミドの組換え、アデノウイルスの包装および増幅、細胞リセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製、ウイルス滴定、およびアデノウイルスの機能試験が含まれる。

アデノウイルス産生のための効率的な方法

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

ルーマニアのブカレスト出身のニコラエ・シミオネスク細胞生物学・病理学研究所へようこそ。ここでは、ウイルス導入研究室で、Vogelstein教授が開発したAdEasyシステムに基づく最適化された方法論を用いて、アデノウイルス粒子産生の一部を示す。このアデノウイルスを産生する技術の主なステップは、1つは、BJ5183細菌中のpAdEasy-1プラスミドとGFPを含むpAdTrackの組換えである。2つは、アデノウイルス粒子を包み込む。3つは、AD293細胞におけるアデノウイルスの増幅である。4つは、細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。5、アデノウイルスのウイルス滴定および機能試験。ここでは、方法論の重要なステップを提示します。細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。アデノウイルスの精製は、ウイルス産生細胞および培地の採取から始まる。AD293細胞を組換えプラスミドにトランスフェクトし、アデノウイルスをパッケージ化した。次いで、アデノウイルスを、連続した大きな培養によって増幅した。ここで、25枚のT175プレートを得て、細胞ライセートと培養培地からアデノウイルスの精製を開始した。まず、トランスデューセ細胞で発現するGFPの緑色蛍光を確認した。細胞がまだ付着している場合は、培養皿をタップするか、長いスクレーパーを使用してそれらを取り外します。細胞および培地が収集される。フラスコはPBSで洗浄され、ファルコンチューブにも採取されます。細胞は遠心分離によってペレット化される。アデノウイルスをさらに精製するための培地と同様に、細胞ペレットを保管してください。このステップでは、同僚の助けは収穫プロセスを加速するために十分に高く評価される。GFPの発現により、細胞ペレットは緑色です。ペレットは、細胞の破壊を促進する高トニックトリスバッファーに再懸濁されます。細胞のリシスには液体窒素を使用し、乾燥ガスは37度まで温めます。ウイルスが損傷を受けるため、3 サイクル以上実行しないでください。細胞破壊の効率を高めるために、細胞を23ゲージの注射針を通して均質化する。細胞のリセートを9、600xgで12分間遠心分離する。新しいチューブに上清を渡し、ペレットを捨てます。超遠心分離機によるさらなる処理のために氷の上に上清を保ちます。そこで、培養培地を処理して、細胞から放出されたアデノウイルスを単離する。このために、まず、必要量の硫酸アンモニウムを加え、培養液を回収したボトルに添加します。ボトルは、結晶が完全に溶解するまで激しく揺れます。混合物を室温で2時間及び半分にインキュベートする。次いで沈殿物の懸濁液をファルコンチューブに分割する。遠心分離機は1,600xgで15分間用いた。遠心分離後、上清は廃棄され、ペレットは10ミリモルトリスバッファーに再懸濁される。超遠心分離工程でアデノウイルスの精製を継続できない場合、沈殿物は、4度で数日間保持することができるが、硫酸アンモニウムを除去するために透析後にのみ維持することができる。ここでは、透析のステップを発表しました。シリンジを使用して、以前に濡れたカセットに懸濁液を導入します。サンプルは、4度で一晩10ミリモルトリスバッファーに対して透析されます。精製の最終ステップは、塩化セシウム不連続勾配上の超遠心分離工程で表される。勾配を形成するために、まず、塩化セシウムの高密度溶液の3ミリリットルをピペット化する。この層の上に、低密度塩化セシウムの3ミリリットルを静かに注ぎます。細胞ライセートまたは培養培地からのアデノウイルス粒子懸濁液は、次いで、勾配の上に重ねられます。チューブはミネラルオイルで満たされ、SW41バケットに導入されています。平衡後、チューブは、超遠心分離機に導入されるローターに対称的にロードされます。遠心分離機は35,000 RPM、4度を故障なく18時間実行します。超遠心分離後、チューブはバンドを収穫するために後ろに黒い紙を置いてスタンドに置かれます。透明な上相および細胞の破片は、漂白液と廃容器に捨てる。完全なアデノウイルスを含む最も低いバンドはピペット先端で収穫され、生殖不能のエッペンドルフ管で集められる。透析後、スクロースはウイルス懸濁液に4%の最終濃度に添加され、ウイルスアリコートはマイナス80度で凍結し続ける。結果のセクションでは、得られたアデノウイルスを導入した細胞におけるGFP発現を示した。導入から48時間後、GFPは蛍光顕微鏡で示されるようにトランスデューセされた細胞によって発現される。GFP発現細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定される。ヒトおよびウシの内皮細胞の約50%が、細胞当たり25の導入単位で導入され、GFP陽性である。マウス肝細胞に対して同じ伝達収率が得られたのは、細胞当たり5つのトランスダクションユニットしか使用されなかったが、これは細胞感受性による死亡率の上昇と関連している。GFP発現に還元し、特定の受容体の発現が低いため間葉間質細胞の形質転換により得られた。結論的な発言。これらの手間のかかる技術を最適化して、アデノウイルス粒子の取得に必要な時間、コスト、および労力を削減します。調製されたアデノウイルスは、様々な細胞型に感染し、目的の遺伝子の発現を誘導することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

ナチュラル無細胞腸基質の産生のための脱細胞化の方法論

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

骨 - インプラントアンカレッジ評価するために改良された機械的試験方法

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

生産と一価量子ドットの標的

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

機能再生大腿骨につながるラットモデルにおける仮骨延長法のための効率的かつ再現可能なプロトコル

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

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ラットでの肝部分工学生体内での基盤として新しい手術手技

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

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体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...