Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
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이 사업은 2014-2020년 경쟁력 운영 프로그램(POC-A.1.1.1.1.4-E-2015)을 통해 유럽 지역 개발 기금에서 공동 자금을 조달한 프로젝트에 의해 지원되었습니다. ID: P_37_668; 약어 DIABETER), 루마니아 연구 혁신 PCCDI- UEFISCDI의 루마니아 어 부 교부, 프로젝트 번호 PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 PNCD III 내에서 루마니아 아카데미에 의해. 저자는 Kyriakos Kypreos (파트라스 대학, 그리스) 그의 관대하고 관련 조언, 오비디우 크루토루 (미술 대학, 부쿠레슈티, 루마니아) 촬영, 영화 편집 및 그래픽 디자인, 그리고 기술 지원을위한 미하엘라 브라투에게 감사드립니다.

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재조합 아데노바이러스는 유전자 전달 및발현(12,13,14)을위한 다목적 도구이다. 아데노바이러스 의 전염에 의한 강력한 단백질 발현을 유도하기 위해, 관심 있는 유전자의 인코딩 서열은 아데노바이러스의 게놈에 삽입된다. 버트 보겔슈타인의 실험실에서 개발된 AdEasy 아데노바이러스 시스템은 대부분의 야생형 아데노바이러스 혈청형 5게놈을 포함하는 백본 플라스미드(pAdEasy-1)와 유전자 복제2,10을위해 설계된 셔틀 벡터(pAdTrack)를 포함한다. 아데노바이러스 유전자 E1(전염하는 바이러스 입자의 조립에 대한 책임) 및 E3(숙주 면역 회피에 관여하는 인코딩 단백질)의 삭제는 6.5-7.5 kb의 관심 유전자를삽입할수 있는 아데노바이러스 게놈의 공간을 생성하였다. 이 크기는 많은 유전자에 대 한 충분 한, 특히 짧은 introns를 가진 사람들을 위해15,16,17. 또한 연구원이 트랜스진18,19,20의cDNA를 운반하는 아데노바이러스의 생산을보고하고있다. 그러나, 우리는 유전자 또는 미니 유전자를 운반하는 그들의 대응에 대해보다는 cDNA 운반 아데노바이러스에 대한 트랜스진 발현의 낮은 수율을 얻었다 (데이터는 표시되지 않음).
이전 방법2,10,14,18,21을개선하고 적응하고, 아데노바이러스 생산을 위한 기술은 더 짧은 시간, 낮은 비용 및 적은 노력이 필요합니다. 전신 아데노바이러스 DNA는 상동성 재조합경향이 있는 대장균 균주, BJ5183에서 셔틀 벡터와 pAdEasy-1 플라스미드 사이의 재결합에 의해 얻어진다. 이 프로토콜은 AdEasy-1 세포의 화학적 변형을 암시합니다 (pAdEasy-1을 포함하는 BJ5183 박테리아). 이 기술은 일부 실험실에서 사용할 수 없는 전기포레이터를 필요로 하지 않으며, 매우 간단하며, 재조합 수율을 증가시키며, 유능한 세포를 얻고 변환을 수행하는 데 필요한 시간을 줄입니다. PCR에 의해 수행 되는 재조합 클론의 사전 선택은 더 시간을 단축 하 고 전체 절차를 완화. 비슷한 절차는 Zhao와 동료에 의해 사용되었다(22,그러나, 프로토콜에서, 우리는 프라이머의 시퀀스를 최적화.
GFP-아데노바이러스 포장 및 증폭을 위해, HEK293 유도체 세포주, 즉 배양판에 더 부착된 AD293 세포가 사용되었다. 아데노바이러스 생산에 일반적으로 사용되는 다른 세포주들은 다음과 같습니다: 911, 293FT, pTG6559 (A549 유도체), PER. C6 (그녀의 파생 상품), GH329 (헬라 유도체), N52. E6, 및 HeLa-E123,24,25,26. 우리의 손에, 아데노 바이러스 생산에 아무 개선도 911 세포가 사용 되었을 때 얻어지지 않았다 (데이터는 표시 되지 않음). K2 시약을 이용한 재조합 플라스미드를 이용한 AD293 세포의 트랜스포메이션은 바이러스 포장 단계의 효율을 크게 높였다. 아데노바이러스 생산 후, 아데노바이러스의 최대 ~70%는 여전히 세포 내부에 있으며 3개의 동결 및 해동 사이클에 의해 방출된다. 그것은 아데노 바이러스를 파괴하기 때문에 사이클의 수를 증가하는 것은 적합하지 않습니다.
일상적인 아데노바이러스 생산 공정 전반에 걸쳐, 수많은 바이러스 성 입자가 세포 배양 배지에서 방출된다. 감염된 AD293 세포의 수확 중에 이 세포 배양 배지를 폐기하면 중요한 바이러스 손실이 발생할 수 있습니다. 우리는 샤겐과 동료가 황산암모늄(27)을 침전시킴으로써 세포 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자를정화하기 위해 기술한 프로토콜을 최적화하였다. 이러한 방법은 폴리에틸렌글리콜(28)을사용하는 방법에 비해 세포 배양 배지로부터 아데노바이러스 회수효율이 높다. 침전 된 아데노 바이러스는 초원심 분리에 의해 즉시 정제되거나 며칠 동안 냉장고에 보관해야하지만 투석 후에만 소금 과잉을 제거해야합니다. 투석없이 몇 시간 이상 침전을 유지하는 것은 바이러스에 해롭습니다.
1단에서 수행된 초원심심분리에 의한 아데노바이러스 입자의 정제는 아데노바이러스 재고의 조작을 감소시키고 연이은 초원심분리단계(14,29)를이용한 프로토콜과 비교하여 절차를 용이하게 한다. 정제 된 아데노 바이러스의 투석은 트랜스듀션에 더 영향을 미칠 수있는 염화물 세슘을 제거하는 데 필요합니다. 프로토콜에서, 우리는 MgCl을 포함하는 Tris 버퍼를 사용2 하지만 투석을 위한 자당 하지, 그것은 동결에 대 한 방부제로 그렇지 않으면 필요한 자당 한 양의 거 대 한 필요 하기 때문에. 따라서, 우리는 동결을 위해 준비 된 아데노 바이러스 주식에 직접 자당을 나중에 추가했습니다. 정제 된 아데노 바이러스의 빈번한 동결 및 해동을 피하기 위해, 아데노 바이러스 주식을 알리트및 -80 ° C에 저장하는 것이 좋습니다. 아데노바이러스 티터는 GFP 리포터 유전자와 특정 바이러스 희석을 위한 트랜스포메이션된 세포의 백분율을 고려한 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 이 방법은 고전적인 "플라크 분석"과 비교하여 더 빠르며 아데노바이러스 입자의 감염 용량을 밝히지 않는 캡시드 단백질(ELISA 또는 유량 세포측정과 같은 다양한 방법에 의한)의 평가와 비교하여 더 신뢰합니다. 그러나, ELISA 기반 정량화, Q-PCR 또는 플라크 분석시 시판 가능한 키트를 사용하는 대체 방법은 형광 추적자를 포함하지 않는 아데노바이러스의 적정에 특히 유용하다.
pAdTrack adenoviruses는 Coxsackievirus 및 Adenovirus 수용체 (CAR)에 의해 인식되는 인간 아데노바이러스 혈청형 5에서 파생된다는 것을 고려하여, 우리는 인간 기원의 세포 (내피 세포)를 트랜스듀싱하기 위해 GFP-아데노바이러스의 용량을 입증했지만, 또한 다른 기원의 세포인 소 (endothelial cells)와 메우린세포(자궁)와 메파시 세포(암피세포). 데이터는 GFP-아데노바이러스가 트랜스진의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있음을 보여주었다.
결론적으로, 우리는 아데노바이러스 입자를 얻는 데 필요한 시간, 비용 및 노력을 줄이기 위해 이 힘든 기술을 최적화했습니다. 준비된 아데노바이러스는 다양한 세포 유형을 감염시키고 관심 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 프로토콜은 아데노바이러스 매개 유전자 전달이 현대 유전자 치료법 개발을 위한 주요 도구 중 하나를 나타내기 때문에 다양한 실험에서 사용될 수 있다.
약어: AdV-GFP, 아데노바이러스 입자; BAEC, 소 대동맥 내피 세포; CsCl, 염화 세슘; GFP, 녹색 형광 단백질; MSC, 중간 기질 세포; TU, 변환 단위.

아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥선형 DNA 게놈1,2,3을포함하는 비봉투 바이러스이다. 아데노바이러스는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있으며 감염은 활성 숙주 세포 분열에 의존하지 않는다. 감염 후, 아데노 바이러스는 호스트 세포 핵에 게놈 DNA를 소개합니다, 어디 그것은 서사시 roromosomal 를 유지하고 호스트의 유전자와 함께 전사된다. 따라서, 삽입 돌연변이 발생 또는 온코진 조절에 대한 최소한의 잠재적 위험은4,5,6을달성한다. 아데노바이러스 게놈은 숙주 게놈과 함께 복제되지 않으므로 아데노바이러스 유전자는 세포 집단분할에서 희석된다. 아데노바이러스 전이의 장점 중에서도( i) 높은 수준의 트랜스진 발현이 있다. (ii) 주전 게놈으로 바이러스 DNA의 통합과 관련된 위험을 감소시켰다. (iii) 다양한 분할 및 비분할 세포 유형의 변환. 생물 의학 연구에 사용되는 대부분의 아데노바이러스는 E1영역7,8,9가부족한 비복제이다. 이들의 생산을 위해서는 E1 서열(예: HEK293)을 공급하는 세포선이 필요하다. 게다가, 바이러스 성 수명 주기(E3)에 대한 비필수 영역은 바이러스 게놈내의 트랜스진의 삽입을 허용하기 위해 삭제되었다; 다른 지역(E2 및 E4)은 일부 아데노바이러스에서 추가로 삭제되었지만, 이들 경우에는 아데노바이러스 생산의 감소수율과 트랜스진의 낮은 발현이7보고되었다.
여기서는 AdEasy 시스템을 사용하여 아데노바이러스를 구성, 포장 및 정화하기 위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 개선은 버트 보겔슈타인에 의해 개발 된 원래 방법과 비교하여 더 빠르고 경제적 인 방법으로 아데노 바이러스의 포장을 허용2,10,다음과 같은 장점으로 인해: (i) BJ5183 함유 pAdEasy-1 박테리아의 화학 적 변형에 의해; (ii) PCR에 의한 재조합 클론의 선택; (iii) Adenoviral 포장을 위한 K2 형질전환 시스템을 이용한 AD293 세포의 배설; (iv) 바이러스 포장 및 증폭 후 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 침전; (v) 1단계 염화(CsCl) 그라데이션 극심분리를 이용한 아데노바이러스 정제.
AdEasy시스템(도 1)을이용한 아데노바이러스 생산을 위한 프로토콜은 다음 단계를 포함한다.
(1) BJ5183 박테리아에서 pAdEasy-1과 pAdTrack-GFP의 재조합 (2) 아데노바이러스 입자의 포장 (3) 아데노바이러스 증폭 (4) 세포용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정화 (5) 아데노바이러스 적정.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> 그림 1: 아데노바이러스 생산 기술. 아데노바이러스 기술의 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) BJ5183 박테리아에서 pAdEasy-1 플라스미드와 pAdTrack-GFP의 재결합. 선택된 재결합 된 플라스미드는 DH5α 박테리아에서 증폭된 다음 정제됩니다. (2) AD293 세포에서 아데노바이러스 입자의 포장, 아데노-E1 단백질을 생산하는; (3) AD293 세포에서 아데노바이러스의 증폭; (4) CsCl 밀도 그라데이션에 대한 초원심심분리에 의한 세포 용해 및 배양 배지로부터의 아데노바이러스 입자의 정제; (5) 아데노바이러스및 기능성 테스트의 적정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 프로토콜에서, 우리는 숙주 세포에서 GFP의 발현을 유도할 수 있는 아데노바이러스의 생산을 위한 기술을 예시하였다. GFP는 이미 제2CMV 프로모터하에서 pAdTrack-CMV 셔틀 벡터(Addgene #16405)의 중추에 삽입되어 리포터유전자(도 1)로사용된다. 이러한 이유로, 여기에 우리는 pAdTrack-CMV 벡터를 pAdTrack-GFP로 지정하고 데모 목적으로 GFP의 표현을 평가했습니다. GFP 발현 외에, 시스템은 pAdTrack-CMV의 다중 복제 부위에서 복제될 수 있는 관심 유전자를 과발표현하는 데 사용될 수 있다. pAdTrack-CMV에서 복제된 유전자 또는 미니진은 cDNA11과비교하여 발현 유도를 위해 일반적으로 더 효율적입니다. 데이터는 다양한 소스 (인간, 소, 뮤린)에서 변환 된 세포 (간세포, 내피 세포와 같은)에서 강한 GFP 발현을 보였다. 아데노바이러스 매개 유전자 전달은 현대 유전자 치료법 개발을 위한 주요 도구 중 하나를 나타냅니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

아데노바이러스 전도는 다양한 세포 유형 및 장기로 관심 있는 유전자의 발현의 강력하고 일시적인 유도의 장점이 있다. 그러나, 재조합 adenoviral 기술은 힘들고, 시간이 많이 걸리며, 비쌉합니다. 여기서, 우리는 변환된 세포에서 강한 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 유도할 수 있는 정제된 아데노바이러스 입자를 얻기 위해 pAdEasy 시스템을 이용한 향상된 프로토콜을 제시한다. 이 개선 된 방법의 장점은 버트 보겔슈타인에 의해 개발 된 원래 방법에 비해 빠른 준비 및 감소 생산 비용입니다. 아데노바이러스 기술의 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) BJ5183 박테리아에서 pAdEasy-1 플라스미드와 pAdTrack-GFP의 재결합; (2) 아데노바이러스 입자의 포장; (3) AD293 세포에서 아데노바이러스의 증폭; (4) 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정제; 및 (5) 아데노바이러스의 바이러스 적정 및 기능적 테스트. 본래 의 방법에 대한 개선은 (i) 비대비5183 함유 pAdEasy-1에서 박테리아의 화학적 변형에 의한 재조합으로 구성된다. (ii) "네거티브" 및 "양수" PCR에 의한 재조합 클론의 선택; (iii) Adenoviral 포장을 위한 K2 형질전환 시스템을 이용한 AD293 세포의 배설; (iv) 세포 배양 배지에서 AD293 세포에 의해 방출된 바이러스 입자의 황산암모늄을 함유한 침전; 및 (v) 1단계 염화염화물에 의한 바이러스의 정제불방향 그라데이션 초원심분리. 관심 있는 유전자의 강한 발현(이 경우, GFP)은 다양한 소스(인간, 소, 뮤린)로부터 다른 유형의 트랜스포칭 된 세포 (간세포, 내피 세포 등)에서 수득되었다. 아데노바이러스 매개 유전자 전달은 현대 유전자 치료법 개발을 위한 주요 도구 중 하나를 나타냅니다.

우리는 더 빠르고 효율적인 아데노바이러스 생산을 달성하기 위해 원래 Vogelstein의 프로토콜을 수정하고 개선했습니다. 첫째, 재조합의 쉬운 선택을 달성하기 위해 방법론을 개정했습니다. 재조합 후, BJ5183 세균클은 "음의 PCR"에 의해 재조합의부재(도 3A)또는 "양양성 PCR"에 의해 GFP(도3B)에대한 당사의 사례에 동화되는 관심 유전자를 식별하는 지표로서 pAdTrack-GFP의 무결성을 평가하였다. "네거티브"와 "양수" PCR 모두에서, 우리는 pAdTrack 무결성(그림 3A,레인 1)에 대한 986 bp의 밴드와 GFP(그림 3B,레인 3)의 밴드를 준 제어 템플릿으로 pAdTrack-GFP를 사용했다. "음의 PCR"에 사용되는 프라이머는 pAdTrack-GFP에서 PmeI 사이트를 포함하는 986 bp의 조각을 증폭하도록 설계되었습니다. 이 DNA 단편은 재조합 후에 크게 확대되고 양성 재조합 클론에서 증폭되지 않습니다. pAdTrack-GFP가 그대로 유지되는 재결합을 위한 음의 클론은 도 3A,차선 3, 4 및 6로 표시됩니다. 재조합 부위에 인접한 DNA 서열에 대한 프라이머 막음. 잠재적 양성 재조합 클론(도3A,차선 2 및 5)은 도 3B,차선 1 및 2에 도시된 바와 같이 GFP를 발현하였다. 이러한 클론에서 플라스미드 DNA는 더 많은 양의 DNA를 얻기 위해 DH5α 변환을 위해 분리되고 사용되었다. DH5α에서 증폭된 이러한 미리 선택된 재조합 플라스미드는 효소 소화에 의해 시험되었다. 도 3C-E에서 힌드 III, PstI, BamHI 제한 효소(도3C, D, E 레인 2)로 소화된 하나의 재조합 양성 클론의 효소 소화 결과를 도시한다. 재조합 클론의 힌드III 및 PstI 소화 패턴은 힌드III와 PstI가 각각 24배와 25회 pAdEasy-1 플라스미드를 절단한 이후 pAdEasy-1을 위해 얻은 것과 유사하였다(그림3C및 D,레인 3); 힌드III는 한 번 절단하고 PstI는 pAdTrack-GFP 벡터의 4배를 잘라(그림 3C 및 D,레인 1). BamHI는 두 번 pAdEasy-1 벡터(그림 3C,레인 3) 및 한 번 pAdTrack-GFP(그림 3C,레인 1)를 잘라.
PacI는 재조합 플라스미드(도3F,레인 2)로부터 4.5kb의 조각을 잘라내고, pAdTrack-GFP(도3F,레인 1)로부터 2863bp의 단편을 잘라내고, pAdEasy-1벡터(도 3F,레인 3)를 선형화하였다. DNA 사다리는 차선 4에서 그림 3C-F로표시됩니다. 재조합 플라스미드는 AD293 트랜스페션에 대한 추가 사용을 위해 Pac I로 소화되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> 그림 3: pAdEasy-1 플라스미드와 pAdTrack-GFP의 재조합. pAdTrack-GFP 및 pAdEasy-1의 재결합 후 얻은 플라스미드는 pAdTrack-GFP 무결성(A)에 대한 "네거티브" PCR에 의해 테스트되었다. 비재조합 클론은 pAdTrack-GFP 플라스미드(A, 레인 3, 4 및 6)로부터 증폭된 서열에 대응하는 986bp 대역의 존재에 의해 입증되었다. 재조합(A, 차선 2 및 5)에 대해 잠재적으로 양성 클론도 수득하였다. pAdTrack-GFP 벡터를 템플릿으로 사용했을 때, pAdTrack-GFP(A, 레인 1)에 대해 986bp의 대역을 획득하였다. 잠재적으로 긍정적 인 재조합 클론은 "긍정적 인"PCR (B)에 의해 GFP 발현을 테스트했습니다. 264 bp의 밴드는 잠재적으로 재결합 된 클론 (B, 레인 1 및 2)뿐만 아니라 pAdTrack-GFP 플라스미드모두에 대해 나타납니다. 하나의 잠재적 재조합 클론에서 DNA는 힌드III, PstI, BamHI 및 PacI 제한 효소 (C-F, 차선 2)로 테스트되었다. 대조군에서, pAdEasy-1 벡터(C-F, 차선 3) 및 pAdTrack-GFP 플라스미드(C-F, 차선 1)는 동일한 효소로 소화되었다. DNA 사다리는 C-F 레인 4로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
아데노바이러스 포장 및 증폭은 AD293 세포에서 수행되었다. 아데노바이러스 입자(AdV-GFP)는 AD293 세포 용액뿐만 아니라 세포 배양 배지로부터 정제되었으며, 감염된 세포에 의해 방출되었다. 세포 배양 배지에서 발견되는 아데노바이러스를 농축하기 위해, 입자는 황산암모늄으로 침전된 다음 10m Tris HCl pH 8에서 2mM MgCl2로재중단되었으며, 이는 세포 용해에 사용되는 것과 동일한 완충제이다. 이어서, 세포용해및 배양배지로부터의 아데노바이러스 입자는 CsCl 불연속그라데이션 초원심분리에 의해 정제되었다. 초원심분리 후, 도 4에도시된 바와 같이 정제된 AdV-GFP의 강력한 대역을 얻었다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> 도 4: 불연속 CsCl 그라데이션에 대한 초원심분리에 의한 아데노바이러스 정제. 배지로부터 침전된 세포 균질및 아데노바이러스는 저밀도 CsCl 용액에 의해 형성된 불연속그라데이션에 대한 초원심분리를 실시하였다. GFP-아데노바이러스의 강력한 밴드는 두 경우 모두 입증되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1mL(TU/mL) 당 트랜스듀싱 단위로 발현된 바이러스 성 티터를 결정하기 위해 AD293 세포는 AdV-GFP의 직렬 희석에 감염되었다. 48 시간 후에, 감염된 세포는 바이러스성 현탁액의 희석 인자와 역 상관관계에서 GFP를 발현했습니다. 이는 형광 현미경 검사법에 의해 관찰되었고 GFP 양성 세포의 백분율은 유동 세포측정법(도5)에의해 결정되었다. 티터를 계산하기 위해, GFP 양성 세포의 5-20%를 유도한 바이러스 희석을 고려하였다(도5C). 보통, 우리는 GFP-아데노바이러스에 대한~10 10 (TU/mL)의 바이러스 성 티터를 얻습니다.
아래, 우리는 300000 세포 (C)가 1mL 아데노바이러스 용액 (V)으로 변환된 특정 아데노바이러스 적혈구 계산의 예를 제공하며, 6 % GFP 양성 세포 (F)를 얻은 106 (D)의 희석 계수에서:
티터 (TU / mL) = D x F / 100 x C / V = 106 x 6/100 x 300000 /1 = 1.8 x 1010 TU / mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> 그림 5: 아데노바이러스 티터의 평가. AD293 세포는 각종 아데노바이러스 희석제에 감염되었다. 48시간 후, 세포는 형광 현미경검사에 의해 관찰되었고, 다른 아데노바이러스 희석제(A-D)에 의해 유도된 GFP 양성 세포의 비율을 결정하기 위해 혈류 세포에 의해 분석되었다. 유동 세포측정을 위한 게이트를 확립하기 위해, 비유도세포도 분석하였다(E). 희석 계수(106)를 위해계산된 티터는, 세포의 6%가 GFP 양성이었을 때 1.8 x10 10 TU/mL이었다. 패널 A-E, 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
준비된 아데노바이러스의 전도 가능성을 테스트하기 위해 인간 내피 세포(EA.hy926), 소 대동맥 내피세포(BAEC), 뮤린 간세포(Hepa 1-6), 뮤린 중간기질 기질 세포(MSC)의 4개의 세포주를 사용하였다. 내피 세포 (EA.hy926 및 BAEC)는 25 TU /셀로 변환되었고, 간세포는 5 TU / 셀로 변환되었고 MSC는 250 TU /셀로 변환되었다.
여기서는 1.8 x 10 TU/mL을 이용한 아데노바이러스 현탁액을 사용하여 25TU/cell로 3 x 106 세포를 감염하는 데 필요한 아데노바이러스 현탁액의 부피가 어떻게 계산되었는지를 예로 들 수 있다.
1 셀 ........... 25 TU 3 x 106 셀 .......... x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x=75 x 106 TU 바이러스 성 재고가 포함되어 있는 경우 1.8 x 1010 TU ........... 1 mL 75 x 106 TU .......... y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y = 4.2 x 10-3 mL = 바이러스 성 재고의 4.2μL
전염 후 48시간, 세포는 형광 현미경 검사법에 의해 분석되었다. 도 6에도시된 바와 같이, 인간 또는 소 내피 세포는 좋은 효율(~50%)으로 변형되었다. 25 TU/셀(그림6 EA.hy926 및 BAEC). 뮤린 간세포(Hepa 1-6)는 아데노바이러스 입자(5TU/cell)의 낮은 양으로 아데노바이러스에 의해 효율적으로 전이되었지만, 죽은 세포(PI 양성 세포)의 높은 비율이 기록되었기 때문에 아데노바이러스에 민감하게 반응하였다(~16%) 다른 세포 유형에 비해. 중간엽 기질 세포는 특정 아데노바이러스 수용체(미공개 데이터)의 부족으로 인해 트랜스듀스(도6)가가장 어려웠다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> 도 6: 유도된 세포에서 아데노바이러스의 감염성 및 GFP 발현의 유도. 인간 내피 세포(EA.hy926), 소 대동맥 내피 세포(BAEC), 뮤린 간세포(Hepa 1-6), 및 뮤린 중간엽 기질 세포(MSC)는 아데노바이러스의 표시량으로 전이되었다. GFP는 형광 현미경 검사법에 의해 검출되었고 GFP 양성 세포의 백분율은 혈류 세포측정에 의해 분석되었다. 유동 세포측정에 의해 결정된 PI 양성 세포는 바이러스 성 형 질과형에 의해 결정된 세포 사망률을 보여줍니다. EA.hy926 세포, 소 대동맥 내피 세포 및 Hepa 1-6 세포는 아데노바이러스에 의해 높게 변형되었고, 41내지 52%에 이르는 트랜스듀션의 수율은 높았다. MSC의 경우, 더 높은 양의 바이러스(250 TU/cells)가 유도된 세포의 27% GFP 양성만 유도하였다. 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

여기서, 우리는 pAdEasy 시스템을 사용하여 아데노바이러스 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 pAdTrack 및 pAdEasy-1 플라스미드의 재조합, 아데노바이러스 포장 및 증폭, 세포 용해 및 배양 배지에서 아데노바이러스 입자의 정제, 바이러스 적정, 아데노바이러스의 기능적 테스트를 포함한다.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

루마니아 부쿠레슈티에서 세포 생물학 및 병리학 연구소, 니콜라 시미오네스쿠에 오신 것을 환영합니다. 여기에 바이러스 성 트랜스 유도 실험실에서, 우리는 교수 Vogelstein에 의해 개발 된 AdEasy 시스템을 기반으로 최적화 된 방법론을 사용하여 아데노 바이러스 입자 생산의 일부를 보여줍니다. 이 아데노바이러스를 제조하기 위한 기술의 주요 단계는, 하나, BJ5183 박테리아에서 pAdEasy-1 플라스미드와 GFP를 포함하는 pAdTrack의 재조합이다.둘째, 아데노바이러스 입자를 포장합니다. 3, AD293 세포에서 아데노 바이러스의 증폭. 4, 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정제.아데노바이러스의 5가지, 바이러스 성적 및 기능성 테스트. 여기서 우리는 방법론의 중요한 단계를 제시할 것입니다. 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정제.아데노바이러스의 정제는 바이러스 생성 세포와 배지를 수확하는 것으로 시작됩니다. AD293 세포는 재조합 플라스미드로 전감염되었고 아데노바이러스가 포장됨에 따라. 그런 다음 아데노 바이러스는 연속적인 더 큰 문화에 의해 증폭되었다.여기서, 우리는 25 T175 플레이트를 획득하고, 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스의 정화를 시작했다. 먼저, 우리는 변환된 세포에 의해 발현된 GFP의 녹색 형광을 검사했습니다. 세포가 여전히 부착되어 있는 경우, 우리는 배양 접시를 두드리거나 긴 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다.세포와 배지는 수집된다. 플라스크는 팔콘 튜브에서 수집되는 PBS로 세척됩니다. 세포는 원심분리에 의해 펠릿화됩니다.아데노 바이러스의 추가 정화를 위한 매체뿐만 아니라 세포 펠릿을 보관하십시오. 이 단계에서, 동료의 도움은 수확 과정을 가속화하기 위해 잘 평가된다. 세포 펠릿은 GFP 발현으로 인해 녹색입니다.펠릿은 세포의 중단을 용이하게 할 초토닉 Tris 버퍼에서 다시 중단됩니다. 세포 용해의 경우 액체 질소와 최대 37도까지 예열된 건조 가스를 사용합니다. 바이러스가 손상될 것이기 때문에 3 주기 이상을 수행하지 마십시오.세포 중단의 효율을 높이기 위해 23 게이지 주사기 바늘을 통해 세포를 균질화하여 조심스럽게 전달한다. 원심 분리는 12 분 동안 9, 600 x g에서 셀 용액을 분리합니다. 새로운 튜브에 상체를 전달하고 펠릿을 폐기합니다.초원심분리기로 추가 처리를 위해 얼음 위에 상체를 보관하십시오. 지금, 우리는 세포에서 풀어 놓인 아데노바이러스를 격리하기 위하여 배양 배지를 처리합니다. 이를 위해, 먼저, 필요한 양의 황산암모늄에 무게를 두고 배양 배지가 수집된 병에 첨가합니다.병은 결정이 완전히 녹을 때까지 격렬하게 흔들립니다. 혼합물은 2 시간 반 동안 실온에서 배양됩니다. 그런 다음 침전물의 현탁액은 팔콘 튜브로 나뉩니다.원심 분리기는 1, 600 x g에서 15 분 동안. 원심분리 후, 상체는 폐기되고 펠릿은 10 밀리머 트리 버퍼로 재장매된다. 극심분리 단계로 아데노바이러스의 정화를 계속할 수 없는 경우, 침전은 4도에서 며칠 동안 보관될 수 있지만 투석 후에야 황산암모늄을 제거한다.여기, 우리는 투석 단계를 제시했다. 우리는 이전에 젖은 카세트에 서스펜션을 소개하기 위해 주사기를 사용합니다. 샘플은 4도에서 하룻밤 사이에 10 밀리머 트리스 버퍼에 대해 투석됩니다.정화의 마지막 단계는 염화물 불연속 그라데이션에 대한 초원심분리 단계에 의해 표현된다. 그라데이션을 형성하기 위해 먼저, 염화물 세슘의 고밀도 용액의 3 밀리리터를 피펫합니다. 이 층 위에, 부드럽게 저밀도 세슘 염화제의 세 밀리리터를 부어.세포 리세이트 또는 배양 배지에서 아데노바이러스 입자 현탁액은 그라데이션 위에 오버레이됩니다. 튜브는 미네랄 오일로 채워져 있으며 SW41 버킷에 도입됩니다. 평형 후, 튜브는 초원심분리기에서 도입되는 로터에 대칭적으로 적재됩니다.원심분리기는 35도, 000RPM, 4도를 18시간 동안 쉬지 않고 실행합니다. 초원심분리 후, 튜브는 밴드를 수확하기 위해 뒤에 검은 종이가있는 스탠드에 배치됩니다. 투명한 상층과 세포 파편은 표백용폐기물 용기에 버려져 있습니다.완전한 아데노바이러스를 포함하는 가장 낮은 밴드는 파이펫 끝으로 수확되어 멸균 된 Eppendorf 튜브에서 수집됩니다. 투석 후, 자당은 바이러스 현탁액에 4%의 최종 농도로 첨가되고 바이러스 성 알리쿼트는 영하 80도에서 동결유지됩니다. 결과 섹션에서, 우리는 얻어진 아데노바이러스로 변환된 세포에서 GFP 발현을 보여주었다.48 시간 전도 후, GFP는 형광 현미경 검사법에 의해 도시된 바와 같이 전이 된 세포에 의해 발현된다. GFP 발현 세포의 백분율은 유동 세포측정에 의해 결정됩니다. 세포당 25개의 트랜스듀션 단위로 변환된 인간 및 소 내피 세포의 약 50%는 GFP 양성이다.동일한 트랜스듀션 수율은 소명 간세포에 대해 수득하였고, 셀당 5개의 트랜스듀션 유닛만 사용되었지만, 이는 세포 민감성으로 인한 사망률이 높은 것과 관련이 있다. GFP 발현으로 감소된 것은 특정 수용체의 낮은 발현으로 인한 중간엽 기질 세포의 전이에 의해 얻어졌다. 결론적인 발언.우리는 아데노바이러스 입자를 얻는 데 필요한 시간, 비용 및 노력을 줄이기 위해 이러한 힘든 기술을 최적화합니다. 준비된 아데노바이러스는 다양한 세포 유형을 감염시키고 관심 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

연구

생체공학

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

뼈 이식 앵커리지 평가하는 향상된 기계적 시험 방법

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

생산 및 일가 양자점 타겟팅

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

주의 골 기능 재생성 된 대 퇴 골으로 이어지는 쥐 모델에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...