Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
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Este trabalho foi apoiado por um Projeto co-financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional através do Programa Operacional de Competitividade 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; sigla DIABETER), uma bolsa do Ministério romeno de Pesquisa e Inovação PCCDI- UEFISCDI, Projeto número PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 dentro do PNCD III e pela Academia Romena. Os autores agradecem a Kyriakos Kypreos (Universidade de Patras, Grécia) por seus conselhos generosos e relevantes, Ovidiu Croitoru (Universidade de Belas Artes, Bucareste, Romênia) por filmagens, edição de filmes e design gráfico, e Mihaela Bratu por assistência técnica.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Adenovírus recombinantes são uma ferramenta versátil para entrega e expressão genética12,13,14. Para induzir forte expressão proteica por transdução adenoviral, a sequência de codificação do gene de interesse é inserida no genoma do adenovírus. O sistema adenoviral AdEasy, desenvolvido no laboratório de Bert Vogelstein, compreende um plasmídeo de espinha dorsal (pAdEasy-1) contendo a maior parte do genoma do sorotipo 5 do adenovírus selvagem, e um vetor (pAdTrack), projetado para clonagem genética2,10. A exclusão dos genes adenovirais E1 (responsável pela montagem de partículas infecciosas do vírus) e E3 (proteínas de codificação envolvidas na evasão da imunidade hospedeira) criaram um espaço no genoma adenoviral, no qual um gene de interesse de 6,5-7,5 kb pode ser inserido2,3. Este tamanho é suficiente para muitos genes, especialmente para aqueles com introns mais curtos15,16,17. Há também pesquisadores relatando a produção de adenovírus portadores do CDNA de um transgene18,19,20. No entanto, obtivemos um menor rendimento de expressão transgênica para adenovírus portadores de cDNA do que para seus homólogos carregando um gene ou um mini-gene (dados não mostrados).
Melhorar e adaptar os métodos anteriores2,10,14,18,21, a tecnologia para a produção adenoviral requer um menor tempo, menor custo e menos esforço. O DNA adenoviral de comprimento completo é obtido por recombinação entre o vetor da nave auxiliar e o plasmídeo pAdEasy-1 na recombinação homóloga propensa a tensão E. coli, BJ5183. O protocolo implica a transformação química das células AdEasier-1 (bactérias BJ5183 contendo pAdEasy-1). Essa técnica não requer um eletroporador que pode não estar disponível em alguns laboratórios, é muito simples, aumenta o rendimento de recombinação, e reduz o tempo necessário para obter células competentes e realizar a transformação. A pré-seleção de clones recombinantes realizados pelo PCR diminui ainda mais o tempo e facilita todo o procedimento. Um procedimento semelhante foi usado por Zhao e colegas de trabalho22, no entanto, no protocolo, otimizamos as sequências dos primers.
Para a embalagem e amplificação do GFP-adenovírus, foi utilizada uma linha de células derivadas HEK293, ou seja, células AD293, que são mais aderentes à placa de cultura. Outras linhas celulares comumente utilizadas para produção adenoviral são as seguintes: 911, 293FT, pTG6559 (derivado A549), PER. C6 (derivado her), GH329 (derivado HeLa), N52. E6, e HeLa-E123,24,25,26. Em nossas mãos, não houve melhora na produção adenoviral quando foram utilizadas 911 células (dados não apresentados). A transfecção de células AD293 com o plasmídeo recombinante usando reagente K2 aumentou muito a eficiência da etapa de embalagem viral. Após a produção de adenovírus, até ~70% do adenovírus ainda está dentro das células e é liberado por três ciclos de congelamento e descongelamento. Aumentar o número de ciclos não é adequado porque destrói o adenovírus.
Ao longo do processo de produção adenoviral rotineiro, inúmeras partículas virais são liberadas no meio da cultura celular. Descartar esse meio de cultura celular durante a colheita das células AD293 infectadas resultaria em uma importante perda viral. Otimizamos o protocolo descrito por Schagen e colegas de trabalho para purificar as partículas adenovirais do meio de cultura celular por precipitação com sulfato de amônio27. Este método tem maior eficiência na recuperação do adenovírus do meio de cultura celular em comparação com o método que utiliza polietilenoglicol 28. O adenovírus precipitado deve ser purificado imediatamente por ultracentrifugação ou mantido na geladeira por alguns dias, mas somente após a diálise, para remover o excesso de sal. Manter o precipitado por mais de algumas horas sem diálise é prejudicial ao vírus.
A purificação das partículas adenovirais por ultracentrifugação realizada em uma etapa reduz a manipulação do estoque adenoviral e facilita o procedimento em comparação com os protocolos usando sucessivas etapas de ultracentrifugação14,29. A diálise do adenovírus purificado é necessária para remover cloreto de césio que pode afetar ainda mais a transdução. No protocolo, utilizamos tampão Tris contendo MgCl2, mas não sacarose para diálise, uma vez que requer uma enorme quantidade injustificada de sacarose que é necessária de outra forma como um conservante para congelamento. Assim, adicionamos sacarose mais tarde, diretamente nos estoques adenovirais preparados para o congelamento. Para evitar o congelamento frequente e o descongelamento do adenovírus purificado, é aconselhável aliquotar os estoques adenovirais e armazená-los a -80 °C. O título adenoviral foi avaliado pela citometria de fluxo considerando o gene repórter do GFP e a porcentagem de células transduzidas para uma diluição viral específica. Este método é mais rápido em comparação com o clássico "ensaio de placa" e é mais confiável em comparação com a avaliação das proteínas capsíides (por vários métodos como ELISA ou citometria de fluxo) que não revela a capacidade de infecção das partículas adenovirais. No entanto, a quantificação baseada em ELISA, Q-PCR ou ensaio de placa usando kits disponíveis comercialmente são métodos alternativos, especialmente úteis para a titulação de adenovírus que não contêm um rastreador fluorescente.
Considerando que os adenovírus pAdTrack são derivados do sorotipo 5 de adenovírus humanos que é reconhecido pelos Receptores de Coxsackievirus e Adenovirus (CAR), demonstramos a capacidade do GFP-adenovirus para transduzir células de origem humana (células endoteliais), mas também células de outras origens: bovinos (células endoteliais) e murina (células estrômicas mesenquimais e hepatócitos). Os dados mostraram que o GFP-adenovírus pode induzir um alto nível de expressão de um transgene.
Em conclusão, otimizamos essa tecnologia laboriosa para reduzir o tempo, os custos e o esforço necessário para obter as partículas adenovirais. O adenovírus preparado é capaz de infectar vários tipos de células e induzir a expressão do gene de interesse. Este protocolo pode ser usado em uma variedade de experimentos, uma vez que a transferência genética mediada por adenoviral representa uma das principais ferramentas para o desenvolvimento de terapias genéticas modernas.
ABREVIATURAS: AdV-GFP, partículas adenovirais; BAEC, células endoteliais aórticas bovinas; CsCL, cloreto de césio; GFP, proteína fluorescente verde; MSC, células estromais mesenquimais; TU, unidades transdutoras.

Os adenovírus são vírus não desenvolvidos contendo um nucleocapsídeo e um genoma de DNA linear de dupla cadeia1,2,3. Os adenovírus podem infectar uma ampla gama de tipos de células e a infecção não depende da divisão ativa de células hospedeiras. Após a infecção, o adenovírus introduz seu DNA genômico no núcleo celular hospedeiro, onde permanece epicosomal e é transcrito junto com os genes do hospedeiro. Assim, é atingido um risco potencial mínimo para a mutagênese insercional ou regulação oncogênica4,5,6. O genoma adenoviral não é replicado junto com o genoma hospedeiro e, portanto, os genes adenovirais são diluídos em uma população celular divisória. Entre as vantagens da transdução adenoviral, há: (i) altos níveis de expressão transgênica; (ii) redução dos riscos relacionados à integração do DNA viral no genoma hospedeiro, devido à expressão epissomal; (iii) transdução de uma grande variedade de tipos celulares divisórias e não-divisórias. A maioria dos adenovírus utilizados em pesquisas biomédicas são não replicativos, sem a região E17,8,9. Para sua produção, é necessária uma linha celular que forneça a sequência E1 (como HEK293). Além disso, uma região não essencial para o ciclo de vida viral (E3) foi suprimida para permitir a inserção de um transgene no genoma viral; outras regiões (E2 e E4) foram ainda suprimidas em alguns adenovírus, mas nesses casos, foram relatados7.
Aqui, apresentamos um protocolo aprimorado para construir, empacotar e purificar os adenovírus usando o Sistema AdEasy. Essas melhorias permitiram a embalagem do adenovírus de forma mais rápida e econômica em comparação com o método original desenvolvido por Bert Vogelstein2,10, devido às seguintes vantagens: (i) a recombinação em BJ5183-contendo pAdEasy-1 pela transformação química de bactérias; (ii) a seleção dos clones recombinantes por PCR; (iii) a transfecção de células AD293 utilizando o sistema de transfecção K2 para embalagem adenoviral; (iv) a precipitação de partículas adenovirais do meio de cultura após embalagem e amplificação virais; v A purificação adenoviral utilizando ultracentrifugação de cloreto de césio de uma etapa (CsCl).
O protocolo para a produção de adenovírus utilizando o sistema AdEasy (Figura 1) compreende as seguintes etapas:
(1) Recombinação do pAdTrack-GFP com pAdEasy-1 em bactérias BJ5183 (2) Embalagem das partículas adenovirais (3) Amplificação do adenovírus (4) Purificação das partículas adenovirais do meio de lise celular e cultura (5) Titulação do Adenovírus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> Figura 1: A tecnologia de produção de adenovírus. Os principais passos da tecnologia adenoviral são: (1) A recombinação do pAdTrack-GFP com o plasmídeo pAdEasy-1 na bactéria BJ5183. Os plasmídeos recombinados selecionados são amplificados em bactérias DH5α e, em seguida, purificados; (2) A embalagem das partículas adenovirais em células AD293, que produzem proteínas adeno-E1; (3) A amplificação do adenovírus em células AD293; (4) A purificação das partículas adenovirais do lisecelular e do meio de cultura por ultracentrifugação em um gradiente de densidade CsCl; (5) A titulação do adenovírus e dos testes funcionais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Neste protocolo, exemplificamos a tecnologia para a produção do adenovírus, que pode induzir a expressão de GFP nas células hospedeiras. O GFP já está inserido na espinha dorsal do vetor de transporte pAdTrack-CMV (Addgene #16405), sob um segundo promotor cmv e é usado como um gene repórter(Figura 1). Por essa razão, aqui designamos o vetor pAdTrack-CMV como pAdTrack-GFP e avaliamos a expressão do GFP para fins demonstrativos. Além da expressão GFP, o sistema pode ser usado para superexpressar um gene de interesse, que pode ser clonado nos vários locais de clonagem do pAdTrack-CMV. Um gene ou um minigene clonado no pAdTrack-CMV geralmente é mais eficiente para indução de expressão em comparação com o cDNA11. Os dados mostraram uma forte expressão de GFP em células transduzidas (como hepatócitos, células endoteliais) de várias fontes (humana, bovina, murina). A transferência genética mediada por adenoviral representa uma das principais ferramentas para o desenvolvimento de terapias genéticas modernas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

A transdução adenoviral tem a vantagem de uma forte e transitória indução da expressão do gene de interesse em uma ampla variedade de tipos e órgãos celulares. No entanto, a tecnologia adenoviral recombinante é trabalhosa, demorada e cara. Aqui, apresentamos um protocolo aprimorado usando o sistema pAdEasy para obter partículas adenovirais purificadas que podem induzir uma forte expressão de proteína fluorescente verde (GFP) em células transduzidas. As vantagens deste método melhorado são a preparação mais rápida e a diminuição do custo de produção em comparação com o método original desenvolvido por Bert Vogelstein. Os principais passos da tecnologia adenoviral são: (1) a recombinação do pAdTrack-GFP com o plasmídeo pAdEasy-1 na bactéria BJ5183; (2) a embalagem das partículas adenovirais; (3) a amplificação do adenovírus em células AD293; (4) a purificação das partículas adenovirais a partir do liseto celular e do meio da cultura; e (5) a titulação viral e testes funcionais do adenovírus. As melhorias no método original consistem em (i) a recombinação em BJ5183-contendo pAdEasy-1 por transformação química de bactérias; (ii) a seleção de clones recombinantes por PCR "negativo" e "positivo"; (iii) a transfecção de células AD293 utilizando o sistema de transfecção K2 para embalagem adenoviral; (iv) a precipitação com sulfato de amônio das partículas virais liberadas pelas células AD293 em meio de cultura celular; e (v) a purificação do vírus por ultracentrifugação de cloreto de césio de uma etapa. Uma forte expressão do gene de interesse (neste caso, GFP) foi obtida em diferentes tipos de células transduzidas (como hepatócitos, células endoteliais) de várias fontes (humana, bovina, murina). A transferência genética mediada por adenoviral representa uma das principais ferramentas para o desenvolvimento de terapias genéticas modernas.

Modificamos e melhoramos o protocolo original de Vogelstein, a fim de alcançar uma produção de adenovírus mais rápida e eficiente. Primeiro, revisamos a metodologia para obter uma seleção mais fácil de recombinantes. Após a recombinação, os clones bacterianos BJ5183 foram testados por "PCR negativo" para avaliar a integridade do pAdTrack-GFP como um indicador da falta de recombinação(Figura 3A), ou por "PCR positivo" para identificar o gene de interesse, assimilado em nosso caso ao GFP(Figura 3B). Tanto em PCRs "negativos" quanto "positivos", usamos pAdTrack-GFP como modelo de controle, o que deu uma banda de 986 bp para integridade pAdTrack(Figura 3A, faixa 1), e uma banda de 264 bp para GFP(Figura 3B, faixa 3). Os primers usados para o "PCR negativo" foram projetados para amplificar um fragmento de 986 bp contendo o site pmeI em pAdTrack-GFP. Este fragmento de DNA é drasticamente aumentado após a recombinação e não é amplificado nos clones recombinantes positivos. Clones negativos para recombinação, nos quais o pAdTrack-GFP permaneceu intacto, estão representados nas Figuras 3A, faixas 3, 4 e 6. Os primers se acotoram nas sequências de DNA adjacentes ao local de recombinação. Potenciais clones recombinantes positivos(Figura 3A, faixas 2 e 5) expressaram GFP como mostrado nas Figuras 3B,faixa 1 e 2. O DNA plasmídeo desses clones foi isolado e usado para a transformação de DH5α para obter uma maior quantidade de DNA. Estes plasmídeos recombinantes pré-selecionados amplificados em DH5α foram então testados por digestão enzimática. Na Figura 3C-E são ilustrados os resultados da digestão enzimática de um clone recombinante-positivo digerido com enzimas hind III, PstI, restrição bamHI(Figura 3C, D, E pista 2). Os padrões de digestão hindiii e PstI do clone recombinante foram semelhantes aos obtidos para pAdEasy-1 desde que hindiII e PstI cortaram o pAdEasy-1 plasmídeo 24 e 25 vezes, respectivamente, (Figura 3C e D, pista 3); HindIII cortou uma vez e PstI cortou quatro vezes o vetor pAdTrack-GFP(Figura 3C e D, faixa 1). BamHI cortou duas vezes o vetor pAdEasy-1(Figura 3C, faixa 3) e uma vez pAdTrack-GFP(Figura 3C, faixa 1).
O PACI cortou um fragmento de 4,5 kb do plasmídeo recombinante(Figura 3F, faixa 2), um fragmento de 2863 bp de pAdTrack-GFP(Figura 3F, faixa 1), e linearizou o vetor pAdEasy-1(Figura 3F, faixa 3). A escada de DNA está representada na Figura 3C-F,nas faixas 4. O plasmídeo recombinante foi digerido com Pac I para uso posterior para transfecção AD293.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> Figura 3: A recombinação do pAdTrack-GFP com o plasmídeo pAdEasy-1. Os plasmídeos obtidos após a recombinação do pAdTrack-GFP e pAdEasy-1 foram testados por PCR "negativo" para a integridade pAdTrack-GFP (A). Os clones não recombinantes foram evidenciados pela presença de uma banda de 986 bp correspondente à sequência amplificada do plasmídeo pAdTrack-GFP (A, faixas 3, 4 e 6). Os clones potencialmente positivos para recombinação (A, faixas 2 e 5) também foram obtidos. Quando o vetor pAdTrack-GFP foi usado como modelo, uma faixa de 986 bp para pAdTrack-GFP (A, pista 1) foi obtida. Os clones recombinantes potencialmente positivos foram testados para a expressão GFP por PCR "positivo" (B); uma faixa de 264 bp aparece tanto para clones potencialmente recombinados (B, lane 1 e 2), bem como para o plasmídeo pAdTrack-GFP. O DNA de um potencial clone recombinante foi testado com enzima de restrição hindiii, PstI, BamHI e PacI (C-F, faixas 2). Nos controles, o vetor pAdEasy-1 (C-F, faixas 3) e o plasmídeo pAdTrack-GFP (C-F, faixas 1) foram digeridos com as mesmas enzimas. A escada de DNA está representada na faixa C-F 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As embalagens adenovirais e a amplificação foram realizadas em células AD293. As partículas adenovirais (AdV-GFP) foram purificadas do liseato celular AD293, bem como do meio de cultura celular, onde foram liberadas pelas células infectadas. Para concentrar o adenovírus encontrado no meio de cultura celular, as partículas foram precipitadas com sulfato de amônio e depois resuspended em 10 mM Tris HCl pH 8 com 2 mM MgCl2, o mesmo tampão usado para a lise celular. Posteriormente, as partículas adenovirais do lisecelular e do meio de cultura foram purificadas pela ultracentrifugação de gradiente de CsCl. Após a ultracentrifugação, obteve-se uma forte faixa de AdV-GFP purificada, como mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> Figura 4: A purificação adenoviral por ultracentrifugação em um gradiente de CsCl descontínuo. A célula homogenetada e o adenovírus precipitado do meio foram submetidos à ultracentrifugação em um gradiente descontínuo formado por soluções CsCl de baixa e alta densidade. Fortes bandas de Adenovírus GFP foram evidenciadas em ambos os casos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para determinar o título viral expresso em unidades transdutoras por um mL (TU/mL), as células AD293 foram infectadas com diluições seriais do AdV-GFP. Após 48 horas, as células infectadas expressaram GFP, em correlação inversa com o fator de diluição da suspensão viral. Isso foi observado pela microscopia de fluorescência e o percentual de células GFP positivos foi determinado pela citometria de fluxo(Figura 5). Para calcular o título, considerou-se a diluição viral que induziu 5 - 20% das células GFP-positivas(Figura 5C). Normalmente, obtemos um título viral de ~1010 (TU/mL) para GFP-adenovírus.
Abaixo, fornecemos um exemplo de cálculo de titânulo adenoviral para um lote adenoviral específico no qual 3000000 células (C) foram transduzidas com solução adenoviral de 1 mL (V), em um fator de diluição de10 6 (D), para o qual 6% foram obtidas células GFP-positivas (F):
Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> Figura 5: A avaliação do título adenoviral. As células AD293 foram infectadas com várias diluições adenovirais. Quarenta e oito horas depois, as células foram observadas por microscopia de fluorescência e analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células positivas de GFP induzidas por diferentes diluições adenovirais (A-D). Para estabelecer o portão para citometria de fluxo, também foram analisadas células não transduzidas (E). O título calculado para o fator de diluição 106, quando 6% das células eram GFP positivas foi 1,8 x 1010 TU/mL. Para painéis A-E, barras: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para testar o potencial de transdução do adenovírus preparado, foram utilizadas quatro linhas celulares: células endoteliais humanas (EA.hy926), células endoteliais aórticas bovinas (BAEC), hepatocitos murinas (Hepa 1-6) e células estrômicas mesenquimais murinas (MSC). As células endoteliais (EA.hy926 e BAEC) foram transduzidas com 25 TU/células, os hepatócitos foram transduzidos com 5 TU/célula e MSC foram transduzidos com 250 TU/cell.
Aqui está um exemplo de como o volume de suspensão adenoviral necessário para infectar 3 x 106 células com 25 TU/célula, utilizando a suspensão adenoviral com 1,8 x 1010 TU/mL, foi calculado.
Para 1 célula ................. 25 TU 3 x 106 células .............. x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x=75 x 106 TU Se o estoque viral contiver 1.8 x 1010 TU .............. 1 mL 75 x 106 TU ........... y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y= 4,2 x 10-3 mL = 4,2μL de estoque viral
Quarenta e oito horas após a transdução, as células foram analisadas por microscopia de fluorescência. Como mostrado na Figura 6, as células endoteliais humanas ou bovinas foram transduzidas com boa eficiência (~50%) para 25 TU/cell (Figura 6 EA.hy926 e BAEC). Hepatócitos murinos (Hepa 1-6) foram eficientemente transduzidos pelo adenovírus a uma baixa quantidade de partículas de adenovírus (5 TU/célula), mas também são sensíveis ao adenovírus, uma vez que uma maior porcentagem de células mortas (células pi-positivas) foi registrada (~16%) em comparação com os outros tipos de células. As células estromais mesenquimais foram as mais difíceis de transduzir (Figura 6),devido à falta de receptores adenovirais específicos (dados inéditos).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> Figura 6: A infectividade do adenovírus e a indução da expressão GFP em células transduzidas. As células endoteliais humanas (EA.hy926), as células endoteliais aórticas bovinas (BAEC), os hepatócitos murinas (Hepa 1-6) e as células estrânicas mesenquimais (MSC) foram transduzidas com a quantidade indicada de adenovírus. O GFP foi detectado por microscopia de fluorescência e a porcentagem das células positivas do GFP foi analisada por citometria de fluxo. Células pi-positivas determinadas pela citometria de fluxo mostram a mortalidade celular determinada pela transdução viral. As células eA.hy926, as células endoteliais aórticas bovinas e as células Hepa 1-6 foram altamente transduzidas pelo adenovírus, o rendimento da transdução variando de 41 a 52%. Para o MSC, uma maior quantidade de vírus (250 TU/células) induziu apenas 27% de GFP positivo das células transduzidas. Barras: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An Efficient Method for Adenovirus Production

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção de adenovírus usando o sistema pAdEasy. A tecnologia inclui a recombinação dos plasmídeos pAdEasy-1, a embalagem e amplificação do adenovírus, a purificação das partículas adenovirais do meio de cultura e lise celular, a titulação viral e o teste funcional do adenovírus.

Um método eficiente para a produção de adenovírus

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Bem-vindo ao Instituto de Biologia Celular e Patologia, Nicolae Simionescu de Bucareste, Romênia. Aqui no Laboratório de Transdução Viral, mostramos uma parte da produção de partículas adenovirais utilizando uma metodologia otimizada baseada no sistema AdEasy desenvolvido pelo Professor Vogelstein. Os principais passos da tecnologia para a produção deste adenovírus são, um, uma recombinação do pAdTrack contendo GFP com o plasmídeo pAdEasy-1 na bactéria BJ5183.Dois, embalando as partículas adenovirais. Três, amplificação do adenovírus em células AD293. Quatro, purificação das partículas adenovirais do meio de lise celular e cultura.Cinco, titulação viral e teste funcional do adenovírus. Aqui, apresentaremos um passo importante da metodologia. A purificação das partículas adenovirais do meio de lise celular e cultura.A purificação do adenovírus começa com a colheita das células produtoras de vírus e do meio. As células AD293 foram transfectadas com o plasmídeo recombinante e como o adenovírus foi embalado. Em seguida, o adenovírus foi amplificado por sucessivas culturas maiores.Aqui, obtivemos 25 placas T175, e iniciamos a purificação do adenovírus a partir do lisecelular e do meio cultural. Primeiro, verificamos a fluorescência verde do GFP expressa pelas células transduzidas. Se as células ainda estiverem presas, vamos desligá-las tocando no prato de cultura ou usando um raspador longo.As células e o meio são coletados. Os frascos são lavados com PBS, que também é coletado em tubos Falcon. As células são pelotas por centrifugação.Mantenha a pelota celular, bem como o meio para purificação do adenovírus. Nesta etapa, a ajuda de um colega é bem apreciada para acelerar o processo de colheita. A pelota da célula é verde devido à expressão GFP.A pelota é resuspendida em tampão tris hipertônico, o que facilitaria a interrupção das células. Para a lise celular, usamos nitrogênio líquido e o gás seco aqueceu até 37 graus. Não realize mais de três ciclos, pois o vírus seria danificado.Para aumentar a eficiência da interrupção celular passe cuidadosamente a célula homogeneizar através de uma agulha de seringa calibre 23. Centrifugar a célula lysate a 9,600 x g por 12 minutos. Passe o supernante em novos tubos e descarte as pelotas.Mantenha o supernatante no gelo para processamento posterior por ultracentrifuagem. Agora, processamos o meio cultural para isolar o adenovírus liberado das células. Para isso, primeiro, ponderamos a quantidade necessária de sulfato de amônio e adicionamos à garrafa em que o meio de cultura foi coletado.A garrafa é agitada vigorosamente até que os cristais sejam completamente dissolvidos. A mistura é incubada à temperatura ambiente por duas horas e a metade. Em seguida, a suspensão do precipitado é dividida em tubos Falcon.Centrífuga por 15 minutos a 1.600 x g. Após a centrifugação, o supernasal é descartado e a pelota é resuspended em 10 milimôlars tris tampão. Se não se pode continuar a purificação do adenovírus com a etapa de ultracentrifugação, o precipitado pode ser mantido por alguns dias a quatro graus, mas somente após a diálise para remover o sulfato de amônio.Aqui, apresentamos o passo da diálise. Usamos uma seringa para introduzir a suspensão em um previamente molhado. As amostras são dialisados contra 10 milimões de tampão Tris durante a noite a quatro graus.A etapa final da purificação é representada pelo passo de ultracentrifugação em um gradiente de cloreto de césio. Para formar o gradiente, primeiro, pipetamos três mililitros da solução de alta densidade do cloreto de césio. Em cima desta camada, despeje suavemente três mililitros de cloreto de césio de baixa densidade.A suspensão da partícula adenoviral do lysato celular ou do meio de cultura é então sobreposta em cima do gradiente. Os tubos são preenchidos com óleo mineral e introduzidos nos baldes SW41. Após o equilíbrio, os tubos são carregados simetricamente no rotor, que é introduzido no ultracentrifuge.A centrífuga funciona a 35.000 RPM e quatro graus por 18 horas sem pausa. Após a ultracentrifugação, os tubos são colocados em um suporte com um papel preto atrás, a fim de colher as bandas. A fase superior clara e os detritos celulares são descartados em um recipiente de resíduos com uma solução de branqueamento.A faixa mais baixa contendo o adenovírus completo é colhida com uma ponta de pipeta e coletada em um tubo Eppendorf estéril. Após a diálise, a sacarose é adicionada à suspensão viral a uma concentração final de 4% e a alíquota viral é mantida congelada a menos 80 graus. Na seção de resultados, mostramos a expressão GFP em células transduzidas com o adenovírus obtido.48 horas após a transdução, o GFP é expresso pelas células transduzidas, como mostrado pela microscopia de fluorescência. A porcentagem das células expressas do GFP é determinada pela citometria de fluxo. Cerca de 50% das células endoteliais humanas e bovinas transduzidas com 25 unidades de transdução por célula são positivas por GFP.O mesmo rendimento de transdução foi obtido para hepatocitos murinos quando foram utilizadas apenas cinco unidades de transdução por célula, mas isso está associado à maior mortalidade devido à sensibilidade celular. Reduzido à expressão GFP foi obtido pela transdução de células estromais mesenquimais devido à baixa expressão dos receptores específicos. Observações finais.Otimizamos essas tecnologias laboriosas para reduzir o tempo, os custos e o esforço necessário para obter as partículas adenovirais. O adenovírus preparado é capaz de infectar vários tipos de células e induzir a expressão do gene de interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Bioengenharia

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Um método melhorado Ensaios Mecânicos para Avaliar osso-implante Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produção e Segmentação de Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

Um protocolo eficiente e reprodutível para distração osteogênese em um modelo de rato, levando a um fêmur regenerada funcional

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...