Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

Эта работа была поддержана проектом, финансируемым совместно Европейским фондом регионального развития в рамках Оперативной программы по обеспечению конкурентоспособности на 2014-2020 годы (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; аббревиатура DIABETER), грант румынского министерства исследований и инноваций PCCDI- UEFISCDI, номер проекта PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 в рамках PNCD III и Румынской академии. Авторы благодарят Кириакоса Кипрооса (Университет Патраса, Греция) за его щедрые и соответствующие советы, Овидиу Кройтору (Университет изобразительных искусств, Бухарест, Румыния) за съемки, редактирование фильмов и графический дизайн, а Михаэлу Брату за техническую помощь.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Рекомбинантные аденовирусы являются универсальным инструментом для доставкигенов и экспрессии 12,13,14. Чтобы вызвать сильное выражение белка путем аденовирусной трансдукции, в геном аденовируса вставляется последовательность кодирования гена, представляющий интерес. Аденовиралная система AdEasy, разработанная в лаборатории Берта Фогельштейна, включает в себя основную плазмиду (pAdEasy-1), содержащую большую часть генома аденовируса дикого типа 5, и вектор шаттла (pAdTrack), предназначенный дляклонирования генов 2,10. Удаление аденовирусных генов Е1 (ответственных за сборку частиц инфекционного вируса) и Е3 (кодирующих белки, участвующие в уклонении от иммунитета хозяина) создало пространство в аденовирусном геноме, в которое может быть вставлен ген, представляющий интерес 6,5-7,5 кб2,3. Этот размер достаточен для многих генов, особенно для тех, у когокороче интроны 15,16,17. Есть также исследователи, сообщая о производстве аденовирусов, несущих кДНАтрансгена 18,19,20. Тем не менее, мы получили более низкий выход трансгенной экспрессии для аденовирусов, несущих кДНА, чем для их аналогов, несущих ген или мини-ген (данные не показаны).
Улучшение и адаптация предыдущихметодов 2,10,14,18,21, технология для аденовирусного производства требует более короткого времени, более низкой стоимости и меньше усилий. Полноформатная аденовирусная ДНК получена путем рекомбинации между вектором шаттла и плазмидой pAdEasy-1 в гомологовой рекомбинации, подверженной штамму кишечной палочки, BJ5183. Протокол подразумевает химическую трансформацию клеток AdEasier-1 (бактерии BJ5183, содержащие pAdEasy-1). Этот метод не требует электропоратора, который может быть недоступен в некоторых лабораториях, очень прост, повышает выход рекомбинации, и сокращает время, необходимое для получения компетентных клеток и для выполнения преобразования. Предварительный отбор рекомбинантных клонов, выполняемых ПЦР, еще больше сокращает время и облегчает всю процедуру. Аналогичная процедура была использована Чжао иколлегами 22, однако, в протоколе, мы оптимизировали последовательности грунтовки.
Для упаковки и усиления GFP-аденовируса использовалась производная клеточная линия HEK293, а именно клетки AD293, которые больше придерживаются культурной пластины. Другие клеточные линии, обычно используемые для аденовирал производства являются следующими: 911, 293FT, pTG6559 (A549 производные), PER. C6 (производная HER), GH329 (производная HeLa), N52. E6, и HeLa-E123,24,25,26. В наших руках, никакого улучшения в аденовирусной продукции было получено, когда 911 клеток были использованы (данные не показаны). Трансфекция клеток AD293 рекомбинантной плазмидой с использованием реагента K2 значительно увеличила эффективность шага вирусной упаковки. После производства аденовируса, до 70% аденовируса все еще находится внутри клеток и высвобождается тремя циклами замораживания и оттаивания. Увеличение количества циклов не подходит, поскольку он разрушает аденовирус.
На протяжении всего обычного аденовирусного производственного процесса, многочисленные вирусные частицы высвобождаются в среде клеточной культуры. Отказ от этой клеточной культуры среды во время сбора инфицированных клеток AD293 приведет к важной вирусной потере. Мы оптимизировали протокол, описанный Schagen и коллегами, чтобы очистить аденовирусные частицы от среды клеточной культуры осадками с сульфатомаммония 27. Этот метод имеет более высокую эффективность в восстановлении аденовируса из среды клеточной культуры по сравнению с методом использования полиэтиленгликоль28. Осажденный аденовирус следует немедленно очистить путем ультрацентрифугации или хранить в холодильнике в течение нескольких дней, но только после диализа, чтобы удалить избыток соли. Сохранение осадков дольше, чем несколько часов без диализа вредно для вируса.
Очистка аденовирусных частиц путем ультрацентрифугации, выполняемой в один шаг, уменьшает манипуляции аденовирусным запасом и облегчает процедуру по сравнению с протоколами с использованием последовательных ультрацентрифугациишагов 14,29. Диализ очищенного аденовируса необходим для удаления хлорида цезия, который может еще больше повлиять на трансдукцию. В протоколе мы использовали буфер Tris, содержащий MgCl2, но не сахарозу для диализа, так как он требует огромного, неоправданного количества сахарозы, которая необходима в противном случае в качестве консерванта для замораживания. Таким образом, мы добавили сахарозу позже, непосредственно в аденовирусные запасы, подготовленные к замораживанию. Чтобы избежать частого замораживания и оттаивания очищенного аденовируса, рекомендуется алицитировать аденовирусные запасы и хранить их при -80 градусов по Цельсию. Аденовирал-титер был оценен по цитометрии потока с учетом гена репортера GFP и процент трансинндуцированных клеток для специфического вирусного разбавления. Этот метод быстрее по сравнению с классическим "анализом бляшек" и более доверчив по сравнению с оценкой капсидных белков (различными методами, такими как ELISA или цитометрия потока), которая не показывает способность инфекции аденовираловых частиц. Тем не менее, ELISA основе количественной оценки, З-ПЦР, или налет анализ с использованием коммерчески доступных комплектов являются альтернативными методами, особенно полезно для титрованию аденовирусов, которые не содержат флуоресцентный трассировщик.
Учитывая, что аденовирусы pAdTrack получены из серотипа аденовирусов человека 5, который распознается Коксакивирусом и аденовирусными рецепторами (CAR), мы продемонстрировали способность GFP-аденовируса к трансдуцированию клеток человеческого происхождения (эндотелиальных клеток), а также клеток другого происхождения: крупного рогатого скота (эндотелиальных клеток) и мурина ( Данные показали, что GFP-аденовирус может вызвать высокий уровень экспрессии трансгена.
В заключение, мы оптимизировали эту трудоемкую технологию, чтобы сократить время, затраты и усилия, необходимые для получения аденовирусных частиц. Подготовленный аденовирус способен инфицировать различные типы клеток и вызывать экспрессию гена интереса. Этот протокол может быть использован в различных экспериментах, так как аденовирусная передача генов является одним из основных инструментов для разработки современных генной терапии.
АББРЕВИАТУРЫ: AdV-GFP, аденовирусные частицы; BAEC, аортальные эндотелиальные клетки крупного рогатого скота; CsCl, хлорид цезия; GFP, зеленый флуоресцентный белок; MSC, мезенхимальные стромальные клетки; ТУ, трансдуцирование единиц.

Аденовирусы являются неувелицированные вирусы, содержащие нуклеокапсид и двухтысяногийлинейный геном ДНК 1,2,3. Аденовирусы могут инфицировать широкий спектр типов клеток, и инфекция не зависит от активного деления клеток-хозяина. После заражения аденовирус вводит свою геномную ДНК в ядро клетки-хозяина, где он остается эпихромосомным и транскрибируется вместе с генами хозяина. Таким образом, минимальный потенциальный риск для вставки мутагенеза или онкогеноврегуляции достигается 4,5,6. Аденовирал геном не реплицируется вместе с геномом хозяина и, таким образом, аденовирусные гены разбавляются в делеющейся популяции клеток. Среди преимуществ аденовирусной трансдукции, есть: i) высокий уровень трансгенного выражения; ii) снижение рисков, связанных с интеграцией вирусной ДНК в геном хозяина, в связи с эписомальным выражением; iii) трансдукция широкого спектра разделительных и неразмещенных типов клеток. Большинство аденовирусов, используемых в биомедицинских исследованиях, не реплицируются, неимеют региона Е1 7,8,9. Для их производства требуется сотовая линия, поставляющей последовательность E1 (например, HEK293). Кроме того, несущественные области для вирусного жизненного цикла (E3) был удален, чтобы позволить вставки трансгена в вирусный геном; другие регионы (E2 и E4) были дополнительно удалены в некоторых аденовирусов, но в этих случаях, снижение урожайности аденовирусного производства и низкое выражение трансгена былизарегистрированы 7.
Здесь мы представляем улучшенный протокол для построения, упаковки и очистки аденовирусов с помощью системы AdEasy. Эти улучшения позволили упаковки аденовируса в более быстрым и экономичным способом по сравнению с оригинальнымметодом,разработанным Бертом Vogelstein2,10, из-за следующих преимуществ: (i) рекомбинации в BJ5183-содержащих pAdEasy-1 химической трансформации бактерий; ii) выбор рекомбинантных клонов ПЦР; iii) трансфекция клеток AD293 с использованием системы трансфекции К2 для аденовирусной упаковки; iv) выпадение аденовирусных частиц из среды культуры после вирусной упаковки и усиления; v) аденовирусная очистка с использованием одношагового хлорида цезия (CsCl) градиентного ультрацентрифугации.
Протокол производства аденовируса с использованием системы AdEasy(рисунок 1)включает следующие шаги:
(1) Рекомбинация pAdTrack-GFP с pAdEasy-1 в bj5183 бактерий (2) Упаковка аденовирусных частиц (3) Усиление аденовируса (4) Очистка аденовирусных частиц из лисата клеток и среды культуры (5) Аденовирусная титровая.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> Рисунок 1: Технология производства аденовируса. Основными шагами аденовирусной технологии являются: (1) Рекомбинация pAdTrack-GFP с плазмидой pAdEasy-1 в бактериях BJ5183. Выбранные рекомбинированные плазмиды усиливаются в dh5'бактериями, а затем очищаются; (2) Упаковка аденовирусных частиц в клетках AD293, которые производят белки адено-Е1; (3) Усиление аденовируса в клетках AD293; (4) Очистка аденовирусных частиц из лисата клетки и среды культуры путем ультрацентрифугации на градиенте плотности CsCl; (5) Титровая аденовируса и функциональное тестирование. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
В этом протоколе мы привели в пример технологию производства аденовируса, которая может вызвать экспрессию GFP в клетках-хозяинах. GFP уже вставлен в основу вектора шаттла pAdTrack-CMV (Addgene #16405), под вторым промоутером CMV и используется в качестве гена репортера(рисунок 1). По этой причине мы обозначили вектор pAdTrack-CMV как pAdTrack-GFP и оценили выражение GFP для демонстрационных целей. Помимо выражения GFP, система может быть использована для переэкспрессирования гена, представляющий интерес, который может быть клонирован в нескольких местах клонирования pAdTrack-CMV. Ген или миниген, клонированный в pAdTrack-CMV, как правило, более эффективен для индукции экспрессии по сравнению с cDNA11. Данные показали сильное выражение GFP в трансинированных клетках (таких как гепатоциты, эндотелиальные клетки) из различных источников (человек, бык, мурин). Аденовирусная передача генов является одним из основных инструментов разработки современных генной терапии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

Аденовирусная трансдукция имеет преимущество сильной и преходящей индукции экспрессии гена интереса в широкий спектр типов клеток и органов. Тем не менее, рекомбинантные аденовирусные технологии являются трудоемкими, трудоемкими и дорогостоящими. Здесь мы представляем улучшенный протокол с использованием системы pAdEasy для получения очищенных аденовирусных частиц, которые могут вызвать сильное зеленое флуоресцентное выражение белка (GFP) в трансдуцированных клетках. Преимущества этого усовершенствованного метода являются более быстрая подготовка и снижение себестоимости производства по сравнению с оригинальным методом, разработанным Бертом Фогельштейном. Основными шагами аденовирусной технологии являются: (1) рекомбинация pAdTrack-GFP с плазмидой pAdEasy-1 в бактериях BJ5183; (2) упаковка аденовирусных частиц; (3) усиление аденовируса в клетках AD293; (4) очищение аденовирусных частиц от лисата клетки и среды культуры; и (5) вирусное титровать и функциональное тестирование аденовируса. Улучшения к первоначально методу состоят из i) рекомбинации в BJ5183-содержа pAdEasy-1 химической трансформацией бактерий; ii) выбор рекомбинантных клонов с помощью "негативного" и "позитивного" ПЦР; iii) трансфекция клеток AD293 с использованием системы трансфекции К2 для аденовирусной упаковки; iv) осадки с сульфатом аммония вирусных частиц, высвобождаемых клетками AD293 в среде клеточной культуры; и v) очищение вируса одношагом цезия хлорида прерывистый градиент ультрацентрифугации. Сильное выражение гена интереса (в данном случае GFP) было получено в различных типах трансинированных клеток (таких как гепатоциты, эндотелиальные клетки) из различных источников (человек, бык, мурин). Аденовирусная передача генов является одним из основных инструментов разработки современных генной терапии.

Мы модифицировали и усовершенствовали оригинальный протокол Фогельштейна, чтобы достичь более быстрого и эффективного производства аденовирусов. Во-первых, мы пересмотрели методологию, чтобы добиться более простого выбора рекомбинантов. После рекомбинации, BJ5183 бактериальных клонов были протестированы "отрицательный ПЦР", чтобы оценить целостность pAdTrack-GFP как показатель отсутствия рекомбинации (рисунок 3A), или "положительный ПЦР", чтобы определить ген интереса, ассимилированных в нашем случае GFP (Рисунок 3B). Как в "негативных", так и в "положительных" ПЦР мы использовали pAdTrack-GFP в качестве шаблона управления, который дал полосу 986 bp для целостности pAdTrack(рисунок 3A, переулок 1), и полосу 264 bp для GFP(рисунок 3B, переулок 3). Праймеры, используемые для "негативного ПЦР", были разработаны для усиления фрагмента 986 bp, содержащего сайт PmeI в pAdTrack-GFP. Этот фрагмент ДНК резко увеличивается после рекомбинации и не усиливается в положительных рекомбинантных клонах. Отрицательные клоны для рекомбинации, в которых pAdTrack-GFP остались нетронутыми, представлены на рисунке 3A, полосы 3, 4 и 6. Праймеры аннеал на последовательностях ДНК, прилегающих к месту рекомбинации. Потенциальные положительные рекомбинантные клоны(рисунок 3A, полосы 2 и 5) выразили GFP, как показано на рисунке 3B, переулок 1 и 2. Плазмидная ДНК этих клонов была изолирована и использована для преобразования DH5, чтобы получить большее количество ДНК. Эти предварительно выбранные рекомбинантные плазмиды, усиленные в DH5, были затем протестированы при энзиматическом пищеварении. На рисунке 3C-E иллюстрируются результаты ферментного пищеварения одного рекомбинантно-положительного клона, переваренного с помощью ферментов ограничения Hind III, PstI, BamHI(рисунок 3C, D, E lane 2). Модели пищеварения HindIII и PstI рекомбинантного клона были похожи на те, которые были получены для pAdEasy-1, так как HindIII и PstI вырезали плазмиду pAdEasy-1 24 и 25 раз, соответственно ,Рисунок 3C и D, переулок 3); HindIII вырезать один раз и PstI сократить в четыре раза pAdTrack-GFP вектор(рисунок 3C и D, переулок 1). Бамхи вырезал два раза pAdEasy-1 вектор(рисунок 3C, переулок 3), и один раз pAdTrack-GFP(рисунок 3C, переулок 1).
PacI вырезал фрагмент 4,5 кб от рекомбинантной плазмиды(рисунок 3F,полоса 2), фрагмент 2863 bp от pAdTrack-GFP(рисунок 3F, переулок 1), и линейно pAdEasy-1 вектор(рисунок 3F, переулок 3). Лестница ДНК представлена на рисунке 3C-F,в полосах движения 4. Рекомбинантная плазмида была переварена с Pac I для дальнейшего использования для AD293 трансфекции.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Рекомбинация pAdTrack-GFP с плазмидой pAdEasy-1. Плазмиды, полученные после рекомбинации pAdTrack-GFP и pAdEasy-1, были протестированы «отрицательным» ПЦР на целостность pAdTrack-GFP (A). О не рекомбинантных клонах свидетельствует наличие полосы 986 bp, соответствующей последовательности, усиленной плазмидной pAdTrack-GFP (A, полосы 3, 4 и 6). Были также получены клоны, потенциально положительные для рекомбинации (A, полосы 2 и 5). Когда вектор pAdTrack-GFP был использован в качестве шаблона, была получена полоса 986 bp для pAdTrack-GFP (A, полоса 1). Потенциально положительные рекомбинантные клоны были протестированы на выражение GFP на "положительном" ПЦР (B); полоса 264 bp появляется как для потенциально рекомбинированных клонов (B, полоса 1 и 2), так и для плазмиды pAdTrack-GFP. ДНК одного потенциального рекомбинантного клона была протестирована с помощью фермента ограничения HindIII, PstI, BamHI и PacI (C-F, полосы 2). В элементе управления плазмид pAdEasy-1 (C-F, полосы 3) и плазмида pAdTrack-GFP (C-F, полосы движения 1) переваривались с теми же ферментами. Лестница ДНК представлена в полосе C-F 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Аденовиальная упаковка и усиление были выполнены в клетках AD293. Аденовирал частицы (AdV-GFP) были очищены от лисата клетки AD293, а также из среды клеточной культуры, где они были освобождены инфицированными клетками. Чтобы сконцентрировать аденовирус, найденный в среде клеточной культуры, частицы были осаждены сульфатом аммония, а затем повторно использованы в 10 мМ Трис HCl pH 8 с 2 мМ MgCl2, тот же буфер, что и для клеточного лиза. Впоследствии аденовирусные частицы из лисата клетки и из среды культуры были очищены csCl разрывным градиентом ультрацентрифугации. После ультрацентрифугации была получена сильная полоса очищенного AdV-GFP, как показано на рисунке 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> Рисунок 4: Аденовирал очистки ультрацентрифугации на прерывистый градиент CsCl. Однородный клеток и аденовирус, высасываемый из среды, подвергались ультрацентрифугации на прерывистом градиенте, образованном растворами CsCl низкой и высокой плотности. В обоих случаях были зарегистрированы сильные полосы аденовируса GFP-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Для определения вирусного titer, выраженного в единицах трансдуцирования на один мл (TU/mL), клетки AD293 были заражены серийными разбавлениями AdV-GFP. После 48 часов, инфицированные клетки выразили GFP, в обратной корреляции с фактором разбавления вирусной суспензии. Это наблюдалось с помощью флуоресцентной микроскопии, и процент GFP-положительных клеток определялся цитометрией потока(рисунок 5). Для расчета titer, вирусное разбавление, которое индуцированных 5 - 20% GFP-положительных клеток было рассмотрено (Рисунок 5C). Как правило, мы получаем вирусный titer в 10фунтов стерлингов (TU/mL) для GFP-аденовируса.
Ниже приводится пример аденовирал-титерного расчета для конкретной аденовирской партии, в которой 300000 клеток (C) были трансуцированы с 1 мл аденовирусного раствора (V), при факторе разбавления 106 (D), для которого было получено 6% GFP-положительных клеток (F)
Титер (TU/mL) - D x F/100 x C/V - 106 x 6/100 x 300000/1 - 1,8 х 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> Рисунок 5: Оценка аденовирусного тьтера. Клетки AD293 были заражены различными аденовирусные разбавления. Сорок восемь часов спустя, клетки наблюдались с помощью флуоресценции микроскопии и проанализированы поток цитометрии, чтобы определить процент GFP положительных клеток, вызванных различными аденовирусными разбавлениями (A-D). Для установления ворот для цитометрии потока были также проанализированы непервированные клетки (Е). Татер, рассчитанный для фактора разбавления 106, когда 6% клеток были положительными GFP, был 1.8 x 1010 TU/mL. Для панелей A-E, бары: 100 мкм. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Для проверки трансдукционного потенциала подготовленного аденовируса были использованы четыре клеточные линии: эндотелиальные клетки человека (EA.hy926), аортальные эндотелиальные клетки крупного рогатого скота (BAEC), гепатоциты мурина (Hepa 1-6) и мурин мезенхимальные стромальные клетки (MSC). Эндотелиальные клетки (EA.hy926 и BAEC) были трансуцированы с 25 TU/cell, гепатоциты были трансуцированы с 5 TU/cell и MSC были трансуцированы с 250 TU/cell.
Вот пример того, как был рассчитан объем аденовирусной подвески, необходимой для заражения 3 х10 6 ячеек с 25 ТУ/клеткой, с использованием аденовирусной подвески с 1,8 х10 10 ТУ/мл.
Для 1 ячейки .............. 25 ТУ 3 х 106 ячеек .............. x ТУ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x-75 x 106 TU Если вирусный запас содержит 1.8 x 1010 TU .............. 1 мл 75 х 106 ТУ .............. y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y' 4.2 x 10-3 мл и 4,2 мл вирусного запаса
Через 48 часов после трансдукции клетки были проанализированы с помощью микроскопии флуоресценции. Как показано на рисунке 6, человеческие или бычьи эндотелиальные клетки были трансуцированы с хорошей эффективностью (50%) для 25 TU/cell(рисунок 6 EA.hy926 и BAEC). Гепатоциты Мурина (Hepa 1-6) были эффективно трансокцинированы аденовирусом при низком количестве аденовирусных частиц (5 ТУ/клетки), но они также чувствительны к аденовирусу, так как был зарегистрирован более высокий процент мертвых клеток (PI-положительные клетки) (16%) по сравнению с другими типами клеток. Мезенхимальные стромальные клетки были наиболее трудно трансдуцированных(рисунок 6), из-за отсутствия конкретных аденовирусных рецепторов (неопубликованные данные).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> Рисунок 6: Инфекционность аденовируса и индукция экспрессии GFP в трансдуцированных клетках. Эндотелиальные клетки человека (EA.hy926), аортальные эндотелиальные клетки крупного рогатого скота (BAEC), гепатоциты мурина (Hepa 1-6) и мурин мезенхимальные стромальные клетки (MSC) были трансдированы с указанным количеством аденовируса. GFP был обнаружен с помощью флуоресцентной микроскопии и процент положительных клеток GFP был проанализирован цитометрией потока. PI-положительные клетки, определяемые цитометрией потока, показывают смертность клеток, определяемую вирусной трансдукции. Клетки EA.hy926, аортальные эндотелиальные клетки крупного рогатого скота и клетки Hepa 1-6 были сильно трансдуцированы аденовирусом, выход трансдукции колеблется от 41 до 52%. Для MSC, более высокое количество вируса (250 TU/cells) индуцированных только 27% GFP положительный из транс индуцированных клеток. Бары: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

Здесь мы представляем протокол по производству аденовируса с использованием системы pAdEasy. Технология включает рекомбинацию плазмидов pAdTrack и pAdEasy-1, аденовирусную упаковку и усиление, очистку аденовирусных частиц от лизоля клетки и среды культуры, вирусное титрование и функциональное тестирование аденовируса.

Эффективный метод производства аденовируса

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Добро пожаловать в Институт клеточной биологии и патологии, Николае Симионеску из Бухареста, Румыния. Здесь, в Лаборатории вирусной трансдукции, мы показываем часть производства аденовирусных частиц, используя оптимизированную методологию, основанную на системе AdEasy, разработанной профессором Фогельштейном. Основными этапами технологии производства этого аденовируса являются, во-первых, рекомбинация pAdTrack, содержащая GFP с плазмидой pAdEasy-1 в бактериях BJ5183.Во-ве, упаковка аденовирусных частиц. В-в-в-ве- усиление аденовируса в клетках AD293. В-четырех, очищение аденовирусных частиц от лисата клеток и среды культуры.В-пятых, вирусное титровае и функциональное тестирование аденовируса. Здесь мы представляем важный шаг методологии. Очистка аденовирусных частиц из лисата клетки и среды культуры.Очистка аденовируса начинается с сбора вирусодобывающих клеток и среды. Клетки AD293 были трансфицированы рекомбинантной плазмидой и как аденовирус был упакован. Затем аденовирус усилился последовательными более крупными культурами.Здесь мы получили 25 пластин T175, и мы начали очистку аденовируса от лицита клетки и среды культуры. Во-первых, мы проверили зеленую флуоресценцию GFP, выраженную трансинпустых клеток. Если клетки все еще прикреплены, мы отсоединим их, нажав на блюдо культуры или с помощью длинного скребка.Клетки и среда собраны. Колбы промывают PBS, который также собирается в трубках Falcon. Клетки гранулированы центрифугой.Держите клеточные гранулы, а также среды для дальнейшей очистки аденовируса. На этом этапе, помощь коллеги хорошо ценится для ускорения процесса сбора урожая. Ячейка гранулы зеленый из-за выражения GFP.Гранулы повторно засасылись в гипертонический буфер Tris, что облегчило бы разрушение клеток. Для клеточного лиза мы используем жидкий азот и сухой газ, прогретый до 37 градусов. Не выполняй более трех циклов, так как вирус будет поврежден.Для повышения эффективности нарушения работы клеток тщательно проходят клетки гомогенизации через 23 калибровочных шприц иглы. Центрифуга клетки лисировать при 9, 600 х г в течение 12 минут. Перейти супернатант в новых трубках и отказаться от гранул.Держите супернатант на льду для дальнейшей обработки ультрацентрифугом. Теперь мы обработать культурную среду, чтобы изолировать аденовирус, выпущенный из клеток. Для этого, во-первых, мы взвешиваем необходимое количество сульфата аммония и добавляем его в бутылку, в которой была собрана культурная среда.Бутылка энергично встряхивается до полного растворения кристаллов. Смесь инкубируется при комнатной температуре в течение двух с половиной часов. Затем суспензия осадка делится на трубки Falcon.Центрифуга в течение 15 минут при 1600 x г. После центрифугации супернатант отбрасывается, а гранулы повторно засовывляются в 10 миллимолярновом буфере Tris. Если нельзя продолжать очищение аденовируса с помощью ультрацентрифугации, осадок может быть сохранен в течение нескольких дней при четырех градусах, но только после диализа для удаления сульфата аммония.Здесь мы представили этап диализа. Мы используем шприц, чтобы ввести подвеску в ранее смоченую кассету. Образцы обезличено против 10 миллимолярд tris буфера ночь на четыре градуса.Заключительный этап очистки представлен ультрацентрифугации шаг на цезий хлорид прерывистый градиент. Чтобы сформировать градиент, во-первых, мы пипетки три миллилитров раствора высокой плотности хлорида цезия. Поверх этого слоя аккуратно залить три миллилитра хлорида цезия низкой плотности.Подвеска аденовирусных частиц из лисата клетки или среды культуры затем накладывается поверх градиента. Трубы заполнены минеральным маслом и введены в ведра SW41. После равной меры трубки загружаются симметрично в ротор, который вводится в ультрацентрифуг.Центрифуга работает 35000 об /мин и четыре градуса в течение 18 часов без перерыва. После ультрацентрифугации трубки помещаются на подстажу с черной бумагой сзади, чтобы собрать полосы. Ясная верхняя фаза и клеточный мусор выбрасываются в мусорный контейнер с отбеливающим раствором.Самая низкая полоса, содержащая полный аденовирус, собирается с наконечником пипетки и собирается в стерильной трубке Эппендорфа. После диализа сахароза добавляется к вирусной суспензии до 4%окончательной концентрации, а вирусные алициты замораживаются при температуре минус 80 градусов. В разделе результатов мы показали экспрессию GFP в клетках, трансуцированных с помощью аденовируса.Через 48 часов после трансдукции, GFP выражается трансдуцированных клеток, как показано на флуоресценции микроскопии. Процент экспресс-клеток GFP определяется цитометрией потока. Около 50% эндотелиальных клеток человека и крупного рогатого скота, индуцированных 25 единицами трансдукции на клетку, являются положительными GFP.Такая же урожайность трансдукции была получена для гепатоцитов мурина, когда было использовано всего пять единиц трансдукции на клетку, но это связано с более высокой смертностью из-за чувствительности клеток. Снижение до экспрессии GFP было получено путем трансдукции мезенхимальных стромальных клеток из-за низкой экспрессии специфических рецепторов. Заключительные замечания.Мы оптимизируем эти трудоемкие технологии, чтобы сократить время, затраты и усилия, необходимые для получения аденовирусных частиц. Подготовленный аденовирус способен инфицировать различные типы клеток и индуцировать экспрессию гена интереса.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Decellularization Методология по производству природного Бесклеточная кишечника Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Улучшенная Механические испытания Метод для оценки костного имплантата Анкоридж

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Производство и таргетинг одновалентных квантовых точек

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Роботизированная Производство раковой клетки сфероидов с водной двухфазной системе для тестирования на наркотики

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

Эффективное и воспроизводимые протокол для отвлечения остеогенез в мышиной модели, ведущие к функциональной регенерированный бедренной кости

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Поколение катионного Nanoliposomes для эффективной доставки в Vitro транскрипции РНК

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...