Name: an efficient method for adenovirus production
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

Bu çalışma, 2014-2020 Rekabetçilik Operasyonel Programı (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, Kimlik: P_37_668; diabeter kısaltması), Romanya Araştırma ve İnovasyon Bakanlığı'nın bir hibesi PCCDI- UEFISCDI, PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 PNCD III içinde ve Romanya Akademisi tarafından. Yazarlar, cömert ve ilgili tavsiyeleri için Kyriakos Kypreos'a (Yunanistan Patras Üniversitesi), film çekimi, film kurgusu ve grafik tasarım için Ovidiu Croitoru'ya (Güzel Sanatlar Üniversitesi, Bükreş, Romanya) ve teknik yardım için Mihaela Bratu'ya teşekkür ediyorlar.

<ol>
	<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells.">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li><li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion.">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li><li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers:+a+scientific+review+and+technical+guide.">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li><li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector:+what+parameters+are+governing+the+production+yield.">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders.">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system.">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li><li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential.">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting.">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li><li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting.">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity.">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li><li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice.">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li><li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+[L261A,+W264A,+F265A,+L268A,+V269A],+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties.">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li><li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma.">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li><li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand.">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li><li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system.">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li><li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer.">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li><li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR.">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li><li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+producer+cells.">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li><li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors.">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li><li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+911:+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors.">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li><li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors.">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li><li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium:+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield.">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li><li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton+'pegylation':+use+of+PEG+(polyethylene+glycol)+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems.">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li><li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion.">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Rekombinant adenovirüsler gen iletimi ve ekspresyonu için çok yönlü bir araçtır12,13,14. Adenoviral transdüksiyon ile güçlü protein ekspresyonunu teşvik etmek için, ilgi geninin kodlama dizisi adenovirüsün genomuna yerleştirilir. Bert Vogelstein laboratuvarında geliştirilen AdEasy adenoviral sistemi, vahşi tip adenovirüs serotip 5 genomunun çoğunu içeren bir omurga plazmid (pAdEasy-1) ve gen klonlama için tasarlanmış bir mekik vektörü (pAdTrack) içerir2,10. Adenoviral genlerin silinmesi E1 (enfeksiyöz virüs parçacıklarının bir montajından sorumludur) ve E3 (konak bağışıklığından kaçınmada rol oynayan proteinleri kodlama) adenoviral genomda, 6.5-7.5 kb'lık bir ilgi geninin yerleştirilebileceği bir alan yarattı2,3. Bu boyut birçok gen için yeterlidir, özellikle daha kısa intronları olanlar için15,16,17. Ayrıca bir transgene18 , 19,20cDNA taşıyan adenovirüslerin üretimini bildiren araştırmacılar da vardır. Bununla birlikte, cDNA taşıyan adenovirüsler için bir gen veya mini gen taşıyan benzerlerine göre daha düşük transgene ekspresyonu elde ettik (veriler gösterilmedi).
Önceki yöntemlerin iyileştirilmesi ve uyarlaması2,10,14,18,21, adenoviral üretim teknolojisi daha kısa bir süre, daha düşük maliyet ve daha az çaba gerektirir. Tam uzunlukta adenoviral DNA, mekik vektörü ile pAdEasy-1 plazmid arasında homolog rekombinasyon eğilimli E. coli suşu, BJ5183 arasında rekombinasyon ile elde edilir. Protokol, AdEasier-1 hücrelerinin kimyasal dönüşümünü ima eder (pAdEasy-1 içeren BJ5183 bakterileri). Bu teknik, bazı laboratuvarlarda bulunmayan, çok basit, rekombinasyon verimini artıran ve yetkin hücreler elde etmek ve dönüşümü gerçekleştirmek için gereken süreyi azaltan bir elektroporatör gerektirmez. PCR tarafından gerçekleştirilen rekombinant klonların ön seçimi süreyi daha da kısaltır ve tüm prosedürü kolaylaştırır. Benzer bir prosedür Zhao ve iş arkadaşları tarafından kullanıldı22, ancak protokolde astarların dizilerini optimize ettik.
GFP-adenovirüs paketleme ve amplifikasyon için, kültür plakasına daha uygun olan AD293 hücreleri olmak üzere bir HEK293 türev hücre hattı kullanılmıştır. Adenoviral üretim için yaygın olarak kullanılan diğer hücre hatları şunlardır: 911, 293FT, pTG6559 (A549 türevi), PER. C6 (HER türevi), GH329 (HeLa türevi), N52. E6 ve HeLa-E123,24,25,26. Elimizde 911 hücre kullanıldığında adenoviral üretimde iyileşme sağlanamadı (veriler gösterilmedi). AD293 hücrelerinin K2 reaktifi kullanılarak rekombinant plazmid ile transfeksiyon, viral paketleme adımının verimliliğini oldukça artırdı. Adenovirüs üretiminden sonra, adenovirüslerin ~% 70'i hala hücrelerin içindedir ve üç donma ve çözülme döngüsü ile serbest bırakılır. Döngü sayısını artırmak uygun değildir, çünkü adenovirüsü yok eder.
Rutin adenoviral üretim süreci boyunca, hücre kültürü ortamında çok sayıda viral parçacık salınır. Enfekte AD293 hücrelerinin toplanması sırasında bu hücre kültürü ortamının atılması önemli bir viral kayba neden olacaktır. Schagen ve iş arkadaşları tarafından açıklanan protokolü, amonyum sülfat27ile çökerek adenoviral parçacıkları hücre kültürü ortamından arındırmak için optimize ettik. Bu yöntem, polietilen glikol28kullanan yöntemle karşılaştırıldığında hücre kültürü ortamından adenovirüs geri kazanımında daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. Çökülen adenovirüs, tuz fazlalığını gidermek için ultrasantrifüjleme ile hemen arındırılmalı veya buzdolabında birkaç gün ancak diyalizden sonra tutulmalıdır. Çökeltmeyi diyaliz olmadan birkaç saatten fazla tutmak virüs için zararlıdır.
Adenoviral parçacıkların tek adımda gerçekleştirilen ultrasantrifüjleme ile saflaştırılması, adenoviral stoğun manipülasyonunu azaltır ve ardışık ultrasantrifüjasyon adımları14,29kullanan protokollere kıyasla prosedürü kolaylaştırır. Saflaştırılmış adenovirüs diyalizi, transdüksiyonu daha da etkileyebilecek sezyum klorürü çıkarmak için gereklidir. Protokolde, MgCl2 içeren ancak diyaliz için sakkaroz içermeyen Tris tamponu kullandık, çünkü donma için koruyucu olarak ihtiyaç duyulan büyük, haksız miktarda sakkaroz gerektiriyor. Böylece, daha sonra, doğrudan donma için hazırlanan adenoviral stoklara sakkaroz ekledik. Saflaştırılmış adenovirüslerin sık sık donmasını ve çözülmesini önlemek için, adenoviral stokların aliquot ve -80 ° C'de saklanması önerilir. Adenoviral titer, GFP muhabir geni ve transdüklenmiş hücrelerin belirli bir viral seyreltme yüzdesi göz önüne alınarak akış sitometrisi ile değerlendirildi. Bu yöntem klasik "plak tahlili" ile karşılaştırıldığında daha hızlıdır ve adenoviral parçacıkların enfeksiyon kapasitesini ortaya çıkaramayan kapsid proteinlerinin (ELISA veya akış sitometrisi gibi çeşitli yöntemlerle) değerlendirilmesi ile karşılaştırıldığında daha güvenilirdir. Bununla birlikte, ELISA tabanlı niceleme, Q-PCR veya plak tahlilleri, özellikle floresan izleyici içermeyen adenovirüslerin titrasyonu için yararlı olan alternatif yöntemlerdir.
pAdTrack adenovirüslerinin Coxsackievirus ve Adenovirus Reseptörleri (CAR) tarafından tanınan insan adenovirüsleri serotip 5'ten türetildiği göz önüne alındığında, GF'nin kapasitesini gösterdik.P-adenovirüs insan kökenli hücreleri (endotel hücreleri) transdüse etmek için, aynı zamanda diğer kökenlerden hücreler: sığır (endotel hücreleri) ve murine (mezenkimal stromal hücreler ve hepatositler). Veriler, GFP-adenovirüsün bir transjenin yüksek düzeyde ifadeye neden olabileceğini gösterdi.
Sonuç olarak, bu zahmetli teknolojiyi, adenoviral parçacıkları elde etmek için gereken zamanı, maliyetleri ve çabayı azaltmak için optimize ettik. Hazırlanan adenovirüs çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilir ve ilgi geninin ekspresyonunun teşvikini teşvik edebilir. Bu protokol çeşitli deneylerde kullanılabilir, çünkü adenoviral aracılı gen transferi modern gen tedavileri geliştirmek için ana araçlardan birini temsil eder.
KıSALTMALAR: AdV-GFP, adenoviral parçacıklar; BAEC, sığır aort endotel hücreleri; CsCl, sezyum klorür; GFP, yeşil floresan protein; MSC, mezenkimal stromal hücreler; TU, dönüştürücü üniteler.

Adenovirüsler çekirdek kapağı ve çift iplikli lineer DNA genom 1 ,2,3içeren gelişmemiş virüslerdir. Adenovirüsler çok çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilir ve enfeksiyon aktif konak hücre bölünmesine bağlı değildir. Enfeksiyondan sonra, adenovirüs genomik DNA'sını konak hücre çekirdeğine tanıtır, burada epikromomal kalır ve konağın genleriyle birlikte yazıya dökülır. Böylece, eklemeli mutajensis veya onkogenler düzenlemesi için minimum potansiyel risk elde edilir4,5,6. Adenoviral genom konak genom ile birlikte çoğaltılmaz ve böylece adenoviral genler bölünen bir hücre popülasyonunda seyreltilir. Adenoviral transdüksiyonun avantajları arasında şunlar vardır: (i) yüksek düzeyde transgene ekspresyasyonu; (ii) epizomal ekspresyon nedeniyle viral DNA'nın konak genomuna entegrasyonu ile ilgili risklerin azaltılması; (iii) çok çeşitli bölme ve bölmeyen hücre tiplerinin transdüksiyon. Biyomedikal araştırmalarda kullanılan adenovirüslerin çoğu çoğaltıcı olmayandır, E1 bölgesi 7,8,9'danyoksundur. Üretimleri için E1 dizisini (HEK293 gibi) sağlayan bir hücre hattı gereklidir. Ayrıca, viral genoma bir transjen yerleştirilmesine izin vermek için viral yaşam döngüsü (E3) için gerekli olmayan bir bölge silindi; diğer bölgeler (E2 ve E4) bazı adenovirüslerde daha da silindi, ancak bu durumlarda, adenoviral üretim veriminde azalma ve transjenin düşük ekspresyonu bildirildi7.
Burada, AdEasy Sistemini kullanarak adenovirüslerin inşası, paketlenmesi ve saflaştırılması için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu iyileştirmeler, aşağıdaki avantajlar nedeniyle Bert Vogelstein2,10tarafından geliştirilen orijinal yönteme kıyasla adenovirüsün daha hızlı ve ekonomik bir şekilde paketlenmesine izin verdi: (i) BJ5183 içeren pAdEasy-1'deki bakterilerin kimyasal dönüşümü ile yeniden birleştirilmesi; (ii) rekombinant klonların PCR tarafından seçilmesi; (iii) adenoviral paketleme için K2 transfeksiyon sistemini kullanan AD293 hücrelerinin transfeksiyonu; (iv) viral paketleme ve amplifikasyondan sonra kültür ortamından adenoviral parçacıkların çökeltilmesi; (v) tek adımlı sezyum klorür (CsCl) gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak adenoviral saflaştırma.
AdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için protokol (Şekil 1) aşağıdaki adımları içerir:
(1) BJ5183 bakterilerinde pAdTrack-GFP'nin pAdEasy-1 ile yeniden birleşmesi (2) Adenoviral parçacıkların paketlenmesi (3) Adenovirüs amplifikasyonu (4) Adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması (5) Adenovirüs titrasyonu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg"> Şekil 1: Adenovirüs üretim teknolojisi. Adenoviral teknolojinin ana adımları şunlardır: (1) pAdTrack-GFP'nin BJ5183 bakterilerinde pAdEasy-1 plazmid ile yeniden birleşmesi. Seçilen rekombinlenmiş plazmidler DH5α bakterilerinde yükseltilir ve daha sonra saflaştırilir; (2) Adeno-E1 proteinleri üreten AD293 hücrelerindeki adenoviral parçacıkların paketlenmesi; (3) AD293 hücrelerinde adenovirüs amplifikasyonu; (4) Adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından bir CsCl yoğunluk gradyanı üzerinde ultra merkezirifülasyon ile saflaştırılması; (5) Adenovirüs titrasyonu ve fonksiyonel test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolde, konak hücrelerde GFP ekspresyonunun neden olabileceği adenovirüs üretimi için teknolojiyi örneklendirdik. GFP zaten pAdTrack-CMV mekik vektörün (Addgene #16405) omurgasına ikinci bir CMV promotörü altında yerleştirilmiştir ve muhabir geni olarak kullanılır (Şekil 1). Bu nedenle, burada pAdTrack-CMV vektörü pAdTrack-GFP olarak belirledik ve GFP'nin ifadesini gösteri amaçlı değerlendirdik. GFP ifadesinin yanı sıra, sistem pAdTrack-CMV'nin birden fazla klonlama bölgesinde klonlanabilecek bir ilgi genini aşırı ifade etmek için kullanılabilir. pAdTrack-CMV'de klonlanmış bir gen veya minigene, cDNA11ile karşılaştırıldığında ifade indüksiyonu için genellikle daha verimlidir. Veriler, çeşitli kaynaklardan (insan, sığır, murine) transdüklenmiş hücrelerde (hepatositler, endotel hücreleri gibi) güçlü bir GFP ekspresyonu gösterdi. Adenoviral aracılı gen transferi, modern gen tedavileri geliştirmek için ana araçlardan birini temsil eder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AD293 cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>240085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdEasier-1 cells</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I (for electrophoresis)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamH I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 100 mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5alpha bacteria</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3240-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.8%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks T25, T75, T175</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30712129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa 1-6 murine hepatocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Transfection System</td>
			<td>Biontex</td>
			<td>T060-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>LBx0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix &#38; Go E. coli Transformation kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advanced DNA stain</td>
			<td>Nippon Genetics Europe</td>
			<td>MG-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pac I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD2204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdEasy-1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdTrack-CMV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase GoTaq</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pme I (Mss I)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>43065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pst I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 23G neeedle</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>464BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50ml</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Sigma Sartorius</td>
			<td>3-19KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraeusFresco 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge with SW41Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-80 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Class II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (0-2&#181;l, 1-10&#181;l, 2-20&#181;l, 10-100&#181;l, 20-200&#181;l, 100-1000&#181;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Block Heating Thermostat</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>TDB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycle</td>
			<td>SensoQuest</td>
			<td>012-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for adenovirus production

Adenoviral transdüksiyon, ilgi geninin çok çeşitli hücre tiplerine ve organlarına ekspresyonunun güçlü ve geçici bir indüksiyon avantajına sahiptir. Bununla birlikte, rekombinant adenoviral teknoloji zahmetli, zaman alıcı ve pahalıdır. Burada, transdüklenmiş hücrelerde güçlü bir yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu indükleye edebilecek saflaştırılmış adenoviral parçacıklar elde etmek için pAdEasy sistemini kullanarak geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu geliştirilmiş yöntemin avantajları, Bert Vogelstein tarafından geliştirilen orijinal yönteme kıyasla daha hızlı hazırlık ve üretim maliyetinin düşmesidir. Adenoviral teknolojinin ana adımları şunlardır: (1) pAdTrack-GFP'nin BJ5183 bakterilerinde pAdEasy-1 plazmid ile yeniden birleşmesi; (2) adenoviral parçacıkların ambalajı; (3) AD293 hücrelerinde adenovirüslerin amplifikasyonu; (4) adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması; ve (5) adenovirüslerin viral titrasyonu ve fonksiyonel testi. Orijinal yöntemdeki iyileştirmeler (i) BJ5183 içeren pAdEasy-1'deki bakterilerin kimyasal dönüşümü ile yeniden birleştirilmesinden oluşur; (ii) rekombinant klonların "negatif" ve "pozitif" PCR ile seçilmesi; (iii) adenoviral paketleme için K2 transfeksiyon sistemini kullanan AD293 hücrelerinin transfeksiyonu; (iv) AD293 hücrelerinin hücre kültürü ortamında serbest bıraktıklarına ilişkin viral parçacıkların amonyum sülfat ile çökeltülerek; ve (v) virüsün tek adımlı sezyum klorür süreksiz gradyan ultrasantrifülasyonu ile saflaştırılması. Çeşitli kaynaklardan (insan, sığır, murine) farklı transdüklenmiş hücre türlerinde (hepatositler, endotel hücreleri gibi) ilgi geninin güçlü bir ifadesi elde edildi. Adenoviral aracılı gen transferi, modern gen tedavileri geliştirmek için ana araçlardan birini temsil eder.

Daha hızlı ve verimli adenovirüs üretimi elde etmek için orijinal Vogelstein protokolünü değiştirdik ve geliştirdik. İlk olarak, daha kolay bir rekombinant seçimi elde etmek için metodolojiyi revize ettik. Rekombinasyondan sonra, BJ5183 bakteri klonları, pAdTrack-GFP'nin bütünlüğünü yeniden birleştirme eksikliğinin bir göstergesi olarak değerlendirmekiçin "negatif PCR" veya ilgi genini tanımlamak için "pozitif PCR" ile test edildi, bizim durumumuzda GFP'ye asimile edildi (Şekil 3B). Hem "negatif" hem de "pozitif" PCR'larda, pAdTrack-GFP'yi kontrol şablonu olarak kullandık, bu da pAdTrack bütünlüğü için 986 bp bant(Şekil 3A, şerit 1) ve GFP için 264 bp bant verdi (Şekil 3B, şerit 3). "Negatif PCR" için kullanılan astarlar, pAdTrack-GFP'deki PmeI sitesini içeren 986 bp'lik bir parçayı yükseltmek için tasarlanmıştır. Bu DNA parçası rekombinasyondan sonra büyük ölçüde genişler ve pozitif rekombinant klonlarda yükseltilmez. pAdTrack-GFP'nin bozulmadan kaldığı rekombinasyon için negatif klonlar Şekil 3A, şerit 3, 4 ve 6'da temsil edilir. Astarlar, rekombinasyon bölgesinin bitişiğindeki DNA dizilerinde tavlama. Potansiyel pozitif rekombinant klonlar(Şekil 3A, şerit 2 ve 5), Şekil 3B, şerit 1 ve 2'de gösterildiği gibi GFP'yi ifade etti. Bu klonlardan alınan plazmid DNA izole edildi ve daha yüksek miktarda DNA elde etmek için DH5α dönüşümü için kullanıldı. DH5α'da güçlendirilmiş bu önceden seçilmiş rekombinant plazmidler daha sonra enzimmatik sindirim ile test edildi. Şekil 3'teC-E, Hind III, PstI, BamHI kısıtlama enzimleri ile sindirilen bir rekombinant-pozitif klonun enzimatik sindiriminin sonuçları gösterilmiştir(Şekil 3C, D, E şerit 2). Rekombinant klonun HindIII ve PstI sindirim kalıpları pAdEasy-1 için elde edilenlere benzerdi, çünkü HindIII ve PstI pAdEasy-1 plazmidini sırasıyla 24 ve 25 kez kestiler ,(Şekil 3C ve D, şerit 3); HindIII bir kez kesti ve PstI pAdTrack-GFP vektörün dört katını kesti(Şekil 3C ve D, şerit 1). BamHI iki kez kesti pAdEasy-1 vektörü(Şekil 3C, şerit 3) ve bir kez pAdTrack-GFP (Şekil 3C, şerit 1).
PacI, rekombinant plazmidden 4,5 kb'lık bir parça kesti (Şekil 3F, şerit 2), pAdTrack-GFP'den 2863 bp'lik bir parça (Şekil 3F, şerit 1) ve pAdEasy-1 vektörünü doğrusallaştırdı (Şekil 3F, şerit 3). DNA merdiveni Şekil 3C-F, şerit 4'te temsil edilir. Rekombinant plazmid, AD293 transfection için daha fazla kullanım için Pac I ile sindirildi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg"> Şekil 3: pAdTrack-GFP'nin pAdEasy-1 plazmid ile yeniden birleşmesi. pAdTrack-GFP ve pAdEasy-1'in rekombinasyonundan sonra elde edilen plazmidler pAdTrack-GFP bütünlüğü (A) için "negatif" PCR ile test edildi. Rekombinant olmayan klonlar, pAdTrack-GFP plazmidinden (A, şerit 3, 4 ve 6) yükseltilen diziye karşılık gelen 986 bp bandın varlığı ile kanıtlandı. Rekombinasyon için potansiyel olarak pozitif olan klonlar (A, şerit 2 ve 5) de elde edildi. pAdTrack-GFP vektörü şablon olarak kullanıldığında, pAdTrack-GFP (A, şerit 1) için 986 bp'lik bir bant elde edildi. Potansiyel olarak pozitif rekombinant klonlar GFP ekspresyörü için "pozitif" PCR (B) ile test edildi; hem potansiyel olarak yeniden birleştirilmiş klonlar (B, şerit 1 ve 2) hem de pAdTrack-GFP plazmid için 264 bp'lik bir bant görünür. Potansiyel bir rekombinant klonun DNA'sı HindIII, PstI, BamHI ve PacI kısıtlama enzimi (C-F, şerit 2) ile test edildi. Kontrollerde pAdEasy-1 vektörü (C-F, şerit 3) ve pAdTrack-GFP plazmid (C-F, şerit 1) aynı enzimlerle sindirildi. DNA merdiveni C-F şerit 4'te temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ad293 hücrelerinde adenoviral paketleme ve amplifikasyon yapıldı. Adenoviral parçacıklar (AdV-GFP), AD293 hücre lisatından ve enfekte hücreler tarafından salındıkları hücre kültürü ortamından arındırıldı. Hücre kültürü ortamında bulunan adenovirüsü konsantre etmek için, parçacıklar amonyum sülfat ile çöke çekildi ve daha sonra 2 mM MgCl 2 ile 10 mM Tris HCl pH8'de yeniden kullanıldı , hücre lizisi için kullanılan tampon. Daha sonra, hücre lisatından ve kültür ortamından gelen adenoviral parçacıklar CsCl süreksiz gradyan ultrasantrifüjasyonu ile saflaştırılmıştır. Ultrasantrifüjlemeden sonra, Şekil 4'tegösterildiği gibi güçlü bir saflaştırılmış AdV-GFP bandı elde edildi.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg"> Şekil 4: Süreksiz bir CsCl gradyanı üzerinde ultracentrifugation ile adenoviral saflaştırma. Hücre homojenatı ve ortamdan çökelen adenovirüs, düşük ve yüksek yoğunluklu CsCl çözeltileri tarafından oluşturulan süreksiz bir gradyan üzerinde ultrasantrifüjene maruz kaldı. Her iki olguda da güçlü GFP-adenovirüs bantları kanıtlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bir mL (TU/mL) başına transdüksiyon ünitelerinde ifade edilen viral titreyi belirlemek için AD293 hücrelerine AdV-GFP'nin seri seyreltmeleri bulaştı. 48 saat sonra, enfekte hücreler GFP'yi viral süspansiyonun seyreltme faktörü ile ters bir korelasyonda ifade etti. Bu floresan mikroskopi ile gözlenmiş ve GFP pozitif hücrelerin yüzdesi akış sitometrisi ile belirlenmiştir (Şekil 5). Titreyi hesaplamak için, GFP pozitif hücrelerin% 5 - 20'sini indükleyen viral seyreltme göz önünde bulunduruldu (Şekil 5C). Genellikle, GFP-adenovirüs için~10 10 (TU/mL) viral titre elde ederiz.
Aşağıda, 300000 hücrenin (C) 1 mL adenoviral çözelti (V) ile% 6 GFP pozitif hücrelerin (F) elde edildiği 106 (D) seyreltme faktöründe transdük edildiği belirli bir adenoviral parti için adenoviral titer hesaplamasının bir örneğini sunuyoruz:
Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/mL
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg"> Şekil 5: Adenoviral titerin değerlendirilmesi. AD293 hücreleri çeşitli adenoviral seyreltmelerle enfekte oldu. Kırk sekiz saat sonra, hücreler floresan mikroskopi ile gözlendi ve farklı adenoviral seyreltmeler (A-D) tarafından indüklenen GFP pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edildi. Akış sitometrisi için kapıyı kurmak için, transdüklenmiş olmayan hücreler de analiz edildi (E). Seyreltme faktörü için hesaplanan titer 106, hücrelerin% 6'sı GFP pozitif olduğunda 1.8 x 1010 TU / mL idi. Paneller için A-E, çubuklar: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hazırlanan adenovirüsün transdüksiyon potansiyelini test etmek için dört hücre hattı kullanıldı: insan endotel hücreleri (EA.hy926), sığır aort endotel hücreleri (BAEC), murine hepatositler (Hepa 1-6) ve murine mezenkimal stromal hücreler (MSC). Endotel hücreleri (EA.hy926 ve BAEC) 25 TU/hücre ile, hepatositler 5 TU/hücre ile, MSC ise 250 TU/hücre ile transdüklenmiştir.
1.8 x 10 10 TU/mL'lik adenoviral süspansiyon kullanılarak3 x 10 6 hücreye 25TU/hücre ile bulaştırmak için gereken adenoviral süspansiyon hacminin nasıl hesaplandığının bir örneği aşağıda verilmiştir.
1 hücre için ................. 25 TU 3 x 106 hücre .............. x TU <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> x=75 x 106 TU Viral stok içeriyorsa 1.8 x 1010 TU .................... 1 mL 75 x 106 TU .................... y mL <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg"> y= 4,2 x 10-3 mL = 4,2μL viral stok
Transdüksiyondan 48 saat sonra hücreler floresan mikroskopi ile analiz edildi. Şekil 6'dagösterildiği gibi, insan veya sığır endotel hücreleri iyi verimlilikle transdüklenmiştir (~%50) 25 TU/hücre için(Şekil 6 EA.hy926 ve BAEC). Murine hepatositleri (Hepa 1-6) adenovirüs tarafından düşük miktarda adenovirüs parçacıklarında (5 TU/ hücre) verimli bir şekilde transdüklenmiştir, ancak daha yüksek oranda ölü hücre (PI-pozitif hücreler) kaydedildiği için adenovirüse karşı da hassastırlar (~%16) diğer hücre türlerine kıyasla. Mezenkimal stromal hücreler, spesifik adenoviral reseptörlerin (yayınlanmamış veriler) eksikliği nedeniyle en zor transdüse olan hücrelerdir (Şekil 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg"> Şekil 6: Transdüklenmiş hücrelerde adenovirüs enfektivitesi ve GFP ekspresyonunun indüksiyonu. İnsan endotel hücreleri (EA.hy926), sığır aort endotel hücreleri (BAEC), murine hepatositler (Hepa 1-6) ve murine mezenkimal stromal hücreler (MSC) belirtilen miktarda adenovirüs ile transdüklenmiştir. Floresan mikroskopi ile GFP sapsandı ve GFP pozitif hücrelerin yüzdesi akış sitometrisi ile analiz edildi. Akış sitometrisi ile belirlenen PI pozitif hücreler viral transdüksiyon ile belirlenen hücre mortalitesini gösterir. EA.hy926 hücreleri, sığır aort endotel hücreleri ve Hepa 1-6 hücreleri, %41 -52 arasında değişen transdüksiyon verimi olan adenovirüs tarafından yüksek oranda transdüksiyon edildi. MSC için, daha yüksek miktarda virüs (250 TU/hücre) transdüklenmiş hücrelerin sadece% 27 GFP pozitif indükledi. Çubuklar: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Adenovirus Production at JoVE.com

An Efficient Method for Adenovirus Production

Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Bükreş, Romanya'dan Nicolae Simionescu Hücresel Biyoloji ve Patoloji Enstitüsü'ne hoş geldiniz. Burada, Viral Transdüksiyon Laboratuvarı'nda, Profesör Vogelstein tarafından geliştirilen AdEasy sistemine dayanan optimize edilmiş bir metodoloji kullanarak adenoviral parçacık üretiminin bir kısmını gösteriyoruz. Bu adenovirüsleri üretmek için teknolojinin ana adımları, birincisi, BJ5183 bakterilerinde pAdEasy-1 plazmid ile GFP içeren pAdTrack'in yeniden birleşmesidir.İki, adenoviral parçacıkların paketlenmesi. Üç, AD293 hücrelerinde adenovirüs amplifikasyonu. Dört, adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.Beş, viral titrasyon ve adenovirüs fonksiyonel test. Burada, metodolojinin önemli bir adımını sunacağız. Adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.Adenovirüslerin saflaştırılması, virüs üreten hücrelerin ve ortamın toplanmasıyla başlar. AD293 hücreleri rekombinant plazmid ile trans enfekte edildi ve adenovirüs paketlendi. Daha sonra adenovirüs art arda gelen daha büyük kültürler tarafından güçlendirildi.Burada 25 T175 plaka elde ettik ve adenovirüslerin hücre lisatı ve kültür ortamından arındırılmasına başladık. İlk olarak, transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilen GFP'nin yeşil floresanını kontrol ettik. Hücreler hala bağlıysa, kültür çanağı dokunarak veya uzun bir kazıyıcı kullanarak onları ayıracağız.Hücreler ve ortam toplanır. Şişeler, Falcon tüplerinde de toplanan PBS ile yıkanır. Hücreler santrifüjleme ile peletlenir.Adenovirüslerin daha fazla arındırılması için hücre peletini ve ortamı saklayın. Bu adımda, hasat sürecini hızlandırmak için bir meslektaşının yardımı takdir edilir. Hücre peletı GFP ifadesi nedeniyle yeşildir.Pelet, hücrelerin bozulmasını kolaylaştıracak hipertonik Tris tamponunda yeniden biriktirilir. Hücre lizisi için sıvı nitrojen kullanıyoruz ve kuru gaz 37 dereceye kadar ısındı. Virüs zarar görene kadar üçten fazla döngü yapmayın.Hücre bozulmasının verimliliğini artırmak için hücre homojenizesini 23 kalibrelik bir şırınga iğnesi ile dikkatlice geçirin. Hücre lisatını 9.600 x g'da 12 dakika santrifüjleyin. Süpernatant'ı yeni tüplere geçirin ve peletleri atın.Ultracentrifuge ile daha fazla işlem için süpernatantı buz üzerinde tutun. Şimdi, hücrelerden salınan adenovirüsü izole etmek için kültür ortamını işliyoruz. Bunun için öncelikle gerekli miktarda amonyum sülfat ağırlıklandırıp kültür ortamının toplandığı şişeye ekliyoruz.Şişe, kristaller tamamen çözünene kadar kuvvetlice çalkalanır. Karışım oda sıcaklığında iki saat ve yarım boyunca inkübe edilir. Daha sonra çökeltmenin süspansiyonu Falcon tüplerine ayrılır.1,600 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant atılır ve pelet 10 milimolar Tris tamponunda yeniden atılır. Adenovirüsun saflaştırılmasına ultrasantrifüjleme adımı ile devam edilemezse, çökelti dört derecede birkaç gün tutulabilir, ancak sadece amonyum sülfatın çıkarılması için diyalizden sonra.Burada diyaliz adımını sunduk. Süspansiyonu daha önce ıslanmış bir kasete sokmak için şırınna kullanıyoruz. Numuneler dört derecede bir gecede 10 milimolar Tris tampona karşı çaprazlanmıştır.Saflaştırmanın son adımı, sezyum klorür süreksiz gradyanı üzerindeki ultracentrifugation adımı ile temsil edilir. Gradyanı oluşturmak için, ilk olarak, yüksek yoğunluklu sezyum klorür çözeltisinin üç mililitresini pipetleye alıyoruz. Bu tabakanın üzerine, üç mililitre düşük yoğunluklu sezyum klorür dökün.Hücre lisatından veya kültür ortamından adenoviral parçacık süspansiyonu daha sonra gradyanın üzerine bindirilir. Tüpler mineral yağ ile doldurulur ve SW41 kovalarında tanıtılır. Dengeden sonra, tüpler ultrasantrifüjde tanıtılan rotora simetrik olarak yüklenir.Santrifüj, 18 saat boyunca 35.000 RPM ve dört derece ara vermeden çalışır. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpler bantları hasat etmek için arkasında siyah bir kağıt bulunan bir standa yerleştirilir. Temiz üst faz ve hücre kalıntıları, ağartma çözeltisi ile bir atık konteynerinde atılır.Tam adenovirüs içeren en düşük bant pipet ucu ile hasat edilir ve steril bir Eppendorf tüpünde toplanır. Diyalizden sonra, viral süspansiyona% 4 son konsantrasyona sakkaroz eklenir ve viral aliquot eksi 80 derecede dondurulur. Sonuçlar bölümünde, elde edilen adenovirüs ile transdüklenmiş hücrelerde GFP ekspresyonını gösterdik.Transdüksiyondan 48 saat sonra GFP, floresan mikroskopi ile gösterildiği gibi transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilir. GFP ekspresyon hücrelerinin yüzdesi akış sitometrisi ile belirlenir. Hücre başına 25 transdüksiyon ünitesi ile transdüklenen insan ve sığır endotel hücrelerinin yaklaşık %50'si GFP pozitiftir.Hücre başına sadece beş transdüksiyon ünitesi kullanıldığında murine hepatositler için aynı transdüksiyon verimi elde edilmiştir, ancak bu hücre duyarlılığı nedeniyle daha yüksek mortalite ile ilişkilidir. Spesifik reseptörlerin düşük ekspresyasyonu nedeniyle mezenkimal stromal hücrelerin transdüksiyonu ile GFP ekspresyona indirgenmiştir. Sonuç açıklamalar.Adenoviral parçacıkları elde etmek için gereken süreyi, maliyetleri ve çabayı azaltmak için bu zahmetli teknolojiyi optimize ediyoruz. Hazırlanan adenovirüs çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilir ve ilgi geninin ekspresyonunun indüklesini sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix&#39;in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Kemik-implant Anchorage değerlendirmek için bir Geliştirilmiş Mekanik Test Metodu

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Üretim ve Monovalent Kuantum Noktalarının Hedefleme

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

Oyalama Osteogenesis fonksiyonel rejenere uyluk için önde gelen bir fare modeli için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...