Name: in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), der Krembil Foundation und des Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065) unterstützt. Sampath Kumar Loganathan ist Träger eines Stipendiums der Canadian Cancer Society (BC-F-16-31919).

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Toronto genehmigt und durchgeführt.
1. Entwerfen und Klonen von gepoolten CRISPR-Bibliotheken
<ol><li>Wählen Sie 4-5 sgRNAs aus, die auf Mausgene von Interesse aus Ressourcen wie dem Broad Institute sgRNA Designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) oder dem CHOPCHOP-Server (https://chopchop.cbu.uib.no) abzielen. Wählen Sie eine gleiche Anzahl von nicht-zielgerichteten sgRNAs...

<ol>
	<li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin.">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth.">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li><li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+squamous+cell+carcinoma:+an+epidemiological+review.">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li><li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pathway+network,+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas.">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods.">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).</li><li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas.">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knockout+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554 (2014).</li><li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics.">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li><li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice.">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li><li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma.">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR&#8211;mediated+direct+in+vivo+screening.">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR&#8211;mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508 (2018).</li><li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells.">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li></ol>

Die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde in In-vitro- und In-vivo-Studien häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und zellulären Prozessen eingesetzt. Die meisten In-vivo-Studien verwenden CRISPR/Cas9-Gen-editierte Zellen, die in ein Tiermodell (Allograft oder Xenograft) eingepfropft wurden. Während dies ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Krebsgenetik und zelluläre Funktionen zu studieren, fehlt es immer noch an der einheimischen Gewebemikroumgebung und könnte Wund- und/oder Immunreaktionen hervorrufen.
<p c...

Eine der Herausforderungen für die Krebsforschung in der postgenomischen Ära besteht darin, die riesige Menge an Genomdaten für kausale Genmutationen zu abbauen und Knoten im Gennetzwerk zu identifizieren, die therapeutisch anvisiert werden können. Während bioinformatische Analysen enorm dazu beigetragen haben, diese Ziele zu erreichen, ist die Etablierung effizienter In-vitro- und In-vivo-Modelle eine Voraussetzung, um die Komplexität biologischer Systeme und Krankheitszustände zu entschlüsseln und die Entwicklung von Arzneimitteln zu ermöglichen. Während herkömmliche transgene Mausmodelle ausgiebig für in vivo Krebsgenetik-Studien verwendet wurden, hat ihre kosten-, zeit- und arbeitsintensive Natur die systematische Analyse der Hunderte von vermeintlichen Krebsgenen, die durch die moderne Genomik entwirrt wurden, weitgehend verboten. Um diesen Engpass zu überwinden, kombinierten wir eine zuvor etablierte Ultraschall-geführte in der Utero-Injektionsmethodik1,2 mit einer CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Gen-Editing-Technologie3, um gleichzeitig Funktionsverlustmutationen von Hunderten von Genen in Haut und Mundhöhle einer einzelnen Maus zu induzieren und zu untersuchen.
Die hier beschriebene Methodik nutzt Ultraschall-geführte Injektionen von technisch hergestellten Lentiviren in die Fruchtwasserhöhle lebender Mausembryonen am Embryonaltag E9.5. Die lentivirale Ladung, die CRISPR/Cas9-Komponenten enthält, transduciert das einschichtige Oberflächenektoderm, das später das Epithel der Haut und der Mundhöhle hervorruft. Die Haut besteht aus einer äußeren Epidermis, gefolgt von Kellermembran und Dermis. Epidermis ist ein geschichtetes Epithel, das aus einer inneren Basalschicht besteht, die den Kontakt mit der Kellermembran aufrechterhält und eine proliferative und Stammzellkapazität hat. Die Basalschicht führt zu den differenzierten Schichten oben wie z.B. stachelförmigen, körnigen und stratum corneum Schichten2,4. Lineage-Tracing-Studien zeigen, dass diese direkte in vivo CRISPR/Cas9-Methode geweberesidente Stammzellen innerhalb der Basalschicht genetisch manipuliert, die während des gesamten Erwachsenenalters fortbestehen. Da lentivirus titriert werden kann, um das E9.5-Oberflächenektoderm bei klonaler Dichte zu transduzieren, kann diese Methode verwendet werden, um Mosaikmäuse zu erzeugen, die Tausende von diskreten Gen-Knock-out-Klonen beherbergen. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann dann verwendet werden, um die Wirkung der CRISPR/Cas9-vermittelten Genablation innerhalb dieser Klone in multiplexisierter Weise zu analysieren5.
Wir haben diese Methode vor kurzem verwendet, um die Funktion von 484 Genen zu bewerten, die wiederkehrende Mutationen im menschlichen Kopf- und Hals-Squamous-Zell-Karzinom (HNSCC)5zeigen. HNSCC ist eine verheerende Krebserkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate von 40–50% und sie ist die6. häufigste Krebsart weltweit6. HNSCC entstehen in Schleimhautauskleidungen der oberen Atemwege oder Mundhöhle und sind mit Tabak- und Alkoholkonsum oder einer Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) in Verbindung gebracht. Kutanes Plattenepithelkarzinom (SCC) sind Hauttumoren und stellen die zweithäufigste Krebsart beim Menschendar 7. Kutane SCC und HNSCC sind histologisch und molekular sehr ähnlich, mit einem hohen Prozentsatz von Fällen, die Veränderungen in TP53, PIK3CA, NOTCH1 und HRAS8aufweisen. Während es nur eine Handvoll Gene gibt, die mit hoher Frequenz mutiert sind, gibt es Hunderte von Genen, die mit niedriger Frequenz mutiert sind (< 5%), ein Phänomen, das gemeinhin als Long-tail-Verteilung bezeichnet wird. Da die Mehrheit der Longtail-Gene keine biologische oder klinische Validierung haben, haben wir diese in vivo CRISPR-Screening-Technologie verwendet, um Funktionsverlust dieser Gene bei tumorgefährdeten Mäusen mit sensibilisierenden Mutationen in p53, Pik3ca oder Hras zu modellieren und identifizierten mehrere neuartige Tumorsuppressorgene, die mit p53, Pik3ca oder Hras zusammenarbeiten, um die Tumorentwicklung auszulösen5.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA Bibliotheken und führen CRISPR/Cas9 Gen Knock-out-Screens in der MausOberfläche Ektoderm. Bemerkenswert ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um andere Genmanipulationstechnologien wie CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) und CRISPR-Inaktivierung (CRISPRi) zu integrieren oder modifiziert werden, um andere Organsysteme in der Maus zu zielen, um Genfunktionen zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron filter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2HVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12k or 92k oligo chip</td>
			<td>Customarray Inc. (Genscript)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293NT</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>LV900A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromic gut suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-cleanup kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MLS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Wisent Technologies</td>
			<td>800-011-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-prep plasmid Kit</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>PDH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse oxygen anaesthesia system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle sharpener</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo cleanup kit</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE purified illumina sequencing primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI (polyethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permoplast modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish with central opening</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Polymerase 2x Master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometric Quantification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semicircular Silicone plug</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2000 ultrasound system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity

Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) waren maßgeblich an der Beurteilung der Genfunktion, der Modellierung menschlicher Krankheiten und als präklinisches Modell zur Bewertung therapeutischer Wege beteiligt. Ihre zeit-, arbeits- und kostenintensive Natur schränkt jedoch ihren Nutzen für die systematische Analyse der Genfunktion ein. Jüngste Fortschritte in den Genom-Editing-Technologien überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen die schnelle Generierung spezifischer Genstörungen direkt in bestimmten Mausorganen in multiplexierter und schneller Weise. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9-basierte Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um Tausende von Gen-Knock-out-Klonen innerhalb des Epithels der Haut und der Mundhöhle von Mäusen zu erzeugen, und liefern ein Protokoll, das die Schritte beschreibt, die notwendig sind, um einen direkten in vivo   CRISPR-Bildschirm für Tumorsuppressorgene durchzuführen. Dieser Ansatz kann auf andere Organe oder andere CRISPR/Cas9-Technologien wie CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Inaktivierung angewendet werden, um die biologische Funktion von Genen während der Gewebehomöostase oder in verschiedenen Krankheitssituationen zu untersuchen.

Abbildung 1A zeigt das Design der Oligonukleotide zum Multiplexieren mehrerer benutzerdefinierter CRISPR-Bibliotheken auf kostengünstige Weise in einem einzigen 12k- oder 92k-Oligochip. Sobald die sgRNAs (blaue Farbe kodiert) ausgewählt sind, werden die Oligonukleotide mit Restriktionsstellen (orange farbene BsmBI) und bibliotheksspezifischen PCR-Primer-Paaren (grüne Farbe codiert) entworfen. Mehrere Bibliotheken können mit einer einzigartigen Kombination von Primerpaaren für Multiplexi...

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In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...