Name: in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט מהמכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR 365252), קרן קרמביל וקרן המחקר של אונטריו סבב מצוינות מחקר 8 (RE08-065). סמפת קומאר לוגנאתן הוא מקבל מלגת האגודה הקנדית למלחמה בסרטן (BC-F-16#31919).

פרוטוקול זה אושר ובוצע בהתאם ל- IACUC של אוניברסיטת טורונטו.
1. עיצוב ושיבוט של ספריות CRISPR במאגר
<ol><li>בחר 4-5 sgRNAs המכוונים לגנים של עכברים בעלי עניין ממשאבים כגון מעצב sgRNA של המכון הרחב (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) או שרת CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). בחר מספר שווה של sgRNAs שאי?...

<ol>
	<li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin.">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth.">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li><li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+squamous+cell+carcinoma:+an+epidemiological+review.">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li><li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pathway+network,+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas.">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods.">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).</li><li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas.">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knockout+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554 (2014).</li><li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics.">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li><li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice.">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li><li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma.">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR&#8211;mediated+direct+in+vivo+screening.">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR&#8211;mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508 (2018).</li><li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells.">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li></ol>

עריכת הגנום CRISPR/Cas9 הייתה בשימוש נרחב במחקרי הפריה חוץ גופית וב-vivo כדי לחקור תפקודי גנים ותהליכים תאיים. רוב מחקרי vivo משתמשים בתאים ערוכים בגן CRISPR/Cas9 המושתלים במודל של בעלי חיים (allograft או xenograft). אמנם זהו כלי רב עוצמה לחקר גנטיקה סרטן ותפקודים הסלולר, זה עדיין חסר microenvironment רקמה מקורית ועלול לע...

אחד האתגרים בחקר הסרטן בעידן הפוסט-גנומי הוא לכרות את הכמות העצומה של נתוני הגנום עבור מוטציות גנטיות סיבתיות ולזהות צמתים ברשת הגנים שניתן לסמן אותם כמטרה טיפולית. בעוד ניתוחים ביואינפורמטיים סייעו מאוד לקראת מטרות אלה, הקמת מודלים יעילים במבחנה וב-vivo היא תנאי מוקדם לפענוח המורכבות של מערכות ביולוגיות ומדינות מחלה ולאפשר פיתוח תרופות. בעוד מודלים קונבנציונליים של עכבר מהונדס שימשו בהרחבה למחקרים גנטיים של סרטן vivo, האופי שלהם עלות, זמן- ועבודה אינטנסיבית אסרה במידה רבה על ניתוח שיטתי של מאות גנים סרטניים putative נפרם על ידי גנומיקה מודרנית. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, שילבנו אולטרסאונד הוקמה בעבר מונחה במתודולוגיית הזרקת הרחם1,2 עם CRISPR / Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) טכנולוגיית עריכתגנים 3 בו זמנית לגרום וללמוד מוטציות אובדן תפקוד של מאות גנים בעור חלל הפה של עכבר אחד.
המתודולוגיה המתוארת כאן משתמשת בזריקות מונחות אולטרסאונד של lentiviruses מהונדסים לתוך חלל מי השפיר של עוברי עכבר חיים ביום העוברי E9.5. המטען העדני המכיל רכיבי CRISPR/Cas9 מתמר את האקטודרם בעל השכבות היחידות, אשר מאוחר יותר מעורר את האפיתל של העור וחלל הפה. העור מורכב מאפידרמיס חיצוני, ואחריו קרום מרתף ודרמיס. אפידרמיס הוא אפיתל מרובד המורכב משכבה פנימית בסיסית, השומרת על קשר עם קרום המרתף ויש לה יכולת רבייה ותא גזע. שכבת הבסיס מעוררת את השכבות המובחנות לעיל כגון שכבות קרנית ספיניות, פרטניות ושכבות2,4. מחקרי מעקב שושלת מראים כי שיטה ישירה זו ב- vivo CRISPR/Cas9 מבצעת מניפולציה גנטית בתאי גזע שוכני רקמות בתוך שכבת הבסיס הנמשכת לאורך כל הבגרות. כמו lentivirus ניתן titrated כדי לתמר את E9.5 פני השטח ectoderm בצפיפות שיבוט, שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור עכברי פסיפס מחסה אלפי שיבוטים נוק אאוט גן דיסקרטי. לאחר מכן ניתן להשתמש ברצף הדור הבא כדי לנתח את ההשפעה של אבלציה של גנים בתיווך CRISPR/Cas9 בתוך שיבוטים אלה באופן מרובה ערכים5.
לאחרונה השתמשנו בשיטה זו כדי להעריך את הפונקציה של 484 גנים המראים מוטציות חוזרות ונשנות בקרצינומה של תאי קשקש הראש והצוואר האנושיים (HNSCC)5. HNSCC הוא סרטן הרסני עם שיעור תמותה גבוה של 40-50% וזה הסרטןהשישי בשכיחותו בעולם6. HNSCC להתעורר רירית רירית של דרכי הנשימה העליונות או חלל הפה קשורים עם צריכת טבק ואלכוהול או זיהום וירוס הפפילומה האנושי (HPV). קרצינומה של תאי קשקש עוריים (SCC) הם גידולים בעור ומייצגים את הסרטן השני בשכיחותו בבני אדם7. SCC עורית ו HNSCC דומים מאוד מבחינה היסטולוגית מולקולרית, עם אחוז גבוה של מקרים המציגים שינוי TP53, PIK3CA, NOTCH1, ו HRAS8. אמנם יש רק קומץ גנים שעברו מוטציה בתדירות גבוהה, אך ישנם מאות גנים שנמצאו שעברו מוטציה בתדירות נמוכה (< 5%), תופעה הידועה בכינויה התפלגות הזנב הארוך. מכיוון שרוב הגנים ארוכי הזנב חסרים אימות ביולוגי או קליני, השתמשנו בטכנולוגיית ההקרנה in vivo CRISPR זו כדי מודל של אובדן תפקוד של גנים אלה בעכברים נוטים לגידולים עם מוטציות רגישות ב- p53, Pik3ca או Hras וזיהינו מספר גנים מדכאי גידולים חדשניים המשתפים פעולה עם p53, Pik3ca או Hras כדי לעורר התפתחות הגידול5.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ספריות sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA מרובות ולבצע CRISPR / Cas9 גנים לדפוק את המסכים באקטודרם משטח העכבר. שים לב, מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת לשלב טכנולוגיות אחרות מניפולציה גנים כגון הפעלת CRISPR (CRISPRa) ו CRISPR איון (CRISPRi) או שונה כדי למקד מערכות איברים אחרות בעכבר ללמוד פונקציות גנים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron filter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2HVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12k or 92k oligo chip</td>
			<td>Customarray Inc. (Genscript)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293NT</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>LV900A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromic gut suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-cleanup kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MLS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Wisent Technologies</td>
			<td>800-011-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-prep plasmid Kit</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>PDH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse oxygen anaesthesia system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle sharpener</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo cleanup kit</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE purified illumina sequencing primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI (polyethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permoplast modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish with central opening</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Polymerase 2x Master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometric Quantification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semicircular Silicone plug</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2000 ultrasound system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM) סייעו בהערכת תפקוד הגנים, מידול מחלות אנושיות, ושימשו מודל פרה-קולינרי להערכת אפיקים טיפוליים. עם זאת, האופי עתיר הזמן, העבודה והעלות שלהם מגביל את התועלת שלהם לניתוח שיטתי של תפקוד הגנים. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות לעריכת גנום מתגברת על מגבלות אלה ומאפשרת יצירה מהירה של הפרעות גנים ספציפיות ישירות בתוך איברי עכבר ספציפיים באופן מרובה פיקסלים ומהיר. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת CRISPR /Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) כדי ליצור אלפי שיבוטים נוקאאוט גנים בתוך האפיתל של העור חלל הפה של עכברים, ולספק פרוטוקול המפרט את השלבים הדרושים כדי לבצע מסך ישיר vivo   CRISPR עבור גנים מדכאי גידול. גישה זו יכולה להיות מיושמת על איברים אחרים או טכנולוגיות CRISPR/Cas9 אחרות כגון CRISPR-הפעלה או CRISPR-inactivation ללמוד את הפונקציה הביולוגית של גנים במהלך הומאוסטזיס רקמה או בהגדרות מחלה שונות.

איור 1A מציג את העיצוב של האוליגונוקלאוטידים עבור multiplexing מספר ספריות CRISPR מותאמות אישית באופן חסכוני בשבב אוליגו יחיד של 12k או 92k. לאחר בחירת sgRNAs (צבע כחול מקודד), האוליגונוקלאוטידים מעוצבים עם אתרי הגבלה (BsmBI בצבע כתום) וזוגות פריימר PCR ספציפיים לספריה (מקודדים בצבע ירוק). ניתן...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity at JoVE.com

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...