Name: in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), della Krembil Foundation e dell'Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan è il destinatario di una borsa di studio della Canadian Cancer Society (BC-F-16#31919).

Questo protocollo è stato approvato ed eseguito in conformità con la IACUC dell'Università di Toronto.
1. Progettazione e clonazione di librerie CRISPR in pool
<ol><li>Seleziona 4-5 sgRNA mirati ai geni del mouse di interesse da risorse come il progettista di sgRNA del Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) o il server CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Selezionare un numero uguale di sgRNA non mirati, ad esempio Sanjana e altri<su...

<ol>
	<li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin.">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth.">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li><li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+squamous+cell+carcinoma:+an+epidemiological+review.">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li><li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pathway+network,+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas.">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods.">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).</li><li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas.">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knockout+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554 (2014).</li><li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics.">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li><li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice.">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li><li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma.">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR&#8211;mediated+direct+in+vivo+screening.">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR&#8211;mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508 (2018).</li><li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells.">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li></ol>

L'editing del genoma CRISPR/Cas9 è stato ampiamente utilizzato in studi in vitro e in vivo per studiare le funzioni geniche e i processi cellulari. La maggior parte degli studi in vivo utilizza cellule modificate dal gene CRISPR/Cas9 innestate in un modello animale (allografto o xenograft). Sebbene questo sia un potente strumento per studiare la genetica del cancro e le funzioni cellulari, manca ancora del microambiente dei tessuti nativi e potrebbe provocare ferite e / o risposte immunitarie.
<p class="jove_content...

Una delle sfide per la ricerca sul cancro nell'era post-genomica è estrarre la grande quantità di dati genomici per le mutazioni geniche causali e identificare i nodi nella rete genica che possono essere mirati terapeuticamente. Mentre le analisi bioinformatiche hanno contribuito immensamente a raggiungere questi obiettivi, stabilire modelli efficienti in vitro e in vivo è un prerequisito per decifrare la complessità dei sistemi biologici e degli stati delle malattie e per consentire lo sviluppo di farmaci. Mentre i modelli convenzionali di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studi di genetica del cancro in vivo, la loro natura ad alta intensità di costi, tempo e lavoro ha ampiamente vietato l'analisi sistematica delle centinaia di geni del cancro putativo non rivelato dalla genomica moderna. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo combinato una tecnologia di editing genica guidata da ultrasuoni precedentemente stabilita nella metodologia di iniezione utero1,2 con una tecnologia di editing genico CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3 per indurre e studiare simultaneamente mutazioni di perdita di funzione di centinaia di geni nella pelle e nella cavità orale di un singolo topo.
La metodologia qui descritta utilizza iniezioni guidate da ultrasuoni di lentivirus ingegnerizzati nella cavità amniotica degli embrioni di topo viventi al giorno embrionale E9.5. Il carico lentivirale contenente componenti CRISPR/Cas9 trasduce l'ectoderma superficiale monostrato, che successivamente dà origine all'epitelio della pelle e della cavità orale. La pelle è composta da un'epidermide esterna, seguita da membrana basale e derma. L'epidermide è un epitelio stratificato composto da uno strato interno basale, che mantiene il contatto con la membrana basale e ha capacità proliferativa e cellulare. Lo strato basale dà origine agli strati differenziati sopra come strati spinosi, granulari e strato corneo2,4. Studi di tracciamento del lignaggio mostrano che questo metodo CRISPR/Cas9 in vivo diretto manipola geneticamente le cellule staminali residenti nei tessuti all'interno dello strato basale che persistono per tutta l'età adulta. Poiché il lentivirus può essere titolato per trasdurre l'ectoderma superficiale E9.5 a densità clonale, questo metodo può essere utilizzato per generare topi mosaico che ospitano migliaia di cloni discreti a knock-out genico. Il sequenziamento di nuova generazione può quindi essere utilizzato per analizzare l'effetto dell'ablazione genica mediata da CRISPR /Cas9 all'interno di tali cloni in modomultiplexato 5.
Recentemente abbiamo utilizzato questo metodo per valutare la funzione di 484 geni che mostrano mutazioni ricorrenti nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo umano (HNSCC)5. L'HNSCC è un cancro devastante con un alto tasso di mortalità del 40-50% ed è il6 ° cancro più comune in tutto ilmondo 6. L'HNSCC si presenta nei rivestimenti mucosi delle vie aeree superiori o della cavità orale e sono associati al consumo di tabacco e alcol o all'infezione da papillomavirus umano (HPV). Il carcinoma a cellule squamose cutanee (SCC) sono tumori della pelle e rappresentano il secondo tumore più comune nell'uomo7. Cutaneous SCC e HNSCC sono istologicamente e molecolarmente molto simili, con un'alta percentuale di casi che presentano alterazioni in TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS8. Mentre ci sono solo una manciata di geni mutati ad alta frequenza, ci sono centinaia di geni trovati mutati a bassa frequenza (< 5%), un fenomeno comunemente indicato come distribuzione a coda lunga. Poiché la maggior parte dei geni a coda lunga manca di convalida biologica o clinica, abbiamo utilizzato questa tecnologia di screening CRISPR in vivo per modellare la perdita di funzione di questi geni nei topi soggetti a tumore con mutazioni sensibilizzanti in p53, Pik3ca o Hras e identificato diversi nuovi geni soppressori del tumore che collaborano con p53, Pik3ca o Hras per innescare lo sviluppo tumorale5.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per generare librerie di sgRNA CRISPR lentivirale sgRNA multiplexato ed eseguire schermi di knock-out genico CRISPR / Cas9 nell'ectoderma della superficie del mouse. Da notare che questa metodologia può essere adattata per incorporare altre tecnologie di manipolazione genica come l'attivazione CRISPR (CRISPRa) e l'inattivazione CRISPR (CRISPRi) o modificata per indirizzare altri sistemi di organi nel topo per studiare le funzioni geniche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron filter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2HVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12k or 92k oligo chip</td>
			<td>Customarray Inc. (Genscript)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293NT</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>LV900A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromic gut suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-cleanup kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MLS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Wisent Technologies</td>
			<td>800-011-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-prep plasmid Kit</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>PDH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse oxygen anaesthesia system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle sharpener</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo cleanup kit</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE purified illumina sequencing primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI (polyethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permoplast modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish with central opening</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Polymerase 2x Master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometric Quantification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semicircular Silicone plug</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2000 ultrasound system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity

I modelli di topo geneticamente modificati (GEMM) sono stati fondamentali per valutare la funzione genica, modellare le malattie umane e servire come modello preclinico per valutare le vie terapeutiche. Tuttavia, la loro natura ad alta intensità di tempo, manodopera e costi limita la loro utilità per l'analisi sistematica della funzione genica. I recenti progressi nelle tecnologie di editing del genoma superano tali limitazioni e consentono la rapida generazione di specifiche perturbazioni geniche direttamente all'interno di specifici organi del topo in modo multiplexato e rapido. Qui, descriviamo un metodo basato su CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) per generare migliaia di cloni gene knock-out all'interno dell'epitelio della pelle e della cavità orale dei topi e fornire un protocollo che dettaglia i passaggi necessari per eseguire uno schermo CRISPR in vivo diretto per i geni   soppressori del tumore. Questo approccio può essere applicato ad altri organi o ad altre tecnologie CRISPR/Cas9 come l'attivazione CRISPR o l'inattivazione CRISPR per studiare la funzione biologica dei geni durante l'omeostasi tissutale o in vari contesti di malattia.

La figura 1A mostra la progettazione degli oligonucleotidi per il multiplexing di diverse librerie CRISPR personalizzate in modo conveniente in un singolo chip oligo da 12k o 92k. Una volta selezionati gli sgRNA (codificati a colori blu), gli oligonucleotidi sono progettati con siti di restrizione (BsmBI di colore arancione) e coppie di primer PCR specifiche della libreria (codificate a colori verdi). Diverse librerie possono essere progettate utilizzando una combinazione unica di coppie di ...

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In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Qui descriviamo una metodologia di screening CRISPR/Cas9 in vivo rapida e diretta utilizzando iniezioni lentivirali embrionali guidate da ultrasuoni in utero per valutare contemporaneamente le funzioni di diversi geni nella pelle e nella cavità orale dei topi immunocompetenti.

Screening CRISPR/Cas9 in vivo per valutare contemporaneamente la funzione genica nella pelle del topo e nella cavità orale

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