Name: in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00
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この研究は、カナダ保健研究所(CIHR 365252)、クレンビル財団、オンタリオ研究基金リサーチエクセレンスラウンド8(RE08-065)からのプロジェクト助成金によって支えられました。サンパス・クマール・ロガナタンは、カナダ癌学会フェローシップ(BC-F-16#31919)の受賞者です。

このプロトコルは承認され、トロント大学のIACUCに従って実行されました.
1. プールされたCRISPRライブラリの設計とクローン作成
<ol><li>ブロード・インスティテュートのsgRNAデザイナー(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)やCHOPCHOPサーバー(https://chopchop.cbu.uib.no)などのリソースから、関心のあるマウス遺伝子を標的とする4-5 sgRNAを選択します。例えば、...

<ol>
	<li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin.">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth.">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li><li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+squamous+cell+carcinoma:+an+epidemiological+review.">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li><li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pathway+network,+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas.">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods.">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).</li><li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas.">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knockout+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554 (2014).</li><li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics.">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li><li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice.">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li><li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma.">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR&#8211;mediated+direct+in+vivo+screening.">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR&#8211;mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508 (2018).</li><li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells.">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li></ol>

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、遺伝子機能や細胞プロセスを調べるインビトロおよびインビボ研究で広く使用されています。ほとんどの生体内研究では、動物モデル(同種移植片または異種移植片)に移植されたCRISPR/Cas9遺伝子編集細胞を利用しています。これは癌遺伝学と細胞機能を研究するための強力なツールですが、それはまだネイティブの組織微小環境を欠いているし、傷や免疫応答を引き出?...

ゲノム後のがん研究における課題の1つは、因果遺伝子変異のゲノムデータを大量に取り出し、治療的に標的とできる遺伝子ネットワーク内のノードを特定することです。バイオインフォマティクス分析はこれらの目標に非常に役立っていますが、効率的なインビトロおよびインビボモデルを確立することは、生物学的システムと疾患状態の複雑さを解読し、医薬品開発を可能にするための前提条件です。従来のトランスジェニックマウスモデルは、生体内がん遺伝学の研究に広く使用されてきましたが、そのコスト、時間、労働集約的な性質は、現代のゲノミクスによって解明された何百もの推定癌遺伝子の体系的な分析をほとんど禁止してきました。このボトルネックを克服するために、以前に確立された超音波誘導性子宮注射方法論1,2をCRISPR/Cas9(クラスター化された定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復)遺伝子編集技術3と組み合わせて、単一マウスの皮膚および口腔内の何百もの遺伝子の機能喪失変異を同時に誘導および研究した。
ここで説明する方法論は、胚性の日E9.5で生きているマウス胚の羊膜腔に工学的レンチウイルスの超音波誘導注射を利用する。CRISPR/Cas9成分を含むレンチウイルス貨物は、単層表面外膜をトランスデューシングし、後に皮膚の上皮および口腔を生じさせる。皮膚は外側の表皮で構成され、続いて膜と真皮が続く。表皮は、基底膜との接触を維持し、増殖および幹細胞能力を有する内層、基底層から構成される階層化された上皮である。基底層は、上記の分化層(例えば、棘、粒状および角層2、4)を生み出す。系統トレース研究は、この直接in vivo CRISPR/Cas9法が成人期を通じて持続する基底層内の組織に居住する幹細胞を遺伝的に操作することを示している。レンチウイルスは、クローン密度でE9.5表面外膜をトランスデューシングするために滴定することができるので、この方法は、何千もの離散遺伝子ノックアウトクローンを収容するモザイクマウスを生成するために使用することができる。次世代シーケンシングを使用して、それらのクローン内のCRISPR/Cas9媒介遺伝子アブレーションの効果を多重化した方法で分析することができます5.
我々は最近、この方法を用いて、ヒト頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)5における再発性突然変異を示す484遺伝子の機能を評価した。HNSCCは40-50%の高い死亡率を持つ壊滅的な癌であり、それは6番目に世界で最も一般的な癌である6番目に一般的な癌である6 .HNSCCは、上部気道または口腔の粘膜内層で生じ、タバコおよびアルコール消費量またはヒトパピローマウイルス(HPV)感染に関連している。皮膚扁平上皮癌(SCC)は皮膚腫瘍であり、ヒトにおける2番目に多い癌である7。皮SCCとHNSCCは、組織学的および分子的に非常に類似しており、TP53、PIK3CA、NOTCH1、およびHRAS8において変化を示す症例の割合が高い。高頻度で変異する遺伝子はほんの一握りですが、低周波(<5%)で変異した遺伝子は何百種類もあります。長い尾の遺伝子の大半は生物学的または臨床的検証を欠いているため、この生体内CRISPRスクリーニング技術を使用して、p53、Pik3caまたはHrasの感作突然変異を有する腫瘍発生しやすいマウスにおけるこれらの遺伝子の機能喪失をモデル化し、p53、Pik3caまたはHrasと協力するいくつかの新しい腫瘍抑制遺伝子を同定して腫瘍開発を開始した。
ここでは、多重化sgRNAレンチウイルスCRISPR sgRNAライブラリを生成し、CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトスクリーンをマウス表面エクストダームで行う詳細なプロトコルについて説明する。なお、この方法論は、CRISPR活性化(CRISPRa)やCRISPR不活性化(CRISPRi)などの他の遺伝子操作技術を組み込むために適応することができ、または遺伝子機能を研究するためにマウスの他の器官系を標的にするように改変することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron filter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2HVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12k or 92k oligo chip</td>
			<td>Customarray Inc. (Genscript)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293NT</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>LV900A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0290L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromic gut suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-cleanup kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60242-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MLS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Wisent Technologies</td>
			<td>800-011-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-prep plasmid Kit</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>PDH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse oxygen anaesthesia system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle sharpener</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo cleanup kit</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE purified illumina sequencing primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI (polyethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permoplast modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish with central opening</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Polymerase 2x Master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometric Quantification</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semicircular Silicone plug</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2000 ultrasound system</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo crispr/cas9 screening to simultaneously evaluate gene function in mouse skin and oral cavity

遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、遺伝子機能の評価、ヒト疾患のモデル化、治療手段の評価のための前臨床モデルとしての役割を果たしてきました。しかし、時間、労力、コストを要する性質は、遺伝子機能の体系的な分析のための有用性を制限します。ゲノム編集技術の最近の進歩は、これらの限界を克服し、多重化された迅速な方法で特定のマウス器官内で直接特異的な遺伝子摂動の迅速な生成を可能にする。ここでは、CRISPR/Cas9ベースの方法(クラスター化された定期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復)を用いて、マウスの皮膚および口腔の上皮内に何千もの遺伝子ノックアウトクローンを生成し、腫瘍抑制遺伝子に対して直接in vivo CRISPRスクリーンを実行するために必要な手順を詳述するプロトコルを提供する   。このアプローチは、他の臓器またはCRISPR活性化やCRISPR不活性化などの他のCRISPR/Cas9技術に適用して、組織ホメオスタシス中または様々な疾患の設定における遺伝子の生物学的機能を研究することができます。

図1Aは 、1つの12kまたは92kオリゴチップで費用対効果の高い方法で複数のカスタムCRISPRライブラリを多重化するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す。sgRNA(青色の色がコード化された)を選択すると、オリゴヌクレオチドは制限部位(オレンジ色のBsmBI)およびライブラリ固有のPCRプライマーペア(緑色コード化)で設計されます。いくつかのライブラリは、単一のオリゴチ?...

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In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo CRISPR/Cas9スクリーニング方法論を説明し、免疫担当マウスの皮膚および口腔内のいくつかの遺伝子の機能を同時に評価する。

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Research

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Genetics

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QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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