Name: preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00
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Nous reconnaissons l’installation de cytométrie de flux de base d’analyse cellulaire de microscopie de la Clinique Mayo pour l’aide au tri facs.

Toutes les procédures expérimentales pour animaux ont été effectuées sous approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo.
1. Préparation de la solution 
<ol><li>Préparer la solution collagène 2% (w/v) en dissolvant la collagène II 2 g dans la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks de 100 mL. Aliquot 200 μL chacun pour chaque utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu de neutralisation en mélangeant 84 mL...

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l...

Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et le dysfonctionnement de tissu - y compris l’hypoxie, l’inflammation, et la résistance à l’insuline -développe souvent 3,4. Ces complications sont des facteurs de risque de nombreuses maladies chroniques, y compris l’hypertension, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux et le cancer5. Par conséquent, la limitation de l’expansion incontrôlée des tissus adipeux et l’atténuation des pathologies tissulaires adipeux sont les principales priorités de recherche biomédicale. Au cours de l’expansion des tissus adipeux, les cellules souches adipeuses résidentes dérivées des tissus prolifèrent et se différencient séquentiellement en préadipocytes (cellules progénitrices engagées) puis en adipocytes matures6. Des études récentes sur le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) montrent que ces populations de cellules progénitrices adipeux (APC) (ASC et préadipocytes) présentent une hétérogénéité moléculaire et fonctionnellesubstantielle 7,8,9,10,11,12. Par exemple, les ASC affichent une capacité de différenciation adpogénique réduite, tout en présentant des capacités de prolifération et d’expansion plus élevées, par rapport aux préadipocytes7. D’autres différences moléculaires sont rapportées au sein des populations de NC et de préadipocytes, bien que la pertinence fonctionnelle de ces différences restepeu claire 7. Ensemble, ces données mettent en évidence la complexité du pool de cellules progénitrices adipeux et soulignent la nécessité de mettre au point et de normaliser des outils pour mieux comprendre et manipuler ces populations cellulaires critiques.
Ce protocole détaille l’isolement des populations de cellules progénitrices épididymales à haute viabilité Sca1+ adipose provenant de tampons graisseux épididymaux de souris qui conviennent aux analyses sensibles en aval, y compris les études à cellules simples (scRNA-séquençage) et la culture cellulaire. L’isolement et la dissociation des garnitures épididymales de graisse ont été exécutéscomme précédemment décrit 7,13 avec de légères modifications qui améliorent la viabilité des APC isolés. En bref, les cellules dissociées des adipeuses épididymales sont tachées d’anticorps contre Sca1, un marqueur pour les ASC et les préadipocytes6,7, et d’autres marqueurs de lignée (Lin) : Ter119 (cellules érythroïdes), CD31 (cellules endothéliales) et CD45 (leucocytes). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- les cellules sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Fait important, ce protocole a été validé par l’isolement et l’analyse réussis des cellules progénitrices viables de Sca1++/Lin- adipeuses rapportées dans une étude récente de séquençage d’ARN unicellulaire qui a identifié des sous-populations fonctionnellement hétérogènes dans les ASCs et les préadipocytes7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.

Des souris FVB mâles de quatre mois ont été employées dans cette expérience. Après l’exclusion des débris et des doublets à l’aide de parcelles FSC/SSC, des cellules viables (DAPI- population) ont été fermées, suivies de la sélection d’APC+/FITC- population (figure 1). Les portes DAPI, APC et FITC ont été dessinées en fonction du contrôle non taché. Les stratégies de gating sont indiquées dans la figure 1...

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Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

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