Name: preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

אנו מכירים את מאיו קליניק מיקרוסקופיה ניתוח תאים הליבה Cytometry מתקן לסיוע עם מיון FACS.

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק.
1. הכנת פתרון 
<ol><li>הכן קולאז 2% (w / v) פתרון על ידי המסת קולגנאז II 2 גרם ב 100 מ"ל הנקס' פתרון מלח מאוזן (HBSS). Aliquot 200 μL כל אחד לכל שימוש.</li>
	<li>הכן מדיום נטרול על ידי ערבוב 84 ...

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

רצף RNA של תא יחיד (scRNA-seq) צובר תאוצה במהירות ככלי רב עוצמה לחקור בו זמנית אוכלוסיות תאים מגוונות ברמת התא הבודד. בשל עלויות גבוהות הקשורות להכנת מדגם רצף תפוקה גבוהה, זה הכרחי כדי לייעל את התשומות הסלולר (כדאיות גבוהה וטוהר) כדי להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. פרוטוקולים מסוימים להכנת תאי...

רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן1,2. במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתיםקרובות 3,4. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלידם, שבץמוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytesבוגרת 6. מחקרים אחרונים על רצף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית7,8,9,10,11,12. לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes7. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור7. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1+ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן7,13 עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ"שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes6,7, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1+/Ter119קיימא -/CD31-/CD45-/DAPI- תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1+/ Linקיימא - תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

השמנת יתר והפרעות מטבוליות כגון סוכרת, מחלות לב וסרטן, כולם קשורים לשיפוץ דרמטי של רקמת השומן. תאים אב שומן תושב רקמה (נגמ"שים) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס רקמת שומן והוא יכול לתרום פתולוגיה רקמה. השימוש הגובר בטכנולוגיות ניתוח תאים בודדים – כולל רצף רנ"א חד-תאי ופרוטאומיקה של תא יחיד – משנה את שדה תאי הגזע/אב בכך שהוא מאפשר רזולוציה חסרת תקדים של שינויים בודדים בביטוי התא בהקשר של שינויים באוכלוסייה או ברקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח רקמת שומן אפידימלית של העכבר, לבודד תאים בודדים שמקורם ברקמת שומן, ולבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להעשיר עבור Sca1+/CD31קיימא -/CD45-/Ter119- נגמ"שים. פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים להכין נגמ"שים באיכות גבוהה המתאימים לניתוחים במורד הזרם כגון רצף RNA של תא יחיד.

בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים. לאחר הדרה של פסולת וכפולים באמצעות חלקות FSC / SSC, תאים קיימא (DAPI- אוכלוסייה) היו מגודרים, ואחריו הבחירה של APC+/ FITC- אוכלוסייה (איור 1). שערי DAPI, APC ו- FITC צוירו בהתבסס על הפקד הבלתי מוכתם. אסטרטגיות גטינג מוצגות <...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Research

JoVE Journal

Biology

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

זיהוי וניתוח של מחסני עכבר מגוונים

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

הערכה של תגובתיות וסקולרית באמצעות העורקים המבודדים הבודדים באמצעות התמקדות באפנון על ידי פריסקולרית של הרקמות

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

בידוד, שגשוג והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...