Name: preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Мы признаем, клиники Майо микроскопии клеточного анализа основного потока цитометрии фонда за помощь в сортировке FACS.

Все экспериментальные процедуры для животных были проведены в соответствии с утверждением Комитета по институциональному уходу и использованию животных клиники Майо.
1. Подготовка решения 
<ol><li>Приготовьте коллагеназу 2% (w/v) раствор путем растворения коллаген...

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Одноклеточное секвенирование РНК (scRNA-seq) быстро набирает обороты в качестве мощного инструмента для одновременного изучения различных популяций клеток на уровне одной клетки. Из-за высоких затрат, связанных с подготовкой образца и высокой пропускной способностью секвенирования, край...

Жировая ткань играет ключевую роль в энергетическом метаболизме. Избыток энергии хранится в виде липидов, а жировая ткань способна значительно расшириться или опровержения в зависимости от питательного статуса и энергетического спроса. Расширение жировой ткани может быть результатом увеличения размера адипоцитов (гипертрофия) и/или увеличения числа адипоцитов (гиперплазия); последний процесс жестко регулируется пролиферацию и дифференциацию жировых клеток-предшественников1,2. Во время ожирения жировая ткань чрезмерно расширяется, а дисфункция тканей, включая гипоксию, воспаление и резистентность кинсулину, часто развивается 3,4. Эти осложнения являются факторами риска многих хронических заболеваний, включая гипертонию, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт ирак 5. Таким образом, ограничение неконтролируемого расширения жировой ткани и смягчение патологий жировой ткани являются главными приоритетами биомедицинских исследований. Во время расширения жировой ткани, резидентов жировой ткани полученных стволовых клеток (ASCs) размножаются и дифференцировать последовательно в preadipocytes (совершенные клетки-предшественники), а затем в зрелые адипоциты6. Недавние одноклеточные РНК-секвенирования (scRNA-seq) исследованияпоказывают,что эти жировые клетки-предшественники (APC) популяций (ASCs и preadipocytes) обладают существенной молекулярнойи функциональной неоднородностью 7,8,9,10,11,12. Например, ASCs отображают уменьшенную адипогенную способность дифференциации, в то же время показывая более высокие возможности распространения и расширения, по сравнению с предадипоцитами7. Дальнейшие молекулярные различия сообщаются в популяциях ASC и preadipocyte, хотя функциональная актуальность этих различий остается неясной7. Вместе эти данные подчеркивают сложность жирового пула клеток-предшественников и подчеркивают необходимость разработки и стандартизации инструментов для лучшего понимания и управления этими критическими популяциями клеток.
В этом протоколе подробно рассматривается изоляция высокой жизнеспособности Sca1- жировых популяций клеток-предшественников от эпидидимальных жировых прокладок мыши, которые подходят для чувствительных анализов ниже по течению, включая одноклеточные исследования (секвенирование секвенирования) и клеточной культуры. Изоляция и диссоциация эпидидимальных жировых прокладокбыла выполнена, как описано ранее 7,13 с небольшими изменениями, которые улучшают жизнеспособность изолированных БТР. Короче говоря, диссоциированные клетки от эпидидимальных жировых подушечек окрашены антителами против Sca1, маркером как дляASCs,так и дляпредадипоцитов 6,7и других маркеров линии (Lin): Ter119 (эритроидные клетки), CD31 (эндотелиальные клетки) и CD45 (лейкоциты). ЖизнеспособныйSca1/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- клетки затем сортируются по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Важно отметить, что этот протокол был подтвержден успешной изоляции и анализа жизнеспособныхSca1/Lin - жировыеклетки-предшественники сообщили в недавнем исследовании секвенирования одноклеточной РНК, которые определили функционально неоднородных субпопуляций в ASCs и preadipocytes7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

Ожирение и нарушения обмена веществ, такие как диабет, болезни сердца и рак, все связаны с драматическим жировой ткани ремоделирования. Ткань-резидент жировой клетки-предшественники (АПК) играют ключевую роль в жировой ткани гомеостаза и может способствовать патологии тканей. Растущее использование технологий анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточное РНК-секвенирование и одноклеточную протеомику, преобразует поле стволовых/прагениторных клеток, позволяя беспрецедентное разрешение отдельных изменений экспрессии клеток в контексте демографических или тканевых изменений. В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для вскрытия эпидидимальной жировой ткани мыши, изолируем одиночные клетки, полученные из жировой ткани, и выполняем флуоресценцию активированной клеточной сортировки (FACS) для обогащения для жизнеспособногоSca1/CD31-/CD45-/Ter119- БТР. Эти протоколы позволят следователям подготовить высококачественные БТР, пригодные для анализа ниже по течению, такие как секвенирование одноклеточной РНК.

В этом эксперименте использовались четырехмесячные самцы FVB-мышей. После исключения мусора и дублетов с использованием участков FSC/SSC, жизнеспособные ячейки (DAPI- население) были закрыты, а затемвыборБТР /FITC- население(рисунок 1). Ворота DAPI, APC и FITC были нар?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Мы представляем простой метод, чтобы изолировать весьма жизнеспособные клетки-предшественники жировой клетки из мыши эпидидимальных жировых подушечек с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток.

Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Research

JoVE Journal

Biology

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Идентификация и вскрытие различных мышь жировые склады

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Оценка сосудистого тонуса реагирования с использованием изолированных Мезебарных артерий с акцентом на модуляции Периваскулярных жировых тканей

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Выделение, пролиферация и дифференциация стволовых клеток, полученных из адипозы макаки-резуса

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Выделение и идентификация эндотелиальных клеток сосудов из различных жировых депо для последующих применений

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...