Name: preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

FACS sıralama konusunda yardım için Mayo Clinic Mikroskopi Hücre Analizi Çekirdek Akış Sitometri Tesisi'ni kabul ediyoruz.

Tüm hayvan deneysel işlemleri Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanarak gerçekleştirildi.
1. Çözelti hazırlama 
<ol><li>Kollajenaz II 2 g'ı 100 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) çözerek kollajenaz% 2 (w/v) çözeltisi hazırlayın. Her kullanım için aliquot 200 μL her biri.</li>
	<li>84 mL F-12 orta, 15 mL at serumu ve 1 mL penisilin/streptomisisini karıştırarak nötralizasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<...

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), tek hücre düzeyindeki çeşitli hücre popülasyonlarını aynı anda incelemek için güçlü bir araç olarak hızla çekiş kazanıyor. Numune hazırlama ve yüksek verim sıralaması ile ilişkili yüksek maliyetler nedeniyle, deneysel başarı olasılığını artırmak için hücresel girdileri (yüksek canlılık ve saflık) optimize etmek zorunludur. Bazı hücre hazırlama protokolleri, FACS sıralama14olmadan düşük dönüşlü yıkamalar ve sü...

Yağ dokusu enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Fazla enerji lipitler şeklinde depolanır ve yağ dokusu beslenme durumuna ve enerjik talebe bağlı olarak önemli genişleme veya geri çekilme yeteneğine sahiptir. Yağ dokusunun genişlemesi adiposit boyutundaki (hipertrofi) ve/veya adiposit sayısındaki (hiperplazi) artıştan; ikinci süreç, yağ progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması ile sıkı bir şekilde düzenlenir1,2. Obezite sırasında, yağ dokusu aşırı genişler ve hipoksi, iltihaplanma ve insülin direnci de dahil olmak üzere doku disfonksiyonu genellikle3,4gelişir. Bu komplikasyonlar hipertansiyon, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, inme ve kanser dahil olmak üzere birçok kronik hastalık için risk faktörleridir5. Bu nedenle, kontrolsüz yağ dokusu genişlemesini sınırlamak ve yağ dokusu patolojilerini azaltmak en önemli biyomedikal araştırma öncelikleridir. Yağ dokusu genişlemesi sırasında, yerleşik yağ dokusundan türetilmiş kök hücreler (ASC'ler) çoğalır ve sırayla preadipositlere (taahhüt edilen progenitör hücreler) ve daha sonra olgun adipositlere farklılaşır6. Son tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) çalışmaları, bu yağ progenitör hücre (APC) popülasyonlarının (ASC'ler ve preadipositler) önemli moleküler ve fonksiyonel heterojenlik 7,8 ,9,10,11,12. Örneğin, ASC'ler daha az adipojenik farklılaşma kapasitesi gösterirken, preadipositler7'yekıyasla daha yüksek çoğalma ve genişletme yetenekleri de sergiler. ASC ve preadiposit popülasyonlarında daha fazla moleküler farklılıklar bildirilmektedir, ancak bu farklılıkların işlevsel ilgisi belirsizliğini korumaktadır7. Birlikte, bu veriler yağ progenitor hücre havuzunun karmaşıklığını vurgular ve bu kritik hücre popülasyonlarını daha iyi anlamak ve manipüle etmek için araçlar geliştirme ve standartlaştırma ihtiyacının altını çizer.
Bu protokol, tek hücreli çalışmalar (scRNA-dizileme) ve hücre kültürü de dahil olmak üzere hassas aşağı akış analizleri için uygun olan fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek canlılık Sca1+ yağ progenitör hücre popülasyonlarının izolasyonunun ayrıntılarını içerir. Epididimal yağ pedlerinin izolasyonu ve ayrışması, izole APC'lerin uygulanabilirliğini artıran hafif değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi7,13 olarak gerçekleştirildi. Kısacası, epididimal yağ pedlerinden ayrışmış hücreler, hem ASC'ler hem de preadipositler6,7ve diğer soy (Lin) belirteçleri için bir belirteçolanSca1'e karşı antikorlarla lekelenir: Ter119 (eritroid hücreler), CD31 (endotel hücreleri) ve CD45 (lökositler). Uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- hücreler daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile sıralanır. Daha da önemlisi, bu protokol, ASC'ler ve preadipositler içinde fonksiyonel olarak heterojen subpopulasyonları tanımlayan yeni bir tek hücreli RNA dizileme çalışmasında bildirilen uygulanabilir Sca1+/ Lin- yağ progenitör hücrelerinin başarılı izolasyonu ve analizi ile doğrulanmıştır7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

Obezite ve diyabet, kalp hastalığı ve kanser gibi metabolik bozuklukların tümü dramatik yağ dokusu tadilatı ile ilişkilidir. Doku bazlı yağ progenitör hücreler (APC' ler) yağ dokusu homeostazında önemli bir rol oynar ve doku patolojisine katkıda bulunabilir. Tek hücreli RNA dizilimi ve tek hücreli proteomik dahil olmak üzere tek hücreli analiz teknolojilerinin artan kullanımı, popülasyon veya doku çapındaki değişiklikler bağlamında bireysel hücre ifade değişikliklerinin benzeri görülmemiş bir şekilde çözülmesine izin vererek kök/progenitör hücre alanını dönüştürmektedir. Bu yazıda, fare epidimal yağ dokusunu parçalamak, tek yağ dokusundan türetilmiş hücreleri izole etmek ve uygulanabilir Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC'ler için zenginleştirmek için floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, araştırmacıların tek hücreli RNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için uygun yüksek kaliteli APC'ler hazırlamalarını sağlayacaktır.

Bu deneyde dört aylık erkek FVB fareleri kullanıldı. FSC/SSC arazileri kullanılarak enkaz ve çiftlerin dışlanmasından sonra, uygulanabilir hücreler (DAPI- popülasyon) kapılıydı, ardından APC+/ FITC- popülasyon seçimi (Şekil 1). DAPI, APC ve FITC kapıları, tespit edilmemiş kontrole göre çizildi. Gating stratejileri Şekil 1'de gösterilmiştir.
1 saat sıralamadan sonra, izolasyon...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Research

JoVE Journal

Biology

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Çeşitli fare Adipose depoları tanımlama ve diseksiyon

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Perivasküler Adipose dokularında modülasyon odaklı Izole mezenterik arterlerin kullanıldığı vasküler ton tepkisini değerlendirmek

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Rhesus Macaque Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu, Proliferasyonu ve Farklılaşması

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vasküler Endotel Hücrelerinin Aşağı Akış Uygulamaları için Farklı Yağ Depolarından İzolasyonu ve Tanımlanması

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...