Name: dry root rot disease assays in chickpea: a detailed methodology
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00
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M.S.Kラボのプロジェクトは、国立植物ゲノム研究所のコア資金によって支援されています。VI は、DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430) を確認します。研修生のリシカさん、ジャヤチェンドラヤンさん、ドゥルガデヴィさんはビデオ撮影中の技術的な助け、サンディープ・ディクシット氏、アンジャリさん、アヴァニシュ・ライ博士が生データと原稿ファイルを批判的に評価してくれたことに感謝します。ラヒム・H・タラフダル氏とサンダー・ソランキ氏の研究室での支援に感謝します。我々は、プラント成長支援/スペースのためのe資源およびNIPGR植物成長施設へのアクセスを提供するDBT-eLibraryコンソーシアム(DeLCON)およびNIPGRライブラリを認める。

1. R. バタチコラ とストレージの分離
<ol><li>ひよこ豆遺伝子型とDRR症状の詳細<ol>
<li>一般的に典型的なDRR症状を示すひよこ豆植物(遺伝子型、JG62)を用いて、樹皮の下およびピス1、3の下に横根と微小動脈を持たない乾燥した脆い原根のような一般的なDRR症状を示す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>収集と洗浄<ol>
<li>乾燥したわら色の葉膜や表皮層の下に微...

<ol>
	<li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+root+rot+(Rhizoctonia+bataticola+(Taub.)+Butler):+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand.">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li><li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea.">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li><li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chickpea+diseases:+resistance+screening+techniques,+information+bulletins+No.+10.+Patancheru.">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li><li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea.">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li><li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits.">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants.">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li><li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research.">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li><li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).</li><li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia.">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li><li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li><li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes.">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li><li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition.">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).</li></ol>

ブロッティングペーパー技術は、実験室の条件下でひよこ豆遺伝子型をスクリーニングするための簡単なアプローチを提供します。浸出接種は、接種負荷を容易に制御して時間ベースで相互作用を調査し、インビトロスクリーニングを容易にする。さらに、若い苗も使用できます。5日前の真菌培養(図1B)は、植物に感染するのに十分な接種を生じることがで...

乾燥した根腐れ(DRR)は、ひよこ豆1、2の経済的に重要な疾患の一つである。これは、根性バタチコーラ(テレオモーフ、マクロフォミナフェイショウチリーナ)によって引き起こされる根特異的疾患である。感染した植物は横根を欠き、脆いタップルートと黄色の葉1、3を所有しています。干ばつストレス下のDRRは、ひよこ豆栽培1、2、3に対する新たな脅威であると報告されている。さらに、DRRの発生率は、フィールド条件1、2、3の下で干ばつストレス下で悪化すると報告されている。DRRは、灌漑されたフィールド4よりも雨の多い地域で一般的です。耐性品種の利用は、病気を克服し、殺菌剤の使用を回避する方法です1,13.世界中で利用可能なひよこ豆の生殖器は、形質5の遺伝的変異を抱えているため、作物改善のための分子繁殖には耐性/感受性遺伝子型のスクリーニングおよび同定が重要である。
ひよこ豆のR.バタチコラ感染パターンを調査するには、堅牢で簡単で費用対効果の高い疾患アッセイが不可欠です。R.バタチコラ感染症に対するひよこ豆遺伝子型の応答を観察するために使用される主要な疾患アッセイは、ブロッティングペーパー技術1,4である。それは簡単な技術であり、液体真菌の接種、根を持つ苗、および無菌ブロッティング紙を使用して実行することができる。しかし、この技術は、文献で利用できるステップバイステッププロトコルがないため、最大限に活用されていません。
一方、シックポット技術は、潜在的な病気の文化の準備と干ばつストレスの賦課を含みます。干ばつストレスがDRR病の発生率を悪化させることを考えると、干ばつストレス6、7の下で植物病原体の相互作用を研究することが不可欠である。シックポット技術は、このような同時研究のためのプラットフォームを提供し、胚芽スクリーニングのためのより良い可能性を促進し、相互作用の機械主義的基礎を理解する。DRR病に固有の根長の増加や横根数の減少などの病態変化は、シックポット手法1、3、7を使用して対処することができる。
本明細書において、ひよこ豆と R.バタチコラ とスクリーンひよこ豆の細菌との相互作用を研究するために使用することができる紙およびシックポット技術をブロッティングするための詳細なプロトコルが提示される。研究で使用される材料の詳細は、材料表に示されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fungus- Rhizoctonia bataticola</td>
			<td>Pathogen inoculum</td>
			<td>Indian Type Culture Collection No. 8365</td>
			<td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38; id=1251&#38;Itemid=1370)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soilrite mix</td>
			<td>Soil medium in the lab</td>
			<td>Keltech Energies Limited, Bangalore, India</td>
			<td>http://www.keltechenergies.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Blotting paper to support the plant growth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pot</td>
			<td>Growing plants</td>
			<td>10 and 30 cm size pots</td>
			<td>Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar/broth</td>
			<td>Culture and maintain the fungus</td>
			<td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Culture the fungus</td>
			<td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker</td>
			<td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Growing plants in controlled condition</td>
			<td>Model No. A1000, Conviron, Canada</td>
			<td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar airflow</td>
			<td>Carrying out aseptic exercises</td>
			<td>Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000</td>
			<td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Filtering the fungal mycelia</td>
			<td>Nylon mosquito net</td>
			<td>Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Autoclaving media and chickpea seeds</td>
			<td>Autoclave</td>
			<td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>Visualizing the infection ang fungal mycelia</td>
			<td>SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 
			https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ 
			https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Weighing fungus and chemicals</td>
			<td>Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW</td>
			<td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WGA-FITC</td>
			<td>Fungus staining</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&#38;region=IN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Fungus staining</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dry root rot disease assays in chickpea: a detailed methodology

乾燥した根腐れ(DRR)病は、世界中のひよこ豆栽培に対する新たな生物ストレスの脅威です。これは、土壌媒介性真菌病原体、 根支バタチコラによって引き起こされます。文献では、疾患アッセイに関する包括的かつ詳細なステップバイステップのプロトコルはまばらである。この記事では、DRRに対する耐性の遺伝子型をすばやくスクリーニングするためのブロッティングペーパー技術の設定に関する手順の詳細を提供します。ブロッティング紙の技術は簡単で安価です。病気のポットアプローチに基づくもう 1 つの方法は、自然感染の模倣であり、疾患の三角形に関与する相互作用コンポーネント(植物、病原体、および環境)を研究するために適用することができます。
さらに、自然界では、DRRは主に雨が降ったひよこ豆栽培地域で発生し、作物の成長が進むにつれて土壌水分が後退します。干ばつストレスは、DRR病にひよこ豆植物を素因とすることが知られています。干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態および分子的理解は、ひよこ豆の生殖器プールからのエリートDRR耐性品種の同定のための道を開くことができる。本稿では、病的なポットの調製とその後の疾患アッセイのための段階的な方法論を提供する。全体として、本明細書に提示された情報は、研究者が R.バタチコラ 真菌接種を準備し、この病原体を維持し、ブロッティングペーパー技術を設定し、病気の培養および病気のポットを準備し、ひよこ豆植物における病原体感染を評価するのに役立ちます。

本研究は、干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態形態および分子理解を促進するための、ブロッティング紙やシックポット技術などの技術を実証することを目的とした。これを達成するために、DRR症状1、3、4を呈する植物をひよこ豆場から採取し、真菌を催眠先端法8を用いて単離した。<e...

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Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

本研究では、ひよこ豆-根支バタチコラ 相互作用の根底にある病態分子メカニズムを研究する方法論を提示する。ブロッティングペーパー法は、ひよこ豆遺伝子型応答を迅速に研究するのに有用であり、病気のポットベースの方法は、同時に干ばつと R.バタチコラ 感染を課し、寛容な遺伝子型のスクリーニングに使用することができます。

ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

本研究の主な目的は、ブロッティングペーパー技術やシックポット技術などの乾燥根腐敗病アッセイの詳細な方法論を実証することです。これらの技術は、ひよこ豆植物と根支バタチコーラの相互作用を研究するのに役立ちます.真菌病原体根動物症バタチコラとのひよこ植物の相互作用を理解することは、農業上重要です。そのためには、汎用性と再現性の高いアッセイが必要です。ここでは、研究室で広く使用されている2つのアッセイを示します。そのうちの一つは紙ベースのブロッティングであり、もう1つは病気のポットベースのアッセイです。ブロッティング紙アッセイを実行するには、斜め培養からペトリプレート、そして液体培養にスケールアップして根茎バタチコラ菌接種を調製します。ひよこ豆の保育園を準備し、大きな鍋に種をまきます。それらを根こそぎにして液体接種に入れ、ブロッティング紙の上に置きます。病気の症状、すなわち、根の壊死、根腐れ、葉の黄変を接種の8日後に観察する。ここに示されているのは、紙の技術をブロッティングするステップです。病気のポットアッセイを実行するには、真菌でひよこ豆の食事を接種します。摂氏30度で15日間インキュベーションした後、病気の文化が得られる。その後、それらを粉末にし、ポットミックスと混合します。コントロールポットと病気のポットに種をまきます。次の日に、症状、すなわち根の壊死、根腐れ、および感染した植物の葉の黄変を観察し、播種の10日後に。病気の鍋はスケールアップすることができ、大規模なスクリーニングのために使用することができる。ここに示されているシックポット技術のステップの一言です。根支バタチコラは、開発病原体です。この真菌は、植物感染中に主要なイヌクルとして機能するヒファエおよびミクロクレローティアを産生する。このアイソシエテ法を通じて適用される純粋な培養は、アッセイに使用される。これらの成功したアッセイの重要なポイントは、最適な接種負荷です。ブロッティングペーパーの技術のデモンストレーションはここから始まります。液体リゾクトニアバタチコラ接種を調製するために、3日間の新鮮なプレート培養から真菌寒天プラグで500mlのスープを接種し、5日間摂氏28度のインキュベーターでフラスコをインキュベーターにインキュベートします。マイクロスクレローティアで濃い灰色の真菌菌を除外します。オートクレーブ水で一時停止し、メディアを取り除きます。繰り返しますが、ミセリアをろ過し、数分間スロット乾燥して水分を取り除きます。ジャムボトルに200mlのオートクレーブ水で100グラムの真菌接種を中断し、適切に混ぜます。表面滅菌種子をソラントに播種してひよこ豆の保育園を開発する。植物を播種の8日後に根こそぎにし、それらを洗い、オートクレーブROで洗い流します。ブロッティング紙を取り、一度折り、トレイの上に半分を置きます。オートクレーブ水で濡らします。植物を取り、断続的な上下の動きで30秒間接種に浸します。根がシートの中に覆われ、フォリアが外にとどまるような方法で植物を置きます。残りの半分を折り、紙を曲げる。制御のために、オートクレーブ水に植物を浸し、8日間成長室にトレイを保管してください。結果。葉の黄変、根腐れ、根根の壊死、横根の減少などの症状を観察してください。病気のポット技術のデモンストレーションはここから始まります。市販のひよこ豆の種子を1キロ服用してください。種子を水道水で洗い、RO水で再び洗います。種を5時間浸します。再び、RO水で種子を洗浄し、ジャムボトルに300グラムを加えます。121 LVSで15分間、2回連続してオートクレーブします。冷却後、ボトルを層流に通します。3つの真菌寒天プラグでボトルを接種し、約4ミリメートルの正方形のサイズを差し込み、適切に混合するためによく振ります。ボトルを包み、摂氏30度のインキュベーターで15日間インキュベーターに入れします。ひよこ豆の種子の周りに暗い菌体の成長を持つボトルを観察し、種子を削除します。室温で乾燥させ、粉末状にします。リゾクトニアバタチコラ粉末とソロライトを混ぜ、室温で5日間保ちます。表面は、GT62種子を殺菌し、2センチメートルの深さでそれらをまきます。結果。病気のポットで90%の死亡率を観察してください。播種後10日後、根根の壊死や根根の根の減少や葉の黄変などの症状を次の日に観察する。病気の鍋はフィールドの土の中でも準備することができます。干ばつと根支バタチコーラ感染症。水を源泉徴収して病気の鍋に干ばつストレスを課す。ここに示されている植物は、制御、干ばつ、病原体、および同時に干ばつと病原体のストレスを受ける。症状、すなわち、より多くの壊死、根腐れ、および根の根の数の減少、および病原体のみの治療と比較して結合されたストレス治療における根の長さを観察する。結論。ブロッティング紙の技術は、インビトロ条件を行うことができる。シックポット技術は、In Vivo条件で実行することができます。病原病の港では、異常ストレス、すなわち、干ばつストレスは、病原体感染と共に課すことができる。これらの技術を用いて、病原体感染パターンを研究することができる。生理学的変化のほとんどは、ひよこ豆-根酸菌とバタチコラ相互作用の間に起こり、また、耐性のためにひよこ豆遺伝子型をスクリーニングする。ブロッティング紙のアッセイは、顕微鏡検査や分子生物学の研究のための品質サンプルを生成するのに非常に有用です。自然感染状態を模倣する病気のポットアッセイは、ひよこ豆の生殖器のスクリーニングに適用可能である。

Research

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