Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا فريق سيمسيل على المناقشات المثمرة ونود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الكبير الذي تقدمه كل من جوانا أوليينيك وفيلهلم بولاندر. ونود أيضا أن نشكر دانيال Kohnhäuser لتوفير المنتج الطبيعي وستيفاني شميدت للدعم الفني ماهرا.

ملاحظة: يجب تعيين درجة حرارة الجهاز وفقا للبكتيريا المستخدمة قبل يوم على الأقل لضمان استقرار النظام. هنا، يتم تشغيل عينات Acinetobacter baumannii DSM30008 في 30 درجة مئوية.
1- الإعداد الثقافي
<ol><li>خط خارج سلالة قيد التحقيق (هنا: A. baumannii)على لوحة آجار CASO واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة ثابتة في 30 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في MHB (مرق مولر هينتون) واحتضان على حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية.</li>
</ol>2. إعداد العينة
<ol><li>استخدام 1.5 مل أنابيب لإعداد نطاق تركيز المخدرات أو مركب مختارة (على سبيل المثال، عن طريق إضافة 1.5 ميكرولتر من 100x حلول المخزون في DMSO؛ انظر الخطوة 2.3).</li>
	<li>تمييع ثقافة بين عشية وضحاها في MHB المتوسطة.<ol>
<li>قياس الكثافة البصرية للثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مقياس الطيفي في طول موجة من 600 نانومتر.</li>
		<li>تمييع الثقافة للحصول على 5 × 105 مستعمرة تشكيل وحدات (CFU) / مل في المتوسط MHB الطازجة. A OD600 واحد يساوي تقريبا 5 × 108 CFU /مل (على سبيل المثال، Escherichia القولونية، المكورات العنقودية aureus، A. baumannii). ملاحظة: من المهم معايرة عامل التحويل OD600 إلى CFU/mL لكل سلالة بكتيرية فردية في ظل ظروف الاستزراع المطبقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 150 μL من الخلايا إلى أنابيب الاختبار المعدة في الخطوة 2.1، وضمان التركيز النهائي الصحيح من المخدرات اختبار أو مركب والتركيز الصحيح الخلية النهائية.</li>
	<li>اخلط المركب مع الخلايا عن طريق الدوامة. ملاحظة: لوحة العينة (انظر جدول المواد)لديها ستة صفوف، يحتوي كل منها على ثمانية آبار، ما مجموعه 48 بئراً؛ الصف A و F هما المرجع الديناميكي الحراري. لذلك، لا يمكن تحميل أي عينات في تلك الآبار، يتم تحميل وسائل الإعلام المقابلة في تلك الآبار. ويمكن قياس 32 عينة اختبار لكل شوط، باستخدام الآبار في الصفوف B-E. يجب تشغيل عينة الاختبار الفردية على الأقل في التكرار (هنا: تم تشغيل كافة العينات على شكل ثلاث نسخ). وينبغي إدراج ضوابط للنمو.</li>
</ol>3. إدراج إعداد
<ol><li>نقل 120 μL من الخليط المعدة في الخطوة 2.4 إلى إدراج البلاستيك. ملاحظة: استخدم الأنابيب العكسية في الخطوة 3.1 لمنع السائل من الرش على جانبي الإدراجات البلاستيكية، مما قد يؤدي إلى تداخل مع قراءات الإشارة الصحيحة.</li>
	<li>ضع جميع قوارير التيتانيوم في أصحابها (انظر جدول المواد)مع ملاقط.</li>
	<li>نقل بلطف إدراج في قارورة التيتانيوم في لوحة حامل.</li>
	<li>ضع أغطية التيتانيوم على جميع قوارير التيتانيوم.</li>
</ol>4. إدراج تحميل
<ol><li>نقل حامل مع أكواب التيتانيوم على محطة العينة ومكان على منطقة معينة.</li>
	<li>استخدام وجع عزم الدوران، تعيين إلى قوة 40 cNm، لتشد من جميع الأغطية.</li>
</ol>5. تشغيل العينات
<ol><li>في برنامج calView ، ابدأ تجربة جديدة(الشكل التكميلي 1).</li>
	<li>اسحب ذراع الإدراج العينة من الأداة.</li>
	<li>ضع حامل الكأس على "الجسر"، العمود 8 الذي يواجه فتح العينة وإدخال ودفع بلطف حامل الكأس إلى الصك في "الموقف 1" المعين. انتظر 10 دقائق حتى يستقر النظام. تسمية الآبار التجريبية.</li>
	<li>دفع نموذج الإدراج الذراع حتى حامل الكأس هو في المعين "موقف 2". انتظر 20 دقيقة حتى يستقر النظام.</li>
	<li>دفع ذراع الإدراج عينة في "الموقف 3" والسحب من ذراع الإدراج عينة حتى يكون في "تشغيل الموقف". تسليط الضوء على جميع الآبار في البرنامج وحدد رد الفعل ابدأ (الشكل التكميلي 4).</li>
	<li>تشغيل التجربة حتى يقرأ الانبعاثات الحرارية هي بشكل ثابت مرة أخرى في الصفر. ملاحظة: تأكد من أن كافة الآبار تتصرف مماثلة ضمن هذه الخطوات. ويوضح الشكل التكميلي 5 ما ينبغي ملاحظته إذا تم تحميل الآبار بشكل صحيح. إذا تم تحميله بشكل غير صحيح، كرر الخطوات 5.2-5.4.</li>
</ol>6. إزالة حامل الكأس
<ol><li>في البرنامج، حدد إيقاف (الرقم التكميلي 6). البرنامج ثم يسأل إذا "كنت متأكدا" ، حدد نعم (الرقم التكميلي 7) وحفظ التجربة على محرك الأقراص أو سطح المكتب لتحليل البيانات(تكميلية الشكل 8).</li>
	<li>إدراج ذراع الإدراج عينة تماما في الصك وإشراك المغناطيس لاسترداد حامل الكأس.</li>
	<li>تخفيف الأغطية، وإزالة إدراج ووضع قوارير والأغطية في حاملي الزجاج ومكان لمدة 4 ساعات في 180 درجة مئوية متبوعا بوضع قوارير وأغطية في مجفف لضمان الأغطية وقوارير جافة.</li>
</ol>7. تحليل البيانات
<ol><li>فتح البرنامج (الشكل التكميلي 9)، حدد تجربة مفتوحة في الزاوية العليا اليسرى ( الشكلالتكميلي 10). في النافذة المنبثقة حدد تجربة الفائدة واضغط على فتح (الشكل التكميلي 11). التطبيق سوف تفتح التجربة في عرض الآبار الافتراضية(الشكل التكميلي 12).</li>
	<li>اضغط على تحديد الكل أو Ctrl+A (الشكل الإضافي 13).</li>
	<li>اضغط على تحديد الأساس، تقوم هذه المعلمة بتطبيع البيانات في كل موضع ( الشكل الإضافي14). في نافذة منبثقة حدد فترة زمنية من > 30 دقيقة تقع في مرحلة التأخر (تدفق الحرارة يجب أن تكون منخفضة، بين صفر وعشرة μW؛ الشكل التكميلي 15). بعد اختيار الفترة الزمنية لخط الأساس سيظهر خط الأساس المختار باللون الأخضر في الرسم الحراري. إغلاق إطار تعريف مقطع الأساس.</li>
	<li>اضغط حفظ أو Ctrl + S وإغلاق البرنامج ( الرقم التكميلي16).</li>
	<li>فتح على شبكة الإنترنت تطبيق تحليل قياس الحسابات الكالي (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>لتحميل الملف إلى تطبيق تحليل Calorimetry، اضغط على استعراض (الشكل التكميلي 17)، حدد التجربة واضغط على فتح ( الشكلالتكميلي 18). سيتم حساب المعلمات الأيضية تلقائياً للعينات 32 في تطبيق الويب(الشكل التكميلي 19).</li>
	<li>من أجل احتواء البيانات تدفق الحرارة إلى Gompertz و / أو نماذج النمو ريتشارد انقر فوق وظيفة النمو. نماذج النمو تناسب سيتم عرض في قسم "تراكمي"، أيضا بالمقارنة مع البيانات الخام في قسم "تدفق"(الشكل التكميلي 20).</li>
	<li>لتنزيل جميع المعلمات المحسوبة، اضغط على "قياسات التنزيل". حدد موقع الملف واضغط على حفظ (الشكل التكميلي 21). سيتم تصدير الملف إلى جدول بيانات لإجراء المزيد من الحسابات.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

تم تنفيذ المشروع بالتعاون مع سيمسيل، مطور تقنية كالسكريفير. ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

يقيس القياس الدقيق للمقاييس الحرارية الطاقة المنبعثة من عينة على مر الزمن، وهذا الإطلاق للطاقة هو نتيجة لجميع العمليات الكيميائية البيولوجية والفيزيائية و(البيولوجية). يمكن استغلال تدفق الحرارة المقاس لتقييم أو تحديد الآثار المضادة للبكتيريا للمواد لأنها تمكن من الرصد المستمر في الوقت الحقيقي للنشاط الأيضي.
من أجل الحصول على بيانات موثوقة للتحليل، يجب تحديد وحدات تشكيل المستعمرة الصحيحة (CFU) بشكل فردي لكل نوع أو سلالة مستخدمة. في حالة أن عدد CFU منخفض جداً، وهذا يؤدي إلى مرحلة تأخر طويلة حيث يستغرق النظام وقتاً أطول للوصول إلى كمية حرجة من الكتلة الحيوية التي تنتج ما يكفي من الحرارة ليتم الكشف عنها. في حالة أن العد CFU عالية جداً فإن مرحلة التأخر تكون قصيرة جداً، وكمية الحرارة المنتجة يمكن أن يسبب نقل الحرارة إلى خلايا الاستشعار المجاورة (المرجعية والآبار التجريبية) وتسبب تشوهات في ثيرمجرامس. كما ستؤدي أعداد كبيرة من الـ CFU إلى استنفاد أسرع للأكسجين والتحول إلى الظروف اللاهوائية. كما يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه خلال الدقائق الثلاثين الأولى من التجربة، عندما يكون النظام اِهزَاً، لا يمكن جمع البيانات ويتأخر التسجيل الفعلي للآثار. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تحديد CFU غير صحيحة إلى تحديد MIC زائف ، مما يؤثر في نهاية المطاف على التجربة والتغييراتالملاحظة 25. وثمة نقطة أخرى هامة هي التحديد الصحيح لخط الأساس. عادة، يتم تحديد إشارة خط الأساس خلال مرحلة التأخر عندما تكون إشارة تدفق الحرارة صفرًا، ومن الناحية المثالية، يكون النطاق الزمني لتعريف خط الأساس >30 دقيقة. ومع ذلك، هذا ليس ممكنا دائماً لأن الوقت الذي تتطلبه البكتيريا للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية يختلف بين السلالات والأنواع. تتطلب بعض الأنواع أو السلالات أكثر من 30 دقيقة للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية في حين أن سلالات أو أنواع أخرى تصل إليه في غضون الدقائق الثلاثين الأولى. في هذه الحالة، من الممكن تحديد إشارة خط الأساس في نهاية التجربة عندما تكون جميع إشارات الحرارة قد انخفضت مرة أخرى إلى الصفر وتظل مستقرة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام خطوط الأساس من تجارب أخرى مع نفس السلالة البكتيرية، والتي لا ينصح بها.
ويتيح النظام بعض المرونة من حيث التصميم والتحسين للتجارب واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وحدات التخزين المستخدمة هي في نطاق 100-300 ميكرولتر عند استخدام إدراج البلاستيك و 100-600 μL عند استخدام أكواب التيتانيوم دون إدراج البلاستيك. حجم العمل الموصى به من قبل الشركة المصنعة هو 120 μL. 10- إن استخدام أحجام مختلفة في إعداد سلسلة تجريبية جديدة، وفي الوقت الذي يجد فيه الظروف المثلى للقياسات، له تأثير رئيسي على المعلمات. باستخدام وحدات تخزين أقل، يمكن تقليل كمية مركب الاختبار المطلوب، وهو أمر مهم بشكل خاص للمركبات، التي لا تتوفر إلا بكميات صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤثر حجم استخدام مباشرة على توافر الأكسجين أثناء القياس مع كميات أقل زيادة كمية الأكسجين المتاحة اللازمة لنمو البكتيريا. إن استنفاد الأكسجين هو أحد العوامل الرئيسية التي تسهم في الحد الأقصى للتجربة. الأهم من ذلك ، فمن الممكن استخدام وسائل الإعلام الصلبة ، وليس فقط وسائل الإعلام السائلة. وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة للكائنات الدقيقة بطيئة النمو حيث أن النمو على الواجهة بين مرحلة الصلب والغاز يتيح الوصول إلى الأكسجين بشكل أفضل9.
IMC هو أداة تحليلية مفيدة لاكتشاف العمليات غير المعروفة مع تطبيقات في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا. الطريقة يقيس تبادل الحرارة داخل نظام مغلق وتحليل تبادل الحرارة المسجلة يوفر معلومات إضافية لا يمكن الحصول عليها دائما مع الأساليب القياسية. في أبحاث الميكروبيولوجيا والمضادات الحيوية ، واحدة من أكبر مزايا IMC هي قدرتها على التمييز بين الخلايا الحية والأموات والهادّدة أو الخاملة ، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق التعكر القياسية11. وبالإضافة إلى ذلك، IMC حساس للغاية ويمكن الكشف عن انبعاث الحرارة من عدد قليل من 104-105 الخلايا9. ميزة أخرى هي أن الإعداد التجريبي سريع وسهل ، ويسمح بالتتبع المستمر في الوقت الحقيقي مع الحد الأدنى إلى أي تدخل المستخدم. وعلاوة على ذلك، فإن اللجنة الطبية المشتركة غير مدمرة، مما يتيح إجراء مزيد من التحليل للعينات. يسمح تحليل البيانات بفصل تكوين الكتلة الحيوية حتى وقت متأخر من الطور الأسي أو المبكر والنشاط الأيضي في المرحلة الثابتة.
إلى جانب ميزات التطبيق الجديدة والمثيرة المذكورة أعلاه ، هناك أيضًا عيوب في هذا الأسلوب. والقيود الرئيسية هي أن أجهزة اللجنة تقيس الحرارة الكلية المنتجة والمطلقة داخل نظام محدد، والتي تشمل أيضا إشارات غير محددة. وهذا يسلط الضوء على أهمية التخطيط التجريبي مع الضوابط المناسبة لتكون قادرة على تقييم التغيرات إشارة الحرارة التي يتم قياسها عن طريق تسجيل تدفق الحرارة9،20.
في أيدينا، IMC هو أداة هامة لدراسة الآثار المضادة للبكتيريا من المنتجات الطبيعية الجديدة وتحديد نطاقات التركيز الفعالة. وبصرف النظر عن التمييز بين الآثار الجرثومية والمبيد للجراثيم، يمكن استخدامه في المستقبل كجزء من دراسات تحديد الهدف وتحديد وزارة الشؤون العامة. ويمكن القيام بذلك من خلال مقارنة ثيرموجرامات من مختلف فئات المضادات الحيوية إلى ثيرمجرامات المركبات النشطة الجديدة كما هو معروض هنا. ومع ذلك، لا يزال يتعين التحقق مما إذا كانت بعض البارامترات القابلة للقياس الكمي التي يمكن استخلاصها من البيانات المقاسة كافية لمثل هذه المقارنات أو إذا كان من الضروري العمل على خوارزميات تعطي بصمات الأصابع استناداً إلى حرارية كاملة. تطبيق آخر ممكن في مجال البحوث المضادات الحيوية هو مقارنة النمط البري إلى الحيوانات المستنسخة المقاومة، إلى جانب تسلسل الجينوم كله، والتي يمكن أن تساعد في توضيح طريقة المقاومة (MoR) من مضادات الجراثيم الجديدة. وبسبب الطبيعة الساكنة للطريقة، فإن التحقيق في فعالية العوامل الجديدة في تكوين البيو فيلم أو على الأغشية الحيوية المنشأة بالفعل يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للعملية البيولوجية وتأثير عوامل مختارة على الميكروبات في مراحل مختلفة من السكون. IMC سجلات الطاقة الإجمالية التي أطلقت في شكل الحرارة مما يجعلها وسيلة مناسبة للتحقيق أيضا دون مثبطة الآثار من المواد الفعالة التي قد تكون مقترنة transcriptomics. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة في البيئات السريرية للكشف عن تلوث العينات أو لتحديد مضادات الحيوية مما يساعد على اتخاذ قرار سريع بشأن العلاج المحدد للمرضى11.

والهدف من هذه الطريقة هو تطبيق القياسات الحرارية الأرضية الحرارية (IMC) كمقايسة متوسطة في وضع العمل (وزارة الشؤون الداخلية) تحديد ملامح المركبات المضادة للبكتيريا الجديدة. هذه الطريقة تكشف عن البيانات المتعلقة بنشاط المركبات على الأنواع البكتيرية، ويقدم معلومات عن طبيعة البكتيريا أو بكتيريا المركب نفسه.
إن ظهور المقاومة الناشئة المضادة للميكروبات (AMR) مشكلة عالمية وتؤدي إلى علاجات أقل فعالية للعدوى الشائعة بالمضادات الحيوية المعروفة1. ومع ذلك، فإن البحث عن مركبات وأدّاءات جديدة يمكن أن تحل محل أو تعمل بالاقتران مع المضادات الحيوية المعروفة مستمر، وهذا مبني على مقاربات متنوعة. المنتجات الطبيعية هي لاعب رئيسي في حملات اكتشاف المخدرات الحالية وخاصة في اكتشاف المخدرات المضادة للعدوى2. ومع ذلك ، فإن تحديد هياكل الرصاص الجديدة لتطوير المضادات الحيوية هو عملية طويلة ومطلبة ماليا3. وبالتالي، فإن الخطوات المبكرة من الاكتشاف هي في غاية الأهمية من أجل تصفية على السقالات الواعدة بالفعل في مرحلة مبكرة. وتشمل الخطوات الأولية في اكتشاف الأدوية الطبيعية المنتج الحصول على هيكل المركب، وتحديد النشاط في المختبر جنبا إلى جنب مع وزارة الداخلية وتحديد الهدف. وينبغي أن معظم المركبات الناجحة التي تكون مؤهلة لمزيد من التطوير عرض طيف إيجابي من النشاط (أي، نشاط واسع الطيف في حالة مضادات الجراثيم) ورواية وزارة الداخلية التي يمكن من خلالها التغلب على AMR الموجودة من قبل. ثم يتم فرز السقالات الواعدة عادة في المقايسات الثانوية، والتي تشمل في التوافر البيولوجي الجسماني، والسمية، والتمثيل الغذائي4. وإلى جانب المخاوف المالية، المنتج الطبيعي اكتشاف المخدرات يواجه المزيد من التحديات المتعلقة بالتكاليف والصعوبات التقنية المتعلقة العزلة المركبة وتنقيتها، والتي، بدورها، يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على كميات متعددة مليغرام أو حتى غرام في المراحل المبكرة من عملية الاكتشاف5،6. لذلك، من الأهمية القصوى في بحوث المنتجات الطبيعية أن تكون قادرة على إجراء أحدث الفحوصات الأولية مع الحد الأدنى من الكميات المركبة من أجل اتخاذ قرار مستنير بشأن المزيد من الاستثمارات لجعل منتج طبيعي جديد في متناول التنمية قبل السريرية. مع استخدام IMC لتحديد مضادة للبكتيريا ، يتم تقليل كمية المركب المطلوبة بشكل كبير بالمقارنة مع الطرق القياسية. كما توفر هذه التقنية معلومات أكثر تعمقاً بشأن تفاعل الأدوية الجديدة مع المجتمع الميكروبي7.
12- إن اللجنة البحرية الدولية هي طريقة راسخة لقياس الطاقة الكلية نتيجة لجميع العمليات البيولوجية والفيزيائية والكيميائية الحيوية والتفاعلات في النظام البيولوجي. البكتيرية الطاقة الإفراج يتناسب مع مجموع ردود الفعل الأيضية8. داخل نظام مغلق، مثل مقياس الحرارية الدقيقة المستخدمة، يمكن قياس مستويات الحرارة في نطاق microwatt لدراسة الحركية الأيضية للبكتيريا9،10،11،12. وترتبط الحرارة (الطاقة) التي يتم الإفراج عنها من قبل البكتيريا إلى الوظائف الخلوية التي تكمن وراء عملية التمثيل الغذائي الخاصة بهم والتي ليست بالضرورة متناسبة مع الكتلة الحيوية الخلوية.
في البداية، كان تطبيق قياس السعرات الحرارية الأيزوحرارية للمقايسات الميكروبيولوجية محدوداً بسبب انخفاض الإنتاجية وأحجام الاختبار العالية. ومع ذلك ، فإن المقياس الدقيق المستخدم فريد من نوعه لأنه يجمع بين مزايا قياس السعرات الحرارية isothermal مع زيادة الإنتاجية ومتطلبات المركبات الأقل ، مما يجعله أداة قيمة لتطبيقات اكتشاف الأدوية10. وعلاوة على ذلك، يوفر الجهاز مزايا إضافية على الطرق البديلة لقياس حركية النمو البكتيرية، مثل طريقة التعكر القياسية، والتي تقوم على قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD<600). ويستند قياس OD600 على افتراض أن زيادة الكثافة البصرية يساوي النمو الميكروبي، وبالتالي إهمال وجود خلايا غير قابلة للحياة. وقد انتقد هذا الأسلوب أيضا لأنه يستبعد متغيرات مستعمرة صغيرة والخلاياالمستمرة 11. في المقابل، يسمح IMC بالمراقبة في الوقت الحقيقي لأي نوع من الخلايا القابلة للحياة. إذا كانت الخلايا نائمة، فإنها لا تزال تظهر النشاط الأيضي، وبالتالي يمكن الكشف عنها من قبل IMC، في حين أن مثل هذه الظواهر لا يمكن الكشف عنها من قبل طريقة التعكر القياسية11. وتشمل المزايا الأخرى لـ IMC وقت اختبار الحساسية المضادة للميكروبات أقصر ، وقياس تفاعلات المخدرات في مجتمع معقد وطرق التحليل القياسية دون تدمير العينة7.
وقد تم تنفيذ تكنولوجيا IMC في مجموعة واسعة من الدراسات، بدءا من علم الأحياء الدقيقة إلى توليد الحرارة وعلم الأحياء السرطان13،14،15،16،17. وتشمل التطبيقات الميكروبية تحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MIC) من المركبات ضد السلالات البكتيرية المختلفة. وقد أجريت عدة دراسات وقد تم التوصل إلى أن بيانات هيئة التصنيع العسكري من قياس السعرات الحرارية isotherry لغالبية الأنواع البكتيرية يمكن الحصول عليها بشكل أسرع والنتائج مماثلة لأساليب أخرى (قياسية) لتحديد MIC12،18،19. وتشمل تطبيقات أخرى من IMC مراقبة التفاعل بين المخدرات والجمع بين العلاجات الدوائية مع المجتمعات البكتيرية المعقدة مثل الأغشية الحيوية11. وأظهرت دراسة تركز على التنميط وزارة الشؤون المالية أن microcalorimeter يمكن الكشف عن الفرق في الجيل الأول والثاني من السيفالوسبورين، في حين أن المضادات الحيوية المختلفة مع وزارة الداخلية نفس المعرض منحنى تدفق الحرارة مماثلة مقارنة مع بعضها البعض18.
هنا، نحن وصف استخدام IMC لملامح وزارة الشؤون العامة للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام أداة القياس الدقيق isothermal الجديدة. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد تركيزات المضادات الحيوية الفعالة ووصف خصائص المضادات الحيوية من حيث آليات المبيد للجراثيم أو البكتيريا. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع في تحديد ملامح وزارة الشؤون الداخلية للمركبات وقد تحل محل الطرق الميكروبيولوجية المعيارية أو تكملها على الأقل. وستشمل الدراسات المستقبلية تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع من شأنها أن تمكن من التفريق بين فئات المضادات الحيوية على أساس الآليات المستهدفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

ونظراً للتهديد العالمي المتمثل في ارتفاع مقاومة مضادات الميكروبات، هناك حاجة ماسة إلى مضادات حيوية جديدة. نحن نتحرى عن المنتجات الطبيعية من Myxobacteria كمصدر مبتكر لهذه المركبات الجديدة. اختناق واحد في العملية هو عادة توضيح أسلوب العمل الخاصة بهم. لقد أنشأنا مؤخراً قياس حرارية حرارية مجهرية متساوي الاتسام كجزء من خط أنابيب تنميط روتيني. تسمح هذه التقنية بالتحقيق في تأثير التعرض للمضادات الحيوية على الاستجابة الأيضية البكتيرية الكلية، بما في ذلك العمليات التي يتم فصلها عن تكوين الكتلة الحيوية. الأهم من ذلك، آثار بكتيريا ومبيد للجراثيم يمكن تمييزها بسهولة دون أي تدخل المستخدم أثناء القياسات. ومع ذلك، فإن القياس الدقيق متساوي الاتسام هو نهج جديد إلى حد ما، وتطبيق هذه الطريقة على الأنواع البكتيرية المختلفة يتطلب عادة ما قبل التقييم لظروف القياس المناسبة. هناك بعض ثيرمجرامات مرجعية المتاحة من بعض البكتيريا، وتسهيل كبير تفسير النتائج. وبما أن مجموعة البيانات المرجعية تنمو باطراد، فإننا نتوقع أن يكون للمنهجية تأثير متزايد في المستقبل ونتوقع أن تسمح بإجراء تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع تمكن من التمييز بين فئات المضادات الحيوية.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

إن توضيح طريقة عمل المضادات الحيوية الجديدة مهمة صعبة في عملية اكتشاف الدواء. الهدف من الطريقة المذكورة هنا هو تطبيق القياسات الحرارية الحرارية باستخدام calScreener في التنميط المضاد للبكتيريا لتوفير نظرة إضافية على تفاعلات ميكروباء المخدرات.

التنميط الأيضي لتحديد آثار البكتيريا أو Bacteriostatic للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام القياس الدقيق متساوي الحرارة

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

فهم طريقة عمل المركبات المضادة للبكتيريا جديدة مهمة هامة ولكنها صعبة. توفر هذه الطريقة رؤى حول هذه الآليات ومن السهل تنفيذها. هذه التقنية تسمح لمراقبة في الوقت الحقيقي من الآثار المضادة للبكتيريا بطريقة غير الباضعة مما يتيح مزيد من تحليل العينة.على الرغم من أن ممارسة التقنيات الميكروبيولوجية هو شرط مسبق، التجربة سهلة الأداء. أخذ وقتك مع تحليل البيانات مهم جدا عند إجراء القياس الدقيق للمرة الأولى. ابدأ باستخدام مقياس طيفي عند طول موجة من 600 نانومتر لقياس الكثافة البصرية لثقافة الليل.تخفيف الثقافة إلى 5 مرات 10 إلى 5 مستعمرة تشكيل وحدات لكل ملليلتر من تركيز MHB المتوسطة الطازجة وإضافة 150 ميكرولترات من الخلايا إلى كل 1.5 ملليلتر أنبوب من المضادات الحيوية في تركيز الفائدة. ثم اخلط المركب مع الخلايا عن طريق الدوامة. لإعداد إدراج، إضافة 120 ميكرولترات من كل خليط المضادات الحيوية البكتيريا في إدراج البلاستيك الفردية في الآبار المناسبة من لوحة 48 جيدا واستخدام ملاقط لوضع كل من قوارير التيتانيوم في أصحاب.نقل بلطف إدراج في قارورة التيتانيوم في لوحة حامل ووضع فضفاضة أغطية التيتانيوم على جميع قوارير. عندما تم نقل جميع إدراج، ضع حامل على المنطقة المعينة على محطة العينة واستخدام وجع عزم الدوران تعيين إلى 40 centinewton متر لتشدّد كل من الأغطية. في برنامج النظام، بدء تجربة جديدة والتراجع عن ذراع الإدراج عينة من الصك.وضع حامل الكأس على الجسر مع العمود الثامن التي تواجه فتح إدخال العينة ودفع بلطف حامل الكأس في الصك في موقف واحد. انتظر 10 دقائق حتى يستقر النظام قبل وضع العلامات على الآبار التجريبية. بعد ذلك، ادفع ذراع الإدراج العينة حتى يكون حامل الكأس في المركز الثاني.بعد السماح للنظام بالستقر لمدة 20 دقيقة، ادفع ذراع الإدراج العينة إلى موضع ثلاثة ثم سحب ذراع الإدراج العينة حتى يكون في وضع التشغيل. تسليط الضوء على جميع الآبار في البرنامج وحدد بدء رد الفعل، ثم تشغيل التجربة حتى يقرأ الانبعاثات الحرارية هي ثابت مرة أخرى في الصفر. في نهاية التحليل، حدد إيقاف.ثم يسأل البرنامج إذا كنت متأكدا. حدد نعم واحفظ التجربة لتحليل البيانات. ثم أدخل ذراع الإدراج العينة تماما في الصك وإشراك المغناطيس لاسترداد حامل الكأس.لتحليل البيانات، افتح البرنامج وحدد التجربة المفتوحة. في النافذة المنبثقة، حدد تجربة الاهتمام وانقر فوق فتح. انقر فوق تحديد الكل وحدد الأساس لتسوية البيانات في كل موضع.في النافذة المنبثقة، حدد فترة زمنية تزيد عن 30 دقيقة في مرحلة التأخر. بعد التحديد، سيظهر خط الأساس باللون الأخضر في الرسم الحراري. أغلق نافذة قسم تحديد الأساس، ثم انقر فوق حفظ وإغلاق البرنامج.المقبل، فتح على شبكة الإنترنت تطبيق تحليل القياسات الحرارية SymCel. انقر على استعراض لتحميل الملف الذي يهمك وحدد التجربة. سيتم حساب المعلمات الأيضية تلقائيًا للعينات الـ 32.لملاءمة بيانات تدفق الحرارة إلى نماذج نمو Gompertz و/أو Richards Growth، انقر فوق وظيفة النمو. سيتم عرض نماذج النمو في المقطع التراكمي للمقارنة مع البيانات الأولية في مقطع التدفق. لتنزيل المعلمات المحسوبة، انقر فوق مقاييس التنزيل، وحدد موقع الملف وانقر فوق حفظ.سيتم تصدير الملف إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل. هنا، يتم عرض الرسوم الحرارية التي تم الحصول عليها عن طريق تعريض A.baumannii DSM-30008 إلى ciprofloxacin في التخفيف التسلسلي. التركيزات بين 0.005 و 0.1 micromolar لها تأثير ضئيل على نمو A.baumannii والتمثيل الغذائي.ومع ذلك، فإن علاج الخلايا بـ 0.5 من سيبروفلوكساسين الدقيق يؤدي إلى تحول كبير في مدة المرحلة الانتقالية وإلى انخفاض الحد الأقصى لتدفق الحرارة. هذه التغييرات اثنين معا تؤثر على الوقت إلى الذروة، مما أدى إلى زيادة حوالي ست ساعات. في هذا الرقم، يتم رسم الحرارة التراكمية الصادرة ضد الزمن مع تأثير كل تركيز ينعكس من قبل منحدر المنحدر.يسمح القياس الكمي للميل الحراري بحساب المعدل الأيضي الأقصى لـ A.baumannii في وجود سيبروفلوكساسين مع انخفاض مصاحب في معدل الأيض الملاحظ في الخلايا المعالجة بـ 0.5 ميكرومولار سيبروفلوكساسين. العلاج ريفامبيسين له تأثير كبير على ثيرموجرامات A.baumannii DSM-30008. كما لوحظ انخفاض كبير في انبعاثات الحرارة المرتبطة بانخفاض في النشاط الأيضي.لاحظ الزيادة في الوقت إلى الذروة لجميع التركيزات المختبرة والانخفاض في معدل الأيض الناجم عن انخفاض في المنحدر لجميع التركيزات التي تعزى عادة إلى تأثير مبيد للجراثيم. لضمان النتائج المثلى، استخدم الخفقان العكسي ومنع السوائل الإضافية على جانبي الإدراج عند نقل العينة، وتأكد أيضًا من أن الأغطية مغلقة بشكل صحيح.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

تصنيع نافيون المغلفة، وخفضت الجرافين أكسيد/بوليانيليني تشيميريسيستيفي استشعار لمراقبة درجة الحموضة في "الوقت الحقيقي أثناء التخمر الميكروبية"

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

طريقة الاختبار القياسية ASTM D 7998-19 لتطوير قوة التماسك للمواد اللاصقة الخشبية

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب مؤشر الانكسار أو الكشف الطيفي الكتلي لتنميط المستقلب في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على Lysate

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...