Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
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作者要感谢Sycel团队进行了富有成果的讨论，我们感谢甘娜·奥利尼克和威廉·保兰德的大力支持。我们还要感谢丹尼尔·科恩海瑟提供天然产品，斯特凡妮·施密特提供娴熟的技术支持。

注：仪器温度必须至少提前一天根据使用的细菌进行设置，以确保系统的稳定性。在这里， 阿辛托菌鲍曼尼 DSM30008 样品运行在 30 °C。
1. 文化准备
<ol><li>将正在调查的菌株（这里 ：A.鲍曼尼）划掉在CASO果糖板上，并在30°C的静态培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>在 MHB（穆勒-欣顿汤）中接种单个菌落，并在 30°C 的 180 rpm 转速下孵化孵化器，准备过夜培养。</li>
</ol>2. 样品制备
<ol><li>使用 1.5 mL 管准备选定药物或化合物的浓度范围（例如，在 DMSO 中加入 1.5 μL 100 倍库存溶液;参见步骤 2.3）。</li>
	<li>稀释 MHB 介质中的隔夜文化。<ol>
<li>使用波长为 600 nm 的分光光度计测量过夜培养的光学密度。</li>
		<li>稀释培养，在新鲜的MHB介质中获得5 x10 5菌落形成单位（CFU）/mL。一个OD600等于大约5 x 108 CFU/mL（例如，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，A.鲍曼尼）。 注：在应用培养条件下，将每种细菌菌株的转化因子 OD600 校准为 CFU/mL 非常重要。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将150μL的细胞加入步骤2.1中制备的试管中，确保测试药物或化合物的最终浓度正确，并正确最终细胞浓度。</li>
	<li>通过涡旋将化合物与细胞混合。 注：样品板（见 材料表）有六行，每行包含八孔，共48孔;行 A 行和行 F 是热力学参考。因此，不能将样品加载到这些井中，相应的介质加载到这些井中。使用 B-E 行中的油井，可以测量 32 个测试样本。单个测试示例应至少重复运行（此处：所有示例都作为三倍运行）。应包括增长控制。</li>
</ol>3. 插入准备
<ol><li>将步骤 2.4 中制备的混合物中 120 μL 转移到塑料刀片。 注：在步骤 3.1 中使用反向移液，以防止液体喷洒在塑料刀片的两侧，这可能导致干扰正确的信号读数。</li>
	<li>将所有钛小瓶放入支架 中（参见材料表），并放入钳子中。</li>
	<li>轻轻将刀片转移到支架板中的钛瓶中。</li>
	<li>将钛盖松散地放在所有钛瓶上。</li>
</ol>4. 插入加载
<ol><li>将带钛杯的支架转移到样品站上，并放在指定区域。</li>
	<li>使用扭矩扳手（设置为 40 cNm 力）拧紧所有盖子。</li>
</ol>5. 样品运行
<ol><li>在 calView 软件中，开始新的实验（补充图 1）。</li>
	<li>从仪器中收回样品插入臂。</li>
	<li>将杯架放在"桥"上，第 8 列朝向样品插入开口，轻轻将杯架推入指定"位置 1"处的仪器中。等待 10 分钟，让系统稳定下来。给实验井贴上标签。</li>
	<li>推动样品插入臂，直到杯架位于指定的"位置 2"。等待 20 分钟，系统稳定。</li>
	<li>将样品插入臂推入"位置 3"，并缩回样品插入臂，直到其处于"运行位置"。突出显示软件中的所有孔并选择"反应开始"（补充图 4）。</li>
	<li>运行实验，直到热发射读取稳定地回到零。 注意：请确保所有油井在这些步骤中的行为类似。 补充图 5 说明了如果井装正确，应遵守哪些情况。如果加载不正确，请重复步骤 5.2-5.4。</li>
</ol>6. 拆下杯架
<ol><li>在软件中，选择"停止"（补充图 6）。然后，软件将询问"您是否确定"，选择"是"（补充图7），并将实验保存在驱动器或桌面上进行数据分析（补充图 8）。</li>
	<li>将样品插入臂完全插入仪器，并接合磁铁以取回杯架。</li>
	<li>松开盖子，取出盖子，将小瓶和盖子放入玻璃支架中，在 180°C 下放置 4 小时，然后将小瓶和盖子放入干燥器中，以确保盖子和小瓶干燥。</li>
</ol>7. 分析数据
<ol><li>打开软件（补充图9），选择左上角的"打开实验"（补充图10）。在弹出窗口中选择感兴趣的实验，然后按"打开"（补充图11）。应用程序将在默认井视图中打开实验（补充图 12）。</li>
	<li>按"选择全部"或"Ctrl+A"（补充图13）。</li>
	<li>按 定义基线，此参数规范化每个位置的数据（补充图 14）。在弹出窗口中选择位于滞后相的 >30 分钟的时间段（热流量必须低，介于零和十 μW 之间）; 补充图 15.选择基线时间段后，所选基线将在热图中显示为绿色。关闭" 定义基线剖面" 窗口。</li>
	<li>按"保存"或"Ctrl+S"并关闭软件（补充图 16）。</li>
	<li>打开基于 Web 的 Symcel 测热分析应用程序 （https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/）。</li>
	<li>要将文件上传到计算分析应用程序，请按Browse（补充图 17），选择实验并按"打开"（补充图 18）。代谢参数将自动计算在web应用程序中的32个样本（补充图19）。</li>
	<li>为了适应热流数据到戈姆珀茨和/或理查德的增长模型点击 增长函数。生长模型拟合将显示在"累积"部分，也与"Flow"部分（补充图20） 中的原始数据进行比较。</li>
	<li>要下载所有计算的参数，请按下载措施。选择文件位置，然后按"保存"（补充图 21）。该文件将导出到电子表格中进行进一步计算。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. 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该项目是与calScreener技术的开发人员Symcel合作执行的。作者没有什么可透露的。

等温微计算测量样品在一段时间内释放的能量，这种能量释放是所有生物、物理和（生物）化学过程的结果。测量的热流可用于评估或确定物质的抗菌效应，因为它能够持续实时监测代谢活动。
为了获得可靠的分析数据，需要根据每个物种或菌株分别确定正确的起始菌落形成单位 （CFU）。如果 CFU 计数过低，则会导致长时间的滞后阶段，因为系统需要更长的时间才能达到产生足够热量的临界量，从而检测出热量。如果 CFU 计数过高，滞后相位将非常短，产生的热量量会导致传热到相邻的传感器单元（参考和实验井），并导致热图失真。大量的CFU也会导致更快的氧气消耗，并切换到厌氧条件。还必须考虑到，在实验前30分钟，当系统平衡时，无法收集数据，并延迟实际记录效果。此外，不正确的CFU确定导致错误的MIC测定，最终影响实验和观察的变化25。另一个关键点是正确确定基线。通常，当热流信号为零时，在滞后阶段选择基线信号，理想情况下，基线定义的时间范围为 >30 分钟。然而，这并不总是可能的，因为细菌达到热信号检测极限的时间因菌株和物种的不同而不同。某些物种或菌株需要超过 30 分钟才能达到热信号检测极限，而其他菌株或菌株需要 30 分钟以上才能达到热信号检测极限。在这种情况下，当所有热信号都回退到零并保持稳定时，可以选择实验结束时的基线信号。或者，可以使用来自相同细菌菌株的其他实验的基线，但是不建议这样做。
该系统允许在设计和优化实验和故障排除方面具有一定的灵活性。使用塑料刀片时，使用的体积在 100-300 μL 范围内，使用无塑料刀片的钛杯时为 100-600 μL。制造商推荐的工作体积为 120 μL。使用不同的卷来建立一个新的实验系列，在找到测量的最佳条件的同时，主要对两个参数产生影响。通过使用较低的体积，所需的测试化合物的量可以减少，这对于化合物尤其重要，因为化合物只有少量可用。此外，在测量过程中，使用体积直接影响氧气的可用性，而较低的体积增加了细菌生长所需的可用氧气量。氧气消耗是导致实验最长可能持续时间的主要因素之一。重要的是，可以使用固体介质，不仅仅是液体介质。这对生长缓慢的微生物尤其重要，因为固体和气相之间的界面上的生长可以更好地获得氧气。
IMC 是一个有用的分析工具，用于发现物理、化学和生物学应用中的未知过程。该方法测量封闭系统中的热交换，对记录的热交换进行分析，提供了不能始终通过标准方法获得的额外信息。在微生物学和抗生素研究中，IMC最大的优点之一是能够区分活细胞、死细胞和持续细胞或休眠细胞，这是不可能使用标准浊度方法11。此外，IMC是高度敏感的，它可以检测热量发射从只有104-105细胞9。另一个优点是，实验设置是快速和容易的，它允许连续，实时跟踪，最小的或没有用户干扰。此外，IMC 是无损的，可以进一步分析样品。数据分析允许生物量形成分离，直到后期指数或早期固定阶段和固定阶段的代谢活性。
除了上述新颖而令人兴奋的应用功能外，这种方法也有缺点。主要限制是，IMC 仪器测量特定系统内产生和释放的总热量，其中还包括非特定信号。这突出了实验规划的重要性，适当的控制，以便能够评估热信号的变化，通过记录热流9，20,测量。
在我们手中，IMC是研究新天然产品的抗菌效果和确定有效浓度范围的重要工具。除了区分杀菌和杀菌效果外，它将来还可用于目标鉴定研究和农业部测定。这可以通过比较不同抗生素类别的热图和此处显示的新活性化合物的热图来完成。然而，仍要调查从测量数据中提取的某些可量化参数是否足以进行此类比较，或者是否需要研究基于完整热图提供指纹的算法。抗生素研究领域的另一个可能应用是比较野生型对耐药克隆，加上全基因组测序，这可以帮助阐明新的抗菌剂的耐药模式（MoR）。由于该方法的静态性质，研究新制剂对生物膜形成或已经建立的生物膜的疗效，可导致更好地了解生物过程和选定制剂在休眠不同阶段的微生物的影响。IMC 记录以热的形式释放的总能量，因此它成为研究可能与转录组学相耦合的活性物质的亚抑制作用的合适方法。这种方法也可用于临床设置，以检测样品的污染或确定抗生物图有助于迅速决定确定治疗病人的11。

该方法的目的是将等温微计算（IMC）作为介质通量测定，用于新型抗菌化合物的活性模式（MoA）分析。该方法揭示了有关化合物在细菌物种上活性的数据，并提供了化合物本身的杀菌或杀菌性质的信息。
新出现的抗微生物药物耐药性（AMR）的兴起是一个全球性问题，它导致对已知抗生素1的常见感染治疗效果较低。然而，寻找新的化合物和药物，可以取代或与已知的抗生素结合工作正在进行中，这是基于不同的方法。天然产品是当前药物发现运动，特别是抗感染药物发现2的关键参与者。然而，为抗生素开发确定新的铅结构是一个漫长而财政要求高的过程3。因此，发现的早期阶段对于过滤已经处于早期阶段的最有前途的脚手架极为重要。天然产品药物发现的初始步骤包括获取化合物的结构，确定体外活动以及MoA和目标识别。大多数符合进一步开发条件的成功化合物应表现出有利的活性范围（即抗菌剂中的广谱活性）和可以克服预先存在的 AMR 的新 MOA。然后，有希望的脚手架通常通过二次检测进行筛选，包括体内生物利用度、毒性和代谢4。除了财务问题外，天然产品药物的发现也面临着与化合物分离和纯化相关的成本和技术难题的进一步挑战，这反过来又可能使其难以在发现过程5、6,的早期阶段获得多毫克甚至克的量。因此，在天然产品研究中，能够以最少的化合物量进行最先进的初级筛选，以便就进一步投资做出明智的决定，使一种新的天然产品可用于临床前开发，这一点至关重要。与标准方法相比，随着 IMC 用于抗菌分析，所需的化合物量显著减少。该技术还提供了关于新药与微生物群落7相互作用的更深入的信息。
IMC 是测量生物系统中所有生物、物理和生化过程和反应的总能量的成熟方法。细菌能量释放与总代谢反应成正比 8。在封闭的系统中，如使用的微钙计，热量水平可以在微瓦范围内测量，以研究细菌的代谢动力学9，10，11，12。,10,11,12细菌释放的热量（能量）与细胞功能有关，这些细胞功能是细胞代谢的基元，不一定与细胞生物量成正比。
最初，由于其低吞吐量和高测试量，等温热法对微生物测定的适用性受到限制。然而，使用的微热量计是独一无二的，因为它结合了等温热量测定的优点，增加了产量和较低的化合物要求，这使得它成为药物发现应用10的宝贵工具。此外，该仪器还具有测量细菌生长动力学的替代方法（如基于 600 nm 光学密度测量的标准浊度方法）的替代方案。测量OD600 的假设是，增加的光密度等于微生物的生长，从而忽略了不可行的细胞的存在。这种方法也受到批评，因为它排除了小群体变种和持久细胞11。相比之下，IMC允许实时观察任何类型的可行细胞。如果细胞处于休眠状态，它们仍然表现出代谢活性，因此它们可以被 IMC 检测到，而标准浊度方法11无法检测到这种现象。IMC 的其他优点包括较短的抗菌易感性测试时间、测量复杂社区中的药物相互作用以及标准分析方法，而不破坏样本 7。
IMC技术已应用在广泛的研究，从微生物学到热发生和癌症生物学13，14，15，16，17。13,14,15,16,17微生物的应用包括确定化合物对各种细菌菌株的最低抑制浓度（MIC）。已经做了几项研究，并得出结论，MIC数据从等温热量测定的大多数细菌物种可以更快地获得，结果类似于其他（标准）方法的MIC测定12，18，19。12,18,19IMC的进一步应用包括观察药物的相互作用和药物治疗与复杂的细菌群落（如生物膜11）的组合。一项以MOA分析为重点的研究表明，微钙计可以检测出第一代和第二代头孢菌素的差异，而同一MOA的不同抗生素则表现出与18种相似的热流曲线。
在这里，我们描述了使用新的等温微计算仪使用 IMC 分析新的天然产品的 MOA 分析。该方法用于确定有效的抗生素浓度，并描述抗生素的杀菌或杀菌机制的特征。该方法可以在化合物的农业部分析中广泛实施，可以取代或至少补充标准的微生物方法。今后的研究将包括深入的指纹分析，使抗生素类别能够基于目标机制进行分化。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

由于抗微生物药物耐药性上升的全球威胁，迫切需要新型抗生素。我们调查来自美索菌的天然产品，作为这种新化合物的创新来源。这一进程中的一个瓶颈通常是阐明其行动模式。我们最近建立了等温微计算法，作为常规分析管道的一部分。该技术允许研究抗生素暴露对细菌代谢反应总的影响，包括与生物量形成分离的过程。重要的是，在测量过程中，无需任何用户干预，即可轻松区分杀菌和杀菌效果。然而，等温微计算是一种相当新的方法，将这种方法应用于不同的细菌物种通常需要对合适的测量条件进行预先评估。有一些参考热图可用于某些细菌，大大方便了对结果的解释。随着参考数据库的稳步增长，我们预计该方法在未来将产生越来越大的影响，并期望它能够进行深入的指纹分析，从而实现抗生素类别的差异化。

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Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

阐明新型抗生素的用法是药物发现过程中一项具有挑战性的任务。此处描述的方法的目标是在抗菌分析中应用等温微计算法，以提供对药物-微生物相互作用的更深入的了解。

使用等温微计算法确定新天然产物的杀菌或杀菌作用的代谢分析

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

了解新型抗菌化合物的用法是一项重要但艰巨的任务。此方法提供了对此类机制的见解，并且易于实现。该技术允许以非侵入性的方式实时观察抗菌效果，从而进一步进行样品分析。虽然用微生物技术练习是一个先决条件，但实验很容易进行。首次执行微计算时，花时间进行数据分析非常重要。首先使用波长为 600 纳米的分光光度计来测量过夜培养的光密度。稀释培养物至每毫升新鲜MHB培养基浓度的5倍至第5菌落形成单位，并在感兴趣的浓度下，在每1.5毫升抗生素管中加入150微升的细胞。然后通过涡旋将化合物与细胞混合。要准备插入物，将每种细菌抗生素混合物的120微升加入48孔板的适当孔中的个别塑料插入物中，并使用钳子将所有钛小瓶放入支架中。轻轻将刀片转移到支架板中的钛瓶中，并松散地将钛盖放在所有小瓶上。当所有刀片都已转移后，将支架放在样品站上的指定区域，并使用设置为 40 百分米的扭矩扳手拧紧所有盖子。在系统软件中，开始新的实验，然后从仪器中收回样品插入臂。将杯架放在桥面上，第 8 列朝向样品插入开口，然后轻轻地将杯架推入位置 1 的仪器中。在给实验井贴上标签之前，请等待 10 分钟，让系统稳定下来。接下来，将样品插入臂推入杯架位于位置 2。让系统稳定 20 分钟后，将样品插入臂推入位置 3，并缩回样品插入臂，直到其处于运行位置。突出显示软件中的所有孔并选择反应开始，然后运行实验，直到热发射读取稳定地回到零。在分析结束时，选择停止。然后，该软件将询问您是否确定。选择"是"并保存实验以进行数据分析。然后将样品插入臂完全插入仪器，并接合磁铁以取回杯架。要分析数据，请打开软件并选择打开实验。在弹出窗口中，选择感兴趣的实验，然后单击"打开"。单击"全部选择"并定义基线以规范化每个位置中的数据。在弹出窗口中，选择滞后阶段内超过 30 分钟的时间段。选择后，基线将在热图中显示为绿色。关闭定义的基线剖面窗口，然后单击"保存"并关闭软件。接下来，打开基于 Web 的 SymCel 热量分析应用程序。单击"浏览"以上载感兴趣的文件并选择实验。代谢参数将自动计算为32个样本。要将热流量数据与 Gompertz 和/或理查兹增长模型配合使用，请单击"增长函数"。增长模型将显示在累积部分中，以便与流部分中的原始数据进行比较。要下载计算的参数，请单击下载度量值，选择文件位置，然后单击"保存"。该文件将导出到电子表格中作进一步分析。在这里，显示通过暴露A.baumannii DSM-30008获得的连续稀释中丙丙沙星获得的热图。浓度在0.005和0.1微摩尔之间对 A.baumannii 生长和新陈代谢的影响最小。然而，用0.5微摩尔齐丙沙星治疗细胞会导致滞后阶段持续时间的显著变化，并导致最大热流量降低。这两个变化一起影响峰值时间，导致大约 6 小时。在此图中，累积释放的热量与时间相绘制，每个浓度的影响由坡度倾斜反映。热图倾斜的定量允许计算A.baumannii在丙丙沙星存在的情况下的最大代谢率，同时在用0.5微摩尔红素治疗的细胞中观察到的代谢率降低。利福平治疗对 A.baumannii DSM-30008 的热图有显著影响。观察到热排放与代谢活性减少相关的显著减少。请注意所有测试浓度达到峰值的时间增加，以及通常归因于杀菌作用的所有浓度的斜率下降导致的代谢率下降。为确保最佳效果，在转移样品时，使用反向移液，防止刀片侧面出现额外的液体，同时确保盖子正确关闭。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

改进的可视化和定量分析，药物使用Micropatterned细胞的影响

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

科研

生物工程

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS功能的无创性代谢轮廓

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

定量和大小分析外囊泡的使用可调电阻脉冲检测

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

使用Cell-基板阻抗和活细胞成像，以衡量矩阵修改诱导实时变化的细胞粘附和去粘附

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

利用N酰基修饰 Mannosamines 对唾液酸的代谢 Glycoengineering

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

在微生物发酵过程中制造一种纳菲安涂层、还原石墨烯 Oxide/Polyaniline 化学电阻传感器, 以实时监测 ph 值

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

使用声学分离器对CHO收获的细胞培养液进行初步澄清

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

用于木材粘合剂内聚强度发展的标准测试方法 ASTM D 7998-19

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

基于莱萨特的无细胞系统中的代谢物分析液色谱耦合折射指数或质谱检测

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...