Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke symcels team for frugtbare diskussioner, og vi vil gerne anerkende den store støtte fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også gerne takke Daniel Kohnhäuser for at levere det naturlige produkt og Stefanie Schmidt for dygtig teknisk support.

BEMÆRK: Instrumenttemperaturen skal indstilles i henhold til den bakterie, der anvendes mindst en dag i forvejen for at sikre systemets stabilitet. Her køres Acinetobacter baumannii DSM30008 prøver ved 30 °C.
1. Kulturforberedelse
<ol><li>Streak ud stammen under efterforskning (her: A. baumannii) på en CASO agar plade og inkubere natten over i en statisk inkubator ved 30 °C.</li>
	<li>Forbered en overnatning kultur ved at vaccinere en enkelt koloni i MHB (Mueller-Hinton bouillon) og inkubere på en rystende inkubator ved 180 rpm ved 30 °C.</li>
</ol>2. Prøveforberedelse
<ol><li>Brug 1,5 ml rør til at forberede koncentrationsområdet for udvalgte lægemidler eller forbindelser (f.eks. ved at tilsætte 1,5 μL 100x stockopløsninger i DMSO; se trin 2.3).</li>
	<li>Fortynd natten kultur i MHB medium.<ol>
<li>Nattens optiske tæthed måles ved hjælp af et spektrofotometer ved en bølgelængde på 600 nm.</li>
		<li>Fortynd kulturen for at opnå 5 x 105 kolonidannende enheder (CFU)/ml i frisk MHB-medium. En OD600 påen svarer til ca. 5 x 108 CFU/ml Staphylococcus aureus(f.eks. A. baumannii BEMÆRK: Det er vigtigt at kalibrere omregningsfaktoren OD600 til CFU/ml for hver enkelt bakteriestamme under de anvendte dyrkningsforhold.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der tilsættes 150 μL af cellerne til de reagensglas, der er fremstillet i trin 2.1, hvilket sikrer korrekt endelig koncentration af det testede lægemiddel eller den testede forbindelse og korrigerer den endelige cellekoncentration.</li>
	<li>Bland forbindelsen med cellerne ved at hvirvle. BEMÆRK: Prøvepladen (se Materialetabel)har seks rækker, der hver indeholder otte brønde, i alt 48 brønde; Række A og række F er den termodynamiske reference. Derfor kan ingen prøver indlæses i disse brønde, tilsvarende medier er indlæst i disse brønde. 32 testprøver kan måles pr. kørsel ved hjælp af brønde i række B-E. Den individuelle prøve skal mindst køres i to eksemplarer (her: alle prøver blev kørt som tre eksemplarer). Vækstkontrol bør medtages.</li>
</ol>3. Indsæt forberedelse
<ol><li>Overfør 120 μL fra den blanding, der er fremstillet i trin 2.4, til plastindsatserne. BEMÆRK: Brug omvendt pipettering i trin 3.1 for at forhindre væske i at sprøjte på siderne af plastindsatserne, hvilket kan føre til interferens med korrekte signaludlæsninger.</li>
	<li>Anlæt alle titaniumhætteglas i holderne (se Materialetabel)med en pincet.</li>
	<li>Overfør forsigtigt idesætterne i titaniumhætteglassene i holderpladen.</li>
	<li>Placer titaniumlåg på alle titaniumhætteglas løst.</li>
</ol>4. Indsætning af indsættelse
<ol><li>Overfør holderen med titanium kopper på prøvestationen og sted på udpeget område.</li>
	<li>Brug momentnøglen, sat til 40 cNm kraft, til at stramme alle lågene.</li>
</ol>5. Kørsel af prøver
<ol><li>I calView-software skal du starte et nyteksperiment ( Supplerende figur 1).</li>
	<li>Træk prøveindføringsarmen tilbage fra instrumentet.</li>
	<li>Kopholderen anbringes på "broen", kolonne 8, der vender mod prøveindføringsåbningen, og skub forsigtigt kopholderen ind i instrumentet ved den angivne "Position 1". Vent 10 minutter på, at systemet stabiliserer sig. Mærl de eksperimentelle brønde.</li>
	<li>Skub prøveindføringsarmen, indtil kopholderen er placeret på den angivne "Position 2". Vent 20 minutter på, at systemet stabiliserer sig.</li>
	<li>Prøveindføringsarmen skubbes ind i "Position 3", og prøveindføringsarmen trækkes tilbage, indtil den er i "Køreposition". Fremhæv alle brøndene i softwaren, og vælg Reaktionsstart ( Supplerende figur 4).</li>
	<li>Kør eksperimentet, indtil varmeemissionen aflæser, er tilbage på nul. BEMÆRK: Sørg for, at alle brønde opfører sig ens inden for disse trin. Supplerende figur 5 illustrerer, hvad der skal observeres, hvis brøndene er indlæst korrekt. Hvis den indlæses forkert, skal du gentage trin 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Fjern kopholderen
<ol><li>I softwaren skal du vælge Stop ( supplerendefigur 6). Softwaren vil derefter spørge, om "du er sikker", skal du vælge Ja ( SupplerendeFigur 7) og gemme eksperimentet på et drev eller desktop til dataanalyse ( Supplerende Figur8).</li>
	<li>Sæt prøveindføringsarmen helt ind i instrumentet, og sæt magneterne i indgreb for at hente kopholderen.</li>
	<li>Løsn lågene, fjern skærene og læg hætteglas og låg i glasholdere, og placer dem i 4 timer ved 180 °C efterfulgt af, at hætteglassene og lågene anbringes i en ekssikator for at sikre, at låg og hætteglas er tørre.</li>
</ol>7. Analyse af data
<ol><li>Åbn softwaren (Supplerende figur 9), vælg Åbn eksperiment i øverste venstre hjørne ( Supplerendefigur 10). Vælg interesseeksperimentet i pop op-vinduet, og tryk på Åbn ( supplerende figur11). Ansøgningen vil åbne eksperimentet i standard brønde visning(Supplerende Figur 12).</li>
	<li>Tryk på Marker alle eller Ctrl+A ( Supplerende figur 13).</li>
	<li>Tryk på Definergrundlinje , normaliserer denne parameter dataene i hver position (supplerende figur 14). I pop op-vinduet skal du vælge en tidsperiode på >30 min placeret i lagfasen (varmestrømmen skal være lav, mellem nul og ti μW; Supplerende figur 15). Efter valg af basislinjetidsperiode vises den valgte grundlinje med grønt i termogrammet. Luk vinduet Definer oprindelig sektion.</li>
	<li>Tryk på Gem eller Ctrl+S, og luk softwaren( supplerende figur 16).</li>
	<li>Åbn webbaseret Symcel Calorimetri-analyseprogram (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Hvis du vil overføre filen til calorimetrianalyseprogrammet, skal du trykke på Gennemse (supplerende figur 17), vælge eksperimentet og trykke på Åbn (supplerende figur 18). De metaboliske parametre beregnes automatisk for de 32 prøver i webapplikationen (supplerende figur 19).</li>
	<li>For at tilpasse varmeflowdataene til Gompertz og/eller Richards vækstmodeller skal du klikke på Vækstfunktion. Vækstmodeller passer vil blive vist i afsnittet "Kumulative", også i forhold til de rå data i afsnittet "Flow" (Supplerende figur 20).</li>
	<li>Tryk på Download Mål for at hente alle beregnede parametre. Vælg filplaceringen, og tryk på Gem ( supplerende figur 21). Filen eksporteres til et regneark til yderligere beregninger.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Projektet blev udført i samarbejde med Symcel, udvikler af calScreener-teknologien. Forfatterne har intet at afsløre.

Isotermisk mikrocalortri måler energi, der udsendes fra en prøve over tid, og denne energiudsætning er et resultat af alle biologiske, fysiske og (bio)kemiske processer. Den målte varmestrøm kan udnyttes til at evaluere eller bestemme antibakterielle virkninger af stoffer, da det muliggør kontinuerlig real-time overvågning af metabolisk aktivitet.
For at opnå pålidelige analysedata skal korrekte startkolonidannende enheder (CFU) bestemmes individuelt for hver anvendte art eller stamme. Hvis CFU-optællingen er for lav, fører det til en langvarig forsinkelsesfase, da det tager længere tid for systemet at nå en kritisk mængde biomasse, der producerer nok varme til at blive opdaget. I tilfælde af CFU tælle er for høj lag fase vil være meget kort, og mængden af varme produceret kan forårsage varmeoverførsel til tilstødende sensor celler (reference og eksperimentelle brønde) og forårsage forvrængninger af termogrammer. Et stort antal CFU vil også føre til en hurtigere iltsvind og skifte til anaerobe forhold. Det skal også tages i betragtning, at det i løbet af eksperimentets første 30 minutter, når systemet er ligevægt, ikke er muligt at indsamle data, og at den faktiske registrering af virkningerne er forsinket. Desuden fører ukorrekt CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som i sidste ende påvirker eksperimentet og de observerede ændringer25. Et andet kritisk punkt er den korrekte bestemmelse af basislinjen. Normalt vælges basissignalet i lagfasen, når varmeflowsignalet er nul, og ideelt set er tidsintervallet for baselinedefinition >30 min. Dette er dog ikke altid muligt, da den tid, bakterierne har brug for for at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, varierer mellem stammer og arter. Nogle arter eller stammer kræver mere end 30 minutter at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, mens andre stammer eller arter når den inden for de første 30 minutter. I så fald er det muligt at vælge grundsignalet i slutningen af forsøget, når alle varmesignalerne er faldet tilbage til nul og forbliver stabile. Alternativt kan baselines fra andre forsøg med samme bakteriestamme anvendes, hvilket dog ikke anbefales.
Systemet giver mulighed for en vis fleksibilitet med hensyn til design og optimering af eksperimenter og fejlfinding. De anvendte mængder er inden for intervallet 100-300 μL ved brug af plastindsatser og 100-600 μL ved brug af titaniumkopper uden plastindsatser. Producentens anbefalede arbejdsvolumen er 120 μL. Brugen af forskellige volumener i forbindelse med oprettelsen af en ny forsøgsserie og samtidig med at der er fundet optimale målbetingelser, har hovedsagelig indvirkning på to parametre. Ved at bruge lavere mængder, mængden af nødvendige testforbindelse kan reduceres, hvilket er særligt vigtigt for forbindelser, som kun er tilgængelige i små mængder. Desuden påvirker den anvendte volumen direkte ilttilgængelighed under målingen med lavere volumener, der øger mængden af tilgængelig ilt, der kræves til bakterievækst. Iltsvind er en af de vigtigste faktorer, der bidrager til den størst mulige varighed af forsøget. Vigtigere er det muligt at bruge faste medier, ikke kun flydende medier. Dette er især vigtigt for langsomt voksende mikroorganismer, da vækst på grænsefladen mellem fast- og gasfasen giver bedre adgang til ilt9.
IMC er et nyttigt analytisk værktøj til at opdage ukendte processer med applikationer inden for fysik, kemi og biologi. Metoden måler varmeudvekslingen inden for et lukket system, og analyse af den registrerede varmeudveksling giver yderligere oplysninger, som ikke altid kan opnås ved hjælp af standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en af de største fordele ved IMC er dens evne til at skelne mellem levende, døde og vedvarende eller sovende celler, hvilket ikke er muligt ved hjælp af standard turbiditet metoder11. Desuden er IMC meget følsom, og det kan detektere varmeemissioner fra så få som 104-105 celler9. En anden fordel er, at den eksperimentelle opsætning er hurtig og nem, og det giver mulighed for kontinuerlig, real-time tracking med minimal til ingen brugerinterferens. Desuden er IMC ikke-destruktiv, hvilket muliggør yderligere analyse af prøver. Dataanalyse giver mulighed for afkobling af biomassedannelse indtil slutningen af eksponentiel eller tidlig stationær fase og metabolisk aktivitet i stationær fase.
Ud over de nye og spændende ansøgning funktioner, der er nævnt ovenfor, er der også ulemper ved denne metode. Den største begrænsning er, at IMC-instrumenter måler den samlede varme, der produceres og frigives i et specifikt system, som også omfatter ikke-specifikke signaler. Dette understreger vigtigheden af eksperimentel planlægning med passende styringer for at kunne vurdere de ændringer i varmesignalet , der måles ved registrering af varmestrømmen9,20.
I vores hænder er IMC et vigtigt redskab til at studere antibakterielle virkninger af nye naturlige produkter og til at bestemme effektive koncentrationsserier. Bortset fra at differentiere bakterostatiske og bakteriid virkninger, det kunne anvendes i fremtiden som en del af mål identifikation undersøgelser og MoA bestemmelse. Dette kan gøres ved at sammenligne termogrammer af forskellige antibiotikaklasser med termogrammer af nye aktive forbindelser som vist her. Det skal dog stadig undersøges, om visse kvantificerbare parametre, der kan udtrækkes fra de målte data, er tilstrækkelige til sådanne sammenligninger, eller om det vil være nødvendigt at arbejde på algoritmer, der giver fingeraftryk baseret på fuld termogram. En anden mulig anvendelse inden for antibiotisk forskning er sammenligningen af wildtype til resistente kloner, kombineret med hele genom sekventering, som kan hjælpe med at belyse tilstanden-of-resistens (MoR) af nye antibakterielle lægemidler. På grund af metodens statiske karakter kan undersøgelse af nye agensers effektivitet på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerede biofilm føre til en bedre forståelse af den biologiske proces og virkningen af udvalgte agenser på mikrober i forskellige stadier af hvile. IMC registrerer den samlede energi, der frigives i form af varme, hvilket gør det til en egnet metode til også at undersøge subhæmmende virkninger af aktive stoffer, der kan kobles til transskriptionomics. Denne metode kan også anvendes i kliniske miljøer til påvisning af kontaminering af prøver eller til bestemmelse af antibiogrammer, der hjælper med hurtigt at træffe beslutning om endelig behandling af patienterne11.

Formålet med denne metode er at anvende isotermisk mikrocalortri (IMC) som en medium gennemløbsanalyse i virkningsform (MoA) profilering af nye antibakterielle forbindelser. Denne metode afslører data om aktiviteten af forbindelser på bakteriearter og giver oplysninger om den bakteriedræbende eller bakteriostatiske karakter af selve forbindelsen.
Fremkomsten af nye antimikrobiel resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger af almindelige infektioner med kendte antibiotika1. Men, søgen efter nye forbindelser og lægemidler, der kan erstatte eller arbejde i kombination med kendte antibiotika er i gang, og dette er bygget på forskellige tilgange. Naturlige produkter er en central aktør i de nuværende drug discovery kampagner og især i anti-infektiøs lægemiddel opdagelse2. Det er imidlertid en langvarig og økonomisk krævende proces at identificere nye blystrukturer for udvikling afantibiotika. Således er de tidlige opdagelsestrin ekstremt vigtige for at filtrere på de fleste lovende stilladser allerede på et tidligt tidspunkt. Indledende trin i naturlige produkt stof opdagelse omfatter opnåelse af en forbindelse struktur, bestemmelse af aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikation. De fleste vellykkede forbindelser er berettiget til yderligere udvikling bør vise et gunstigt spektrum af aktivitet (dvs. bredspektret aktivitet i tilfælde af antibakterielle stoffer) og en roman MoA, som allerede eksisterende AMR kan overvindes. Lovende stilladser screenes derefter typisk i sekundære analyser, som omfatter in vivo biotilgængelighed, toksicitet og stofskifte4. Ud over de finansielle bekymringer, naturlige produkt stof opdagelse står over for yderligere udfordringer med hensyn til omkostninger og tekniske vanskeligheder i forbindelse med sammensatte isolation og rensning, som igen kan gøre det vanskeligt at opnå multi-milligram eller endda gram beløb i de tidlige stadier af opdagelsenproces 5,6. Derfor er det af største betydning i forskning i naturlige produkter at kunne udføre state-of-the-art primær screening med minimale sammensatte mængder for at træffe en velinformeret beslutning om yderligere investeringer for at gøre et nyt naturprodukt tilgængeligt for præklinisk udvikling. Med brugen af IMC til antibakteriel profilering reduceres mængden af den nødvendige mængde forbindelse betydeligt i forhold til standardmetoder. Teknikken giver også mere dybdegående information om samspillet mellem nye lægemidler med det mikrobielle samfund7.
IMC er en veletableret metode til måling af den samlede energi som følge af alle biologiske, fysiske og biokemiske processer og reaktioner i et biologisk system. Bakteriel energi frigivelse er proportional med den samlede metaboliske reaktioner8. Inden for et lukket system, såsom det anvendte mikrokalatormeter, kan varmeniveauerne måles i mikrowatt-området for at studere de metaboliske kinetikafbakterier9,10,,11,12. Den varme (energi), der frigives af bakterier er knyttet til cellulære funktioner, der ligger til grund for deres stofskifte, og som ikke nødvendigvis er proportional med den cellulære biomasse.
I første omgang har anvendeligheden af isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser været begrænset på grund af dens lave gennemløb og høje testmængder. Men det anvendte mikrokalorimeter er unikt, da det kombinerer fordelene ved isotermisk kalorimetri med øget gennemløb og lavere sammensatte krav, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til drug discovery applikationer10. Endvidere giver instrumentet yderligere fordele i forhold til alternative metoder til måling af bakterievækstkinetik, såsom standard turbiditetsmetoden, som er baseret på måling af optisk tæthed ved 600 nm (OD<600). Måling af OD600 er baseret på den antagelse, at øget optisk tæthed er lig med mikrobiel vækst, hvorved tilstedeværelsen af ikke-levedygtige celler forsømmes. Denne metode er også blevet kritiseret, da den udelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I modsætning hertil giver IMC mulighed for real-time observation af enhver form for levedygtige celler. Hvis cellerne er i dvale, udviser de stadig metabolisk aktivitet, og de kan således detekteres af IMC, mens sådanne fænomener ikke kan påvises ved standard turbiditetsmetoden11. Andre fordele ved IMC omfatter en kortere antimikrobiel følsomhed testtid, måling af lægemiddelinteraktioner i et komplekst samfund og standard analysemetoder uden at ødelæggeprøven 7.
IMC-teknologien er blevet implementeret i en lang række undersøgelser, lige fra mikrobiologi til termogenese og kræftbiologi13,14,15,16,17. De mikrobielle anvendelser omfatter bestemmelse af minimale hæmmende koncentrationer (MIC) af forbindelser mod forskellige bakteriestammer. Der er udført flere undersøgelser, og det er blevet konkluderet, at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for størstedelen af bakteriearterne hurtigere kan opnås , og resultaterne svarer til andre (standard) metoder tilMIC-bestemmelse 12,18,19. Yderligere anvendelser af IMC omfatter observere samspillet mellem narkotika og kombination af narkotika behandlinger med komplekse bakterielle samfund såsom biofilm11. En undersøgelse med fokus på MoA profilering viste, at mikrokalorimet kan påvise en forskel i første- og andengeneration cephalosporiner, mens forskellige antibiotika med samme MoA udviser en lignende varmestrømskurve sammenlignet medhinanden 18.
Her beskriver vi brugen af IMC til MoA profilering af nye naturlige produkter ved hjælp af det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrument. Metoden anvendes til at bestemme effektive antibiotikakoncentrationer og til at beskrive antibiotikas karakteristika i form af baktericid eller bakterostatiske mekanismer. Metoden kan gennemføres bredt i MoA profilering af forbindelser, og den kan erstatte eller i det mindste supplere standardmikrobiologiske metoder. Fremtidige undersøgelser vil omfatte dybdegående fingeraftryksanalyser, der vil gøre det muligt at differentiere antibiotikaklasser baseret på målmekanismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

På grund af den globale trussel om stigende antimikrobiel resistens er der et presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøger naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til sådanne nye forbindelser. En flaskehals i processen er typisk belysning af deres virkningsmåde. Vi har for nylig etableret isotermisk mikrocalortri som en del af en rutinemæssig profilering rørledning. Denne teknologi gør det muligt at undersøge effekten af antibiotika eksponering på den samlede bakterielle metaboliske respons, herunder processer, der er afkoblet fra biomasse dannelse. Det er vigtigt, at bakterostatiske og bakteriidseffekter let kan skelnes uden brugerindgriben under målingerne. Isotermisk mikrocalortri er imidlertid en ret ny tilgang, og anvendelsen af denne metode på forskellige bakteriearter kræver normalt forudgående vurdering af passende målebetingelser. Der er nogle reference termogrammer til rådighed for visse bakterier, i høj grad lette fortolkningen af resultaterne. Da puljen af referencedata vokser støt, forventer vi, at metoden vil have stigende virkning i fremtiden, og forventer, at den giver mulighed for dybdegående fingeraftryksanalyser, der gør det muligt at differentiere antibiotikaklasser.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Belysningen af virkningsmåden for et nyt antibiotikum er en udfordrende opgave i lægemiddelopdagelsesprocessen. Målet med den metode, der er beskrevet her, er anvendelsen af isotermisk mikrocalortri ved hjælp af calScreener i antibakterielle profilering for at give yderligere indsigt i lægemiddel-mikrobe interaktioner.

Metabolisk profilering til bestemmelse af baktericid eller bakterostatiske virkninger af nye naturlige produkter ved hjælp af isotermisk mikrocalortri

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Forståelse af virkningsmåde for nye antibakterielle forbindelser er en vigtig, men vanskelig opgave. Denne metode giver indsigt i sådanne mekanismer, og det er nemt at implementere. Denne teknik giver mulighed for en real-time observation af antibakterielle virkninger i en noninvasive måde muliggør yderligere prøve analyse.Selvom det er en forudsætning at praktisere med mikrobiologiske teknikker, er eksperimentet let at udføre. At tage dig tid med dataanalyse er meget vigtigt, når du udfører mikrokalorimetri for første gang. Begynd med at bruge et spektrofotometer ved en bølgelængde på 600 nanometer til at måle den optiske tæthed af natten kultur.Fortyndet kulturen til en 5 gange 10 til den femte koloni danner enheder pr milliliter frisk MHB medium koncentration og tilsæt 150 mikroliter af celler til hver 1,5 milliliter tube antibiotika ved koncentrationen af interesse. Bland derefter forbindelsen med cellerne ved at vortexing. For at forberede skær, tilsæt 120 mikroliter af hver bakterier antibiotika blanding i individuelle plast skær i de relevante brønde af en 48-brønd plade og bruge pincet til at placere alle titanium hætteglas i indehaverne.Overfør forsigtigt skærene i titaniumhætteglasset i holderpladen og læg forsigtigt titaniumlågene på alle hætteglassene. Når alle indsatserne er overført, anbringes holderen på det udpegede område på prøvestationen, og der anvendes en momentnøgle indstillet til 40 centinewtonmeter for at stramme alle lågene. I systemsoftwaren skal du starte et nyt eksperiment og trække prøveindføringsarmen tilbage fra instrumentet.Sæt kopholderen på broen med kolonne otte mod prøveindføringsåbningen, og skub forsigtigt kopholderen ind i instrumentet på position et. Vent 10 minutter for systemet at stabilisere, før mærkning af eksperimentelle brønde. Skub derefter prøveindføringsarmen, indtil kopholderen er placeret to.Når systemet er stabiliseret i 20 minutter, skubbes prøveindføringsarmen for at placere tre og trække prøveindføringsarmen tilbage, indtil den er i kørestilling. Fremhæv alle brøndene i softwaren, og vælg reaktionsstart, og kør derefter eksperimentet, indtil varmeemissionen aflæser er stabilt tilbage ved nul. Vælg stop i slutningen af analysen.Softwaren vil derefter spørge, om du er sikker. Vælg ja, og gem eksperimentet til dataanalyse. Sæt derefter prøveindføringsarmen helt ind i instrumentet, og sæt magneterne i indgreb for at hente kopholderen.Hvis du vil analysere dataene, skal du åbne softwaren og vælge et åbent eksperiment. Vælg det interesseeksperiment i pop op-vinduet, og klik på åbn. Klik på Markér alle, og definer grundlinje for at normalisere dataene på hver position.I pop op-vinduet skal du vælge en tidsperiode på mere end 30 minutter inden for forsinkelsesfasen. Efter markering vises grundlinjen med grønt i termogrammet. Luk vinduet definer oprindelige sektion, og klik derefter på Gem, og luk softwaren.Åbn derefter det webbaserede SymCel-kalorimetrianalyseprogram. Klik på Gennemse for at overføre den fil, der er interesse, og vælg eksperimentet. De metaboliske parametre vil automatisk blive beregnet for de 32 prøver.Klik på vækstfunktion for at tilpasse varmeflowdataene til Gompertz- og/eller Richards Vækstmodeller. Vækstmodeller vises i den kumulative sektion til sammenligning med de rå data i flowsektionen. Hvis du vil hente de beregnede parametre, skal du klikke på overførselsforanstaltninger, vælge filplaceringen og klikke på Gem.Filen eksporteres til et regneark til yderligere analyse. Her vises termogrammer, der opnås ved at udsætte A.baumannii DSM-30008 for ciprofloxacin i serielle fortyndinger. Koncentrationer mellem 0,005 og 0,1 mikromolar har en minimal effekt på A.baumannii vækst og stofskifte.Behandling af cellerne med 0,5 mikromolar ciprofloxacin fører imidlertid til et betydeligt skift i den mellemliggende fasevarighed og til en lavere maksimal varmestrøm. Disse to ændringer påvirker tilsammen den tid, der skal toppe, hvilket resulterer i en stigning på ca. seks timer. I dette tal afbildes den kumulative frigivne varme mod tiden, hvor effekten af hver koncentration afspejles af en hældning af hældning.Kvantificering af termogramskridningen gør det muligt at beregne den maksimale stofskifte for A.baumannii ved tilstedeværelse af ciprofloxacin med et samtidig fald i stofskiftet observeret i celler behandlet med 0,5 mikromolar ciprofloxacin. Rifampicin behandling har en dramatisk effekt på termogrammer af A.baumannii DSM-30008. Der observeres også en signifikant reduktion af varmeemissionen, der korrelerer med et fald i metabolisk aktivitet.Bemærk stigningen i tid til at toppe for alle de testede koncentrationer og faldet i stofskiftet forårsaget af faldet i hældningen for alle de koncentrationer, der normalt tilskrives en bakteriedræbende virkning. For at sikre optimale resultater skal du bruge bakrør og forhindre yderligere væske i skærets sider ved overførsel af prøven, og sørg også for, at lågene er ordentligt lukket.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktiverede Noninvasiv stofskifteprofil

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantificering og Størrelse-profilering af ekstracellulær blærer Brug Tunable Resistiv Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metaboliske Glycoengineering Sialic syre ved hjælp af N-acyl-ændret Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Fremstilling af en Nafion-belagt, reduceret Graphene oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor til skærm pH i Real-time under mikrobiel gæring

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Standard testmetode ASTM D 7998-19 til udvikling af sammenhængende styrke af træklæbemidler

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Hurtig samling af multigenkonstruktioner ved hjælp af modulær golden gate-kloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Flydende kromatografi koblet til brydningsindeks eller massespektrometrisk detektion til metabolitprofilering i lysatbaserede cellefrie systemer

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...