Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

De auteurs willen het team van Symcel bedanken voor vruchtbare discussies en we willen de grote steun van Ganna Oliynyk en Wilhelm Paulander erkennen. We willen ook Daniel Kohnhäuser bedanken voor het leveren van het natuurlijke product en Stefanie Schmidt voor bekwame technische ondersteuning.

OPMERKING: De temperatuur van het instrument moet worden ingesteld op basis van de bacterie die ten minste een dag van tevoren wordt gebruikt om de stabiliteit van het systeem te garanderen. Hier worden Acinetobacter baumannii DSM30008 monsters uitgevoerd op 30 °C.
1. Cultuurvoorbereiding
<ol><li>Streep de stam uit die onderzocht wordt (hier: A. baumannii)op een CASO agarplaat en broeder 's nachts in een statische couveuse bij 30 °C.</li>
	<li>Bereid een nachtelijke cultuur voor door een enkele kolonie in MHB (Mueller-Hinton bouillon) in te en inculeren op een schuddende couveuse bij 180 rpm bij 30 °C.</li>
</ol>2. Bereiding van monsters
<ol><li>Gebruik buizen van 1,5 mL om het concentratiebereik van geselecteerde geneesmiddelen of verbindingen voor te bereiden (bijvoorbeeld door 1,5 μL 100x voorraadoplossingen in DMSO toe te voegen; zie stap 2.3).</li>
	<li>Verdun de nachtcultuur in MHB-medium.<ol>
<li>Meet de optische dichtheid van de nachtcultuur met behulp van een spectrofotometer op een golflengte van 600 nm.</li>
		<li>Verdun de cultuur om 5 x 105 kolonievormende eenheden (CFU)/mL in vers MHB-medium te verkrijgen. Een OD600 van een is ongeveer 5 x 108 CFU/mL (bijvoorbeeld Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). OPMERKING: Het is belangrijk om de conversiefactor OD600 te kalibreren naar CFU/mL voor elke individuele bacteriestam onder de toegepaste kweekomstandigheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 150 μL van de cellen toe aan de in stap 2.1 bereide reageerbuizen, zodat de uiteindelijke concentratie van getest medicijn of verbinding correct wordt en de uiteindelijke celconcentratie correct wordt.</li>
	<li>Meng de verbinding met de cellen door vortexing. OPMERKING: De monsterplaat (zie tabel met materialen)heeft zes rijen, elk met acht putten, in totaal 48 putten; Rij A en Rij F zijn de thermodynamische referentie. Daarom kunnen er geen monsters in die putten worden geladen, overeenkomstige media worden in die putten geladen. 32 testmonsters kunnen per run worden gemeten met behulp van putten in rijen B-E. Het individuele testmonster moet minimaal in tweevoud worden uitgevoerd (hier: alle monsters zijn uitgevoerd als driedubbele). Er moeten groeicontroles worden opgenomen.</li>
</ol>3. Invoegen voorbereiding
<ol><li>Breng 120 μL van het mengsel bereid in stap 2.4 naar de plastic inzetstukken. OPMERKING: Gebruik reverse pipetting in stap 3.1 om te voorkomen dat er vloeistof op de zijkanten van de kunststof wisselplaten spuit, wat kan leiden tot interferentie met de juiste signaaluitlezing.</li>
	<li>Plaats alle titanium flesjes in de houders (zie Tabel van Materialen) met een pincet.</li>
	<li>Breng de inzetstukken voorzichtig in de titanium flacons in de houderplaat.</li>
	<li>Plaats los titanium deksels op alle titanium flesjes.</li>
</ol>4. Invoegen
<ol><li>Breng de houder met titanium bekers op het monsterstation en plaats op het aangewezen gebied.</li>
	<li>Gebruik de koppelsleutel, ingesteld op 40 cNm kracht, om alle deksels aan te draaien.</li>
</ol>5. Lopende monsters
<ol><li>Start in calView-software een nieuw experiment(supplementisch figuur 1).</li>
	<li>Trek de invoegarm van het monster uit het instrument.</li>
	<li>Plaats de bekerhouder op de "brug", kolom 8 naar de opening van het monster en duw de bekerhouder voorzichtig in het instrument op de aangewezen "Positie 1". Wacht 10 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Label de experimentele putten.</li>
	<li>Duw de invoegarm tot de bekerhouder zich op de aangewezen "Positie 2" bevindt. Wacht 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd.</li>
	<li>Duw de invoegarm van het monster in "Positie 3" en trek de invoegarm in totdat deze zich op de "Looppositie" bevindt. Markeer alle putten in de software en selecteer Reaction Start (Supplemental Figuur 4).</li>
	<li>Voer het experiment uit totdat de warmte-emissie leest zijn stabiel terug op nul. LET OP: Zorg ervoor dat alle putten zich in deze stappen hetzelfde gedragen. Aanvullende figuur 5 illustreert wat moet worden waargenomen als de putten correct worden geladen. Als deze verkeerd is geladen, herhaalt u stap 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Verwijder de bekerhouder
<ol><li>Selecteer in de software Stop (Supplementaal figuur 6). De software zal dan vragen of "u zeker bent", selecteer Ja (Supplemental Figuur 7) en sla het experiment op een station of desktop voor data-analyse (Supplemental Figuur 8).</li>
	<li>Steek de invoegarm volledig in het instrument en schakel de magneten in om de bekerhouder op te halen.</li>
	<li>Maak de deksels los, verwijder de inzetstukken en plaats de flesjes en deksels in glazen houders en plaats gedurende 4 uur bij 180 °C, gevolgd door het plaatsen van de flacons en deksels in een desiccator om ervoor te zorgen dat deksels en flesjes droog zijn.</li>
</ol>7. Analyseren van gegevens
<ol><li>Open de software (Supplemental figuur 9), selecteer Experiment openen in de linkerbovenhoek(Supplemental figuur 10). Selecteer in het pop-upvenster het interesseexperiment en druk op Openen (Aanvullende figuur 11). De toepassing opent het experiment in de standaardputtenweergave(supplementisch figuur 12).</li>
	<li>Druk op Alles selecteren of Ctrl+A (aanvullende figuur 13).</li>
	<li>Druk op Basislijn definiëren, deze parameter normaliseert de gegevens in elke positie(supplement figuur 14). Selecteer in het pop-upvenster een periode van >30 min in de vertragingsfase (de warmtestroom moet laag zijn, tussen nul en tien μW; Aanvullend figuur 15). Na de selectie van de basislijnperiode wordt de gekozen basislijn in het groen in het thermogram weergegeven. Sluit het venster Basislijnsectie definiëren.</li>
	<li>Druk op Opslaan of Ctrl+S en sluit de software (Supplemental figuur 16).</li>
	<li>Open webgebaseerde Symcel Calorimetry analyse applicatie (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Als u het bestand wilt uploaden naar de calorimetrieanalysetoepassing, drukt u op Bladeren (Supplementaal figuur 17),selecteert u het experiment en drukt u op Openen (Supplementaal figuur 18). De metabolische parameters worden automatisch berekend voor de 32 monsters in de webapplicatie(supplementisch figuur 19).</li>
	<li>Om de warmtestroomgegevens te passen aan Gompertz en/of Richard's groeimodellen klik op Groeifunctie. De fit van groeimodellen wordt weergegeven in de sectie "Cumulatief", ook in vergelijking met de ruwe gegevens in de sectie "Flow" (Supplementaal figuur 20).</li>
	<li>Als u alle berekende parameters wilt downloaden, drukt u op Downloadmaatjes. Selecteer de bestandslocatie en druk op Opslaan (Supplemental figuur 21). Het bestand wordt geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere berekeningen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Het project werd uitgevoerd in samenwerking met Symcel, ontwikkelaar van de calScreener technologie. De auteurs hebben niets te onthullen.

Isothermale microcalorimetrie meet de energie die in de loop van de tijd uit een monster wordt uitgestoten en deze energieafgifte is het resultaat van alle biologische, fysische en (bio)chemische processen. De gemeten warmtestroom kan worden benut om antibacteriële effecten van stoffen te evalueren of te bepalen, omdat het een continue real-time monitoring van metabolische activiteit mogelijk maakt.
Om betrouwbare gegevens voor analyse te verkrijgen, moeten voor elke gebruikte soort of stam de juiste startkolonievormende eenheden (CFU) afzonderlijk worden bepaald. In het geval dat het CFU-aantal te laag is, leidt dit tot een langdurige vertragingsfase omdat het langer duurt voordat het systeem een kritische hoeveelheid biomassa bereikt die voldoende warmte produceert om te detecteren. In het geval dat de CFU telling is te hoog de vertraging fase zal zeer kort zijn, en de hoeveelheid warmte geproduceerd kan leiden tot warmteoverdracht naar naburige sensorcellen (referentie en experimentele putten) en veroorzaken vervormingen van de thermogrammen. Hoge aantallen CFU zal ook leiden tot een snellere zuurstofuitputting en overschakelen naar anaërobe omstandigheden. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat tijdens de eerste 30 minuten van het experiment, wanneer het systeem in evenwicht is, het verzamelen van gegevens niet mogelijk is en de feitelijke registratie van effecten wordt vertraagd. Bovendien leidt onjuiste CFU-bepaling tot valse MIC-bepaling, wat uiteindelijk van invloed is op het experiment en de waargenomen veranderingen25. Een ander kritiek punt is de juiste bepaling van de basislijn. Meestal wordt het basislijnsignaal geselecteerd tijdens de vertragingsfase wanneer het warmtestroomsignaal nul is en idealiter is het tijdsbereik voor basislijndefinitie >30 min. Dit is echter niet altijd mogelijk omdat de tijd die de bacteriën nodig hebben om de detectielimiet voor warmtesignalen te bereiken, verschilt tussen stammen en soorten. Sommige soorten of stammen hebben meer dan 30 minuten nodig om de detectielimiet voor warmtesignaal te bereiken, terwijl andere stammen of soorten het binnen de eerste 30 minuten bereiken. In dat geval is het mogelijk om het basislijnsignaal aan het einde van het experiment te selecteren wanneer alle warmtesignalen zijn teruggevallen naar nul en stabiel blijven. Als alternatief kunnen basislijnen van andere experimenten met dezelfde bacteriestam worden gebruikt, wat echter niet wordt aanbevolen.
Het systeem zorgt voor enige flexibiliteit op het gebied van ontwerp en optimalisatie van experimenten en probleemoplossing. De gebruikte volumes zijn in het bereik van 100-300 μL bij gebruik van kunststof inzetstukken en 100-600 μL bij het gebruik van titanium bekers zonder de plastic inzetstukken. Het aanbevolen werkvolume van de fabrikant is 120 μL. Het gebruik van verschillende volumes bij het opzetten van een nieuwe experimentele serie, en het vinden van optimale omstandigheden voor metingen, heeft vooral invloed op twee parameters. Door het gebruik van lagere volumes kan de hoeveelheid vereiste testverbinding worden verminderd, wat vooral belangrijk is voor verbindingen, die slechts in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. Bovendien heeft het gebruikte volume direct invloed op de beschikbaarheid van zuurstof tijdens de meting, waarbij lagere volumes de hoeveelheid beschikbare zuurstof verhogen die nodig is voor bacteriële groei. Zuurstofuitputting is een van de belangrijkste factoren die bijdragen aan de maximale duur van het experiment. Belangrijk is dat het mogelijk is om vaste media te gebruiken, niet alleen vloeibare media. Dit is vooral belangrijk voor langzaam groeiende micro-organismen, omdat groei op het raakvlak tussen vaste en gasfase een betere zuurstoftoegang mogelijk maakt9.
IMC is een nuttig analytisch instrument om onbekende processen te ontdekken met toepassingen in de natuurkunde, chemie en biologie. De methode meet de warmte-uitwisseling binnen een gesloten systeem en de analyse van de geregistreerde warmte-uitwisseling levert aanvullende informatie op die niet altijd met standaardmethoden kan worden verkregen. In microbiologie en antibiotica onderzoek, een van de grootste voordelen van IMC is het vermogen om onderscheid te maken tussen levende, dode en aanhoudende of slapende cellen, die niet mogelijk is met behulp van standaard troebelheid methoden11. Bovendien is IMC zeer gevoelig en kan het warmte-emissie detecteren van slechts 104-105 cellen9. Een ander voordeel is dat de experimentele setup is snel en eenvoudig, en het zorgt voor continue, real-time tracking met minimale tot geen interferentie van de gebruiker. Verder is IMC niet-destructief, wat verdere analyse van monsters mogelijk maakt. Data-analyse maakt het mogelijk om biomassavorming te ontkoppelen tot laat exponentieel of vroeg stationaire fase en metabolische activiteit in stationaire fase.
Naast de nieuwe en spannende applicatie functies hierboven vermeld, zijn er ook nadelen aan deze methode. De belangrijkste beperking is dat IMC-instrumenten de totale warmte meten die binnen een specifiek systeem wordt geproduceerd en vrijgegeven, waaronder ook niet-specifieke signalen. Dit onderstreept het belang van experimentele planning met passende controles om de veranderingen in het warmtesignaal te kunnen beoordelen die worden gemeten door de warmtestroom9,20vastte leggen .
In onze handen is IMC een belangrijk hulpmiddel om antibacteriële effecten van nieuwe natuurlijke producten te bestuderen en effectieve concentratiebereiken te bepalen. Afgezien van het onderscheiden van bacteriostatische en bactericide effecten, kan het in de toekomst worden gebruikt als onderdeel van doelidentificatiestudies en MoA-bepaling. Dit kan worden gedaan door thermogrammen van verschillende antibioticaklassen te vergelijken met thermogrammen van nieuwe actieve verbindingen zoals hier weergegeven. Er moet echter nog worden onderzocht of bepaalde kwantificeerbare parameters die uit de gemeten gegevens kunnen worden gehaald, voldoende zijn voor dergelijke vergelijkingen of dat het nodig zal zijn om te werken aan algoritmen die vingerafdrukken geven op basis van volledige thermogrammen. Een andere mogelijke toepassing op het gebied van antibioticaonderzoek is de vergelijking van wildtype met resistente klonen, in combinatie met hele genoomsequencing, die kan helpen bij het ophelderen van de resistentiemodus (MoR) van nieuwe antibacteriële stoffen. Vanwege de statische aard van de methode kan onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe agentia op biofilmvorming of op reeds gevestigde biofilms leiden tot een beter begrip van het biologische proces en het effect van geselecteerde agentia op microben in verschillende stadia van de slaapstand. IMC registreert totale energie die vrijkomt in de vorm van warmte waardoor het een geschikte methode is om ook subremmende effecten van werkzame stoffen die kunnen worden gekoppeld aan transcriptie te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt in klinische omgevingen om besmetting van monsters op te sporen of voor de bepaling van antibiogrammen die helpen om snel te beslissen over een definitieve behandeling van de patiënten11.

Het doel van deze methode is om isothermale microcalorimetrie (IMC) toe te passen als een medium doorvoertest in mode-of-action (MoA) profilering van nieuwe antibacteriële verbindingen. Deze methode onthult gegevens over de activiteit van verbindingen op bacteriële soorten en geeft informatie over de bactericide of bacteriostatische aard van de verbinding zelf.
De opkomst van opkomende antimicrobiële resistentie (AMR) is een wereldwijd probleem en het leidt tot minder effectieve behandelingen van veelvoorkomende infecties met bekende antibiotica1. Echter, het zoeken naar nieuwe verbindingen en geneesmiddelen die kunnen vervangen of werken in combinatie met bekende antibiotica zijn aan de gang en dit is gebouwd op diverse benaderingen. Natuurlijke producten zijn een belangrijke speler in de huidige drug discovery campagnes en in het bijzonder in anti-infectieve drug discovery2. Het identificeren van nieuwe loodstructuren voor de ontwikkeling van antibiotica is echter een langdurig en financieel veeleisend proces3. Dus, de eerste stappen van ontdekking zijn uiterst belangrijk om te filteren op de meeste veelbelovende steigers al in een vroeg stadium. De eerste stappen in de ontdekking van natuurlijke producten zijn het verkrijgen van de structuur van een verbinding, het bepalen van de activiteit in vitro samen met MoA en doelidentificatie. De meeste succesvolle verbindingen die in aanmerking komen voor verdere ontwikkeling moeten een gunstig spectrum van activiteit vertonen (d.w.z. breedspectrumactiviteit in het geval van antibacteriële stoffen) en een nieuw MoA waarmee reeds bestaande AMR kan worden overwonnen. Veelbelovende steigers worden dan meestal gescreend in secundaire tests, waaronder in vivo biologische beschikbaarheid, toxiciteit en metabolisme4. Naast de financiële zorgen wordt de ontdekking van natuurlijke geneesmiddelen nog meer uitdagingen met betrekking tot de kosten en technische problemen in verband met samengestelde isolatie en zuivering, die het op zijn beurt moeilijk kunnen maken om in de vroege stadia van het ontdekkingsproces5,6. Daarom is het van het grootste belang in het onderzoek naar natuurlijke producten om state-of-the-art primaire screening met minimale samengestelde bedragen uit te voeren om een goed geïnformeerde beslissing te nemen over verdere investeringen om een nieuw natuurproduct toegankelijk te maken voor preklinische ontwikkeling. Met het gebruik van IMC voor antibacteriële profilering wordt de benodigde hoeveelheid verbinding aanzienlijk verminderd in vergelijking met standaardmethoden. De techniek biedt ook meer diepgaande informatie over de interactie van nieuwe geneesmiddelen met de microbiële gemeenschap7.
IMC is een gevestigde methode voor het meten van totale energie als gevolg van alle biologische, fysische en biochemische processen en reacties in een biologisch systeem. Bacteriële energie-release is evenredig aan de totale metabolische reacties8. Binnen een gesloten systeem, zoals de gebruikte microcalorimeter, kunnen de warmteniveaus worden gemeten in het microwattbereik om de metabolische kinetiek van bacteriën9,10,11,12te bestuderen . De warmte (energie) die vrijkomt door bacteriën is gekoppeld aan cellulaire functies die ten grondslag liggen aan hun metabolisme en die niet noodzakelijkerwijs evenredig zijn met de cellulaire biomassa.
Aanvankelijk is de toepasbaarheid van isothermale calorimetrie voor microbiologische tests beperkt vanwege de lage doorvoer en hoge testvolumes. Echter, de gebruikte microcalorimeter is uniek omdat het de voordelen van isothermale calorimetrie combineert met verhoogde doorvoer en lagere samengestelde vereisten, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen10. Bovendien biedt het instrument verdere voordelen ten opzichte van alternatieve methoden voor het meten van bacteriële groeikinetiek, zoals de standaard troebelheidsmethode, die is gebaseerd op de meting van de optische dichtheid bij 600 nm (OD<600). Het meten van OD600 is gebaseerd op de veronderstelling dat de toegenomen optische dichtheid gelijk is aan microbiële groei, waardoor de aanwezigheid van niet-levensvatbare cellen wordt verwaarloosd. Deze methode is ook bekritiseerd omdat het kleine kolonievarianten en persister cellen11 uitsluit. IMC maakt daarentegen de real-time observatie van elk type levensvatbare cellen mogelijk. Als cellen slapend zijn, vertonen ze nog steeds metabolische activiteit en kunnen ze dus door IMC worden gedetecteerd, terwijl dergelijke verschijnselen niet kunnen worden gedetecteerd door de standaard troebelheidsmethode11. Andere voordelen van IMC zijn een kortere antimicrobiële gevoeligheidstesttijd, het meten van interacties met geneesmiddelen in een complexe gemeenschap en standaard analysemethoden zonder het monster te vernietigen7.
De IMC-technologie is geïmplementeerd in een breed scala aan studies, variërend van microbiologie tot thermogenese en kankerbiologie13,14,15,16,17. De microbiële toepassingen omvatten de bepaling van minimale remmende concentraties (MIC) van verbindingen tegen verschillende bacteriële stammen. Er zijn verschillende studies uitgevoerd en er is geconcludeerd dat MIC-gegevens uit isothermale calorimetrie voor de meeste bacteriële soorten sneller kunnen worden verkregen en dat de resultaten vergelijkbaar zijn met andere (standaard)methoden voor MIC-bepaling12,18,19. Andere toepassingen van IMC omvatten het observeren van de interactie van geneesmiddelen en de combinatie van medicamenteuze behandelingen met complexe bacteriële gemeenschappen zoals biofilms11. Een studie gericht op MoA-profilering toonde aan dat de microcalorimeter een verschil in eerste- en tweede generatie cefalosporines kan detecteren, terwijl verschillende antibiotica met hetzelfde MoA een vergelijkbare warmtestroomcurve vertonen in vergelijking met elkaar18.
Hier beschrijven we het gebruik van IMC voor MoA profilering van nieuwe natuurlijke producten met behulp van het nieuwe isothermale microcalorimetrie instrument. De methode wordt gebruikt om effectieve antibioticaconcentraties te bepalen en om kenmerken van antibiotica te beschrijven in termen van bactericide of bacteriostatische mechanismen. De methode kan in grote lijnen worden geïmplementeerd in MoA-profilering van verbindingen en kan standaard microbiologische methoden vervangen of op zijn minst aanvullen. Toekomstige studies zullen diepgaande vingerafdrukanalyses omvatten die de differentiatie van antibioticaklassen op basis van doelmechanismen mogelijk maken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

Vanwege de wereldwijde dreiging van toenemende antimicrobiële resistentie zijn nieuwe antibiotica dringend nodig. We onderzoeken natuurlijke producten van Myxobacteria als een innovatieve bron van dergelijke nieuwe verbindingen. Een knelpunt in het proces is meestal de opheldering van hun werkingsmodus. We hebben onlangs isothermale microcalorimetrie opgericht als onderdeel van een routineprofileringspijplijn. Deze technologie maakt het mogelijk om het effect van blootstelling aan antibiotica op de totale bacteriële metabole respons te onderzoeken, inclusief processen die zijn losgekoppeld van biomassavorming. Belangrijk is dat bacteriostatische en bactericide effecten gemakkelijk te onderscheiden zijn zonder tussenkomst van de gebruiker tijdens de metingen. Echter, isothermale microcalorimetrie is een vrij nieuwe aanpak en de toepassing van deze methode op verschillende bacteriële soorten vereist meestal pre-evaluatie van geschikte meetomstandigheden. Er zijn enkele referentie thermogrammen beschikbaar van bepaalde bacteriën, sterk vergemakkelijken interpretatie van de resultaten. Aangezien de pool van referentiegegevens gestaag groeit, verwachten we dat de methodologie in de toekomst een steeds grotere impact zal hebben en verwachten we dat deze diepgaande vingerafdrukanalyses mogelijk zal maken die de differentiatie van antibioticaklassen mogelijk maken.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

De opheldering van de werkingsmodus van een nieuw antibioticum is een uitdagende taak in het drugsontdekkingsproces. Het doel van de hier beschreven methode is de toepassing van isothermale microcalorimetrie met calScreener in antibacteriële profilering om extra inzicht te geven in interacties tussen geneesmiddelen microbe.

Metabolische profilering om bactericide of bacteriostatische effecten van nieuwe natuurlijke producten te bepalen met behulp van isothermale microcalorimetrie

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Inzicht in de werkingswijze van nieuwe antibacteriële verbindingen is een belangrijke maar moeilijke taak. Deze methode biedt inzicht in dergelijke mechanismen en is eenvoudig te implementeren. Deze techniek maakt een real-time observatie van antibacteriële effecten op een niet-invasieve manier mogelijk verdere monsteranalyse.Hoewel oefenen met microbiologische technieken een voorwaarde is, is het experiment eenvoudig uit te voeren. Het nemen van de tijd met data-analyse is erg belangrijk bij het uitvoeren van microcalorimetrie voor de eerste keer. Begin met het gebruik van een spectrofotometer op een golflengte van 600 nanometer om de optische dichtheid van de nachtelijke cultuur te meten.Verdun de cultuur tot een 5 keer 10 tot de 5e kolonie vormen eenheden per milliliter van verse MHB medium concentratie en voeg 150 microliter cellen aan elke 1,5 milliliter buis van antibioticum bij de concentratie van belang. Meng vervolgens de verbinding met de cellen door vortexing. Om de wisselplaten voor te bereiden, voeg 120 microliters van elke bacterie antibioticum mengsel in individuele plastic inserts in de juiste putten van een 48-well plaat en gebruik pincet om alle titanium flacons plaats in de houders.Breng de inzetstukken voorzichtig over in de titanium flacons in de houderplaat en plaats losjes titanium deksels op alle flesjes. Wanneer alle wisselplaten zijn overgedragen, plaatst u de houder op het aangewezen gebied op het monsterstation en gebruikt u een koppelsleutel die is ingesteld op 40 centinewtonmeter om alle deksels aan te draaien. Start in de systeemsoftware een nieuw experiment en trek de invoegarm van het instrument in.Plaats de bekerhouder op de brug met kolom acht naar de inbrengopening van het monster en duw de bekerhouder voorzichtig in het instrument op positie één. Wacht 10 minuten tot het systeem is gestabiliseerd voordat u de experimentele putten labelt. Duw vervolgens de inbrengarm van het monster totdat de bekerhouder op positie twee staat.Nadat u het systeem gedurende 20 minuten hebt laten stabiliseren, duwt u de invoegarm van het monster op plaats drie en trekt u de invoegarm in totdat deze zich op de looppositie bevindt. Markeer alle putten in de software en selecteer reactiestart en voer het experiment uit totdat de warmte-emissie-reads stabiel terug zijn op nul. Selecteer aan het einde van de analyse de optie Stop.De software zal dan vragen of u zeker bent. Selecteer ja en sla het experiment op voor gegevensanalyse. Steek vervolgens de invoegarm volledig in het instrument en schakel de magneten in om de bekerhouder op te halen.Als u de gegevens wilt analyseren, opent u de software en selecteert u een geopend experiment. Selecteer in het pop-upvenster het interesse-experiment en klik op Openen. Klik op alles selecteren en definieer de basislijn om de gegevens in elke positie te normaliseren.Selecteer in het pop-upvenster een periode van meer dan 30 minuten binnen de vertragingsfase. Na de selectie wordt de basislijn in het groen in het thermogram weergegeven. Sluit het sectievenster voor basislijn definiëren en klik op opslaan en sluit de software.Open vervolgens de webgebaseerde SymCel-calorimetrieanalysetoepassing. Klik op Bladeren om het interessant bestand te uploaden en selecteer het experiment. De metabolische parameters worden automatisch berekend voor de 32 monsters.Klik op groeifunctie om de warmtestroomgegevens aan Gompertz en/of Richards Growth-modellen aan te passen. Groeimodellen worden weergegeven in de cumulatieve sectie ter vergelijking met de ruwe gegevens in de stroomsectie. Als u de berekende parameters wilt downloaden, klikt u op downloadmaatjes, selecteert u de bestandslocatie en klikt u op Opslaan.Het bestand wordt geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere analyse. Hier worden de thermogrammen weergegeven die worden verkregen door A.baumannii DSM-30008 bloot te stellen aan ciprofloxatine in seriële verdunning. Concentraties tussen 0,005 en 0,1 micromolar hebben een minimaal effect op de groei en stofwisseling van A.baumannii.De behandeling van de cellen met 0,5 micromolar ciprofloxatine leidt echter tot een aanzienlijke verschuiving in de duur van de vertragingsfase en tot een lagere maximale warmtestroom. Deze twee veranderingen samen beïnvloeden de tijd tot piek, wat resulteert in een toename van ongeveer zes uur. In dit cijfer wordt de cumulatieve vrijgekomen warmte afgezet tegen de tijd met het effect van elke concentratie die wordt weerspiegeld door een hellingspunt.Kwantificering van de thermogramhelling maakt de berekening mogelijk van de maximale stofwisseling van A.baumannii in aanwezigheid van ciprofloxatine met een gelijktijdige afname van de stofwisseling die wordt waargenomen in cellen die met 0,5 micromolar ciprofloxatine worden behandeld. Rifampicin behandeling heeft een dramatisch effect op de thermogrammen van A.baumannii DSM-30008. Een aanzienlijke vermindering van de warmte-emissie correleren met een afname van de metabole activiteit wordt ook waargenomen.Let op de toename van de tijd om te pieken voor alle geteste concentraties en de daling van de stofwisseling veroorzaakt door de afname van de helling voor alle concentraties die meestal worden toegeschreven aan een bactericide effect. Om optimale resultaten te garanderen, gebruik maken van omgekeerde pipetting en voorkomen dat extra vloeistof aan de zijkanten van de insert bij het overbrengen van het monster, ook ervoor zorgen dat de deksels goed zijn gesloten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-enabled Noninvasive metabole

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Productie van een Nafion-coating, verminderd grafeen Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor op een pH van de Monitor in Real-time tijdens microbiële gisting

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Standaard testmethode ASTM D 7998-19 voor de cohesieve sterkteontwikkeling van houtlijmen

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...