Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier l’équipe de Symcel pour les discussions fructueuses et nous tenons à souligner le grand soutien de Ganna Oliynyk et Wilhelm Paulander. Nous tenons également à remercier Daniel Kohnhäuser pour fournir le produit naturel et Stefanie Schmidt pour le soutien technique habile.

REMARQUE : La température de l’instrument doit être réglée en fonction de la bactérie utilisée au moins un jour à l’avance pour assurer la stabilité du système. Ici, les échantillons d’Acinetobacter baumannii DSM30008 sont exécutés à 30 °C.
1. Préparation de la culture
<ol><li>Streak sur la souche à l’étude (ici: A. baumannii) sur une plaque d’agar CASO et incuber pendant la nuit dans un incubateur statique à 30 °C.</li>
	<li>Préparer une culture du jour au lendemain en inoculant une seule colonie dans le MHB (bouillon Mueller-Hinton) et incuber sur un incubateur de secousses à 180 tr/min à 30 °C.</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Utilisez des tubes de 1,5 mL pour préparer la plage de concentration de médicaments ou de composés sélectionnés (p. ex., en ajoutant 1,5 μL de solutions de stock de 100 x dans DMSO; voir étape 2.3).</li>
	<li>Diluer la culture du jour au lendemain dans le milieu MHB.<ol>
<li>Mesurer la densité optique de la culture du jour au lendemain à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.</li>
		<li>Diluer la culture pour obtenir 5 x 105 unités de formation de colonies (CFU)/mL dans un milieu MHB frais. Un OD600 d’un est égal à environ 5 x 108 CFU/mL (par exemple, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). REMARQUE : Il est important de calibrer le facteur de conversion OD600 en CFU/mL pour chaque souche bactérienne individuelle dans les conditions de culture appliquées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajoutez 150 μL des cellules aux tubes à essai préparés à l’étape 2.1, en assurant une concentration finale correcte du médicament ou du composé testé et en corrigeant la concentration finale des cellules.</li>
	<li>Mélanger le composé avec les cellules en vortexant. REMARQUE : La plaque d’échantillon(voir tableau des matériaux) comporte six rangées, chacune contenant huit puits, soit un total de 48 puits; Les lignes A et F sont la référence thermodynamique. Par conséquent, aucun échantillon ne peut être chargé dans ces puits, les supports correspondants sont chargés dans ces puits. 32 échantillons d’essai peuvent être mesurés par course, à l’aide de puits dans les rangées B-E. L’échantillon individuel doit être exécuté au minimum en double (ici : tous les échantillons ont été exécutés en triple). Les contrôles de croissance devraient être inclus.</li>
</ol>3. Insérer la préparation
<ol><li>Transférer 120 μL du mélange préparé à l’étape 2.4 vers les inserts en plastique. REMARQUE : Utilisez le pipetage inversé à l’étape 3.1 pour empêcher le liquide de pulvériser sur les côtés des inserts en plastique, ce qui peut entraîner une interférence avec les lectures correctes du signal.</li>
	<li>Placez toutes les flacons de titane dans les supports (voir Tableau des matériaux)à l’aide d’une pince à épiler.</li>
	<li>Transférer délicatement les inserts dans les flacons de titane de la plaque de support.</li>
	<li>Placez lâchement les couvercles en titane sur tous les flacons de titane.</li>
</ol>4. Insérer le chargement
<ol><li>Transférer le support avec des gobelets en titane sur la station d’échantillonnage et placer sur la zone désignée.</li>
	<li>Utilisez la clé de couple, réglée à 40 cNm force, pour serrer tous les couvercles.</li>
</ol>5. Exécution d’échantillons
<ol><li>Dans le logiciel calView, démarrez une nouvelle expérience (Figure supplémentaire 1).</li>
	<li>Retirez le bras d’insertion de l’échantillon de l’instrument.</li>
	<li>Placez le porte-gobelets sur le « ou », la colonne 8 faisant face à l’ouverture d’insertion de l’échantillon et poussez doucement le porte-gobelets dans l’instrument à la position 1 désignée. Attendez 10 minutes pour que le système se stabilise. Étiqueter les puits expérimentaux.</li>
	<li>Appuyez sur le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce que le porte-gobelet soit à la position 2 désignée. Attendez 20 minutes pour que le système se stabilise.</li>
	<li>Poussez le bras d’insertion de l’échantillon dans « Position 3 » et retirez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit en « position de course ». Mettez en évidence tous les puits du logiciel et sélectionnez Début de réaction ( Figure supplémentaire4).</li>
	<li>Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les lectures d’émission de chaleur soient de nouveau à zéro. REMARQUE : Assurez-vous que tous les puits se comportent de la même façon à l’intérieur de ces étapes. La figure supplémentaire 5 illustre ce qui doit être observé si les puits sont chargés correctement. Si vous êtes chargé incorrectement, répétez les étapes 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Retirez le porte-gobelets
<ol><li>Dans le logiciel, sélectionnez Stop (Figure supplémentaire 6). Le logiciel demandera alors si « vous êtes sûr », sélectionnez Oui (Figure supplémentaire 7) et enregistrez l’expérience sur un lecteur ou un bureau pourl’analyse desdonnées ( Figure supplémentaire 8 ).</li>
	<li>Insérez complètement le bras d’insertion de l’échantillon dans l’instrument et engagez les aimants pour récupérer le porte-gobelets.</li>
	<li>Desserrez les couvercles, retirez les inserts et placez les flacons et les couvercles dans des supports en verre et placez-les pendant 4 heures à 180 °C, puis placez les flacons et les couvercles dans un desiccateur pour s’assurer que les couvercles et les flacons sont secs.</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez le logiciel (Figure supplémentaire 9), sélectionnez Ouvrir l’expérience dans le coin supérieur gauche (Figure supplémentaire 10). Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez l’expérience d’intérêt et appuyez sur Ouvrir (Figure supplémentaire 11). L’application ouvrira l’expérience en mode puits par défaut (Figure supplémentaire 12).</li>
	<li>Appuyez sur Sélectionner tout ou Ctrl+A (Figure supplémentaire 13).</li>
	<li>Appuyez sur Définir la base de référence, ce paramètre normalise les données dans chaque position ( Figure supplémentaire14). Dans la fenêtre contextuelle sélectionnez une période de temps de >30 min située dans la phase de décalage (le débit de chaleur doit être faible, entre zéro et dix μW; Figure supplémentaire 15). Après la sélection de la période de temps de base, la ligne de base choisie apparaîtra en vert dans le thermogramme. Fermez la fenêtre Définir la section de base.</li>
	<li>Appuyez sur Enregistrer ou Ctrl+S et fermer le logiciel (Figure supplémentaire 16).</li>
	<li>Application d’analyse symcel calorimétrie (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Pour télécharger le fichier sur l’application d’analyse calorimétrie, appuyez sur Parcourir (Figure supplémentaire 17), sélectionnez l’expérience et appuyez sur Ouvrir ( Figuresupplémentaire 18). Les paramètres métaboliques seront calculés automatiquement pour les 32 échantillons de l’application web (Figure supplémentaire 19).</li>
	<li>Afin d’adapter les données de flux de chaleur à Gompertz et /ou les modèles de croissance de Richard cliquez sur fonction de croissance. Les modèles de croissance adaptés seront affichés dans la section « Cumulatif », également par rapport aux données brutes de la section « Flow » (Figure supplémentaire 20).</li>
	<li>Pour télécharger tous les paramètres calculés,appuyez sur Télécharger les mesures . Sélectionnez l’emplacement du fichier et appuyez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 21). Le fichier sera exporté vers une feuille de calcul pour d’autres calculs.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. 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Le projet a été réalisé en collaboration avec Symcel, développeur de la technologie calScreeer. Les auteurs n’ont rien à révéler.

La microcalorimétrie isotherme mesure l’énergie émise par un spécimen au fil du temps et cette libération d’énergie est le résultat de tous les processus biologiques, physiques et (bio)chimiques. Le flux de chaleur mesuré peut être exploité pour évaluer ou déterminer les effets antibactériens des substances car il permet une surveillance continue en temps réel de l’activité métabolique.
Afin d’obtenir des données fiables pour l’analyse, il faut déterminer individuellement les unités de formation des colonies de départ (CFU) pour chaque espèce ou souche utilisée. Dans le cas où le nombre de CFU est trop faible, cela conduit à une phase de décalage prolongée car il faut plus de temps pour que le système atteigne une quantité critique de biomasse produisant suffisamment de chaleur pour être détecté. Dans le cas où le nombre de CFU est trop élevé, la phase de décalage sera très courte, et la quantité de chaleur produite peut provoquer le transfert de chaleur vers les cellules du capteur voisin (puits de référence et expérimentaux) et provoquer des distorsions des thermogrammes. Un nombre élevé de CFU entraînera également un épuisement plus rapide de l’oxygène et passera à des conditions anaérobies. Il convient également de tenir compte du fait que pendant les 30 premières minutes de l’expérience, lorsque le système est équilibré, que la collecte de données n’est pas possible et que l’enregistrement réel des effets est retardé. En outre, une détermination incorrecte de l’ECC conduit à une fausse détermination du MIC, affectant en fin de compte l’expérience et les changements observés25. Un autre point critique est la détermination correcte de la ligne de base. Habituellement, le signal de base est sélectionné pendant la phase de décalage lorsque le signal de flux de chaleur est nul et idéalement, la plage de temps pour la définition de base est de >30 min. Cependant, ce n’est pas toujours possible car le temps dont la bactérie a besoin pour atteindre la limite de détection du signal thermique diffère entre les souches et les espèces. Certaines espèces ou souches nécessitent plus de 30 minutes pour atteindre la limite de détection du signal thermique, tandis que d’autres souches ou espèces l’atteignent dans les 30 premières minutes. Dans ce cas, il est possible de sélectionner le signal de base à la fin de l’expérience lorsque tous les signaux de chaleur sont retombés à zéro et restent stables. Alternativement, les lignes de base d’autres expériences avec la même souche bactérienne peuvent être utilisées, ce qui n’est toutefois pas recommandé.
Le système permet une certaine flexibilité en termes de conception et d’optimisation des expériences et de dépannage. Les volumes utilisés sont de l’ordre de 100 à 300 μL lors de l’utilisation d’inserts en plastique et de 100 à 600 μL lors de l’utilisation de gobelets en titane sans les inserts en plastique. Le volume de travail recommandé par le fabricant est de 120 μL. L’utilisation de différents volumes dans la mise en place d’une nouvelle série expérimentale, et tout en trouvant des conditions optimales pour les mesures, a un impact principalement sur deux paramètres. En utilisant des volumes plus faibles, la quantité de composé d’essai requis peut être diminuée, ce qui est particulièrement important pour les composés, qui ne sont disponibles qu’en petites quantités. En outre, le volume utilisé a un impact direct sur la disponibilité de l’oxygène pendant la mesure, les volumes plus faibles augmentant la quantité d’oxygène disponible nécessaire à la croissance bactérienne. L’épuisement de l’oxygène est l’un des principaux facteurs contribuant à la durée maximale possible de l’expérience. Fait important, il est possible d’utiliser des supports solides, pas seulement des supports liquides. Ceci est particulièrement important pour les micro-organismes à croissance lente car la croissance sur l’interface entre la phase solide et la phase gazeuse permet un meilleur accès à l’oxygène9.
IMC est un outil d’analyse utile pour découvrir des processus inconnus avec des applications en physique, chimie et biologie. La méthode mesure l’échange de chaleur au sein d’un système fermé et l’analyse de l’échange de chaleur enregistré fournit des informations supplémentaires qui ne peuvent pas toujours être obtenues avec des méthodes standard. Dans la recherche en microbiologie et en antibiotiques, l’un des plus grands avantages de l’IMC est sa capacité à distinguer les cellules vivantes, mortes et persistantes ou dormantes, ce qui n’est pas possible en utilisant les méthodes standard de turbidité11. En outre, IMC est très sensible et il peut détecter les émissions de chaleur d’aussi peu que 104-10 5 cellules9. Un autre avantage est que la configuration expérimentale est rapide et facile, et il permet un suivi continu, en temps réel avec un minimum à aucune interférence utilisateur. De plus, IMC n’est pas destructif, ce qui permet une analyse plus poussée des échantillons. L’analyse des données permet le découplage de la formation de biomasse jusqu’à la phase exponentielle ou stationnaire tardive et l’activité métabolique en phase stationnaire.
Outre les nouveautés et les fonctionnalités d’application passionnantes mentionnées ci-dessus, il ya aussi des inconvénients à cette méthode. La principale limitation est que les instruments IMC mesurent la chaleur totale produite et libérée dans un système spécifique, qui comprend également des signaux non spécifiques. Cela souligne l’importance de la planification expérimentale avec des contrôles appropriés pour être en mesure d’évaluer les changements de signal de chaleur qui sont mesurés en enregistrant le flux de chaleur9,20.
Entre nos mains, IMC est un outil important pour étudier les effets antibactériens des nouveaux produits naturels et pour déterminer les gammes de concentration efficaces. Outre la différenciation des effets bactériostatiques et bactéricides, il pourrait être utilisé à l’avenir dans le cadre d’études d’identification des cibles et de détermination du moA. Cela peut être fait en comparant les thermogrammes de différentes classes d’antibiotiques aux thermogrammes de nouveaux composés actifs comme indiqué ici. Toutefois, il reste à examiner si certains paramètres quantifiables qui peuvent être extraits des données mesurées sont suffisants pour de telles comparaisons ou s’il sera nécessaire de travailler sur des algorithmes donnant des empreintes digitales basées sur des thermogrammes complets. Une autre application possible dans le domaine de la recherche antibiotique est la comparaison du type sauvage aux clones résistants, couplé avec le séquençage du génome entier, qui peut aider à élucider le mode de résistance (MoR) de nouveaux antibactériens. En raison de la nature statique de la méthode, l’étude de l’efficacité de nouveaux agents sur la formation de biofilms ou sur les biofilms déjà établis pourrait conduire à une meilleure compréhension du processus biologique et de l’effet des agents sélectionnés sur les microbes à différents stades de dormance. IMC enregistre l’énergie totale libérée sous forme de chaleur, ce qui en fait une méthode appropriée pour étudier également les effets sous-inhibiteurs des substances actives qui pourraient être couplées à la transcriptomique. Cette méthode peut également être utilisée en milieu clinique pour détecter la contamination des échantillons ou pour la détermination d’antibiogrammes aidant à décider rapidement sur le traitement défini des patients11.

Le but de cette méthode est d’appliquer la microcalorimétrie isothermale (IMC) comme un test de débit moyen dans le profilage du mode d’action (MoA) des nouveaux composés antibactériens. Cette méthode révèle des données concernant l’activité des composés sur les espèces bactériennes et fournit des informations sur la nature bactéricide ou bactériostatique du composé lui-même.
L’augmentation de la résistance aux antimicrobiens émergentes (AMR) est un problème mondial et elle conduit à des traitements moins efficaces des infections courantes avec des antibiotiques connus1. Cependant, la recherche de nouveaux composés et médicaments qui peuvent remplacer ou travailler en combinaison avec des antibiotiques connus sont en cours et cela est construit sur diverses approches. Les produits naturels sont un acteur clé dans les campagnes actuelles de découverte de médicaments et en particulier dans la découverte de médicaments anti-infectieux2. Toutefois, l’identification de nouvelles structures de plomb pour le développement d’antibiotiques est un processus long et exigeant financièrement3. Ainsi, les premières étapes de la découverte sont extrêmement importantes afin de filtrer sur les échafaudages les plus prometteurs déjà à un stade précoce. Les premières étapes de la découverte de médicaments naturels comprennent l’obtention de la structure d’un composé, la détermination de l’activité in vitro ainsi que le protocole d’entente et l’identification des cibles. La plupart des composés qui réussissent et qui sont admissibles à un développement ultérieur devraient présenter un spectre d’activité favorable (c.-à-d. une activité à large spectre dans le cas des antibactériens) et un nouveau protocole d’accord par lequel l’AMR préexistante peut être surmontée. Les échafaudages prometteurs sont alors généralement examinés dans les essais secondaires, qui incluent la biodisponibilité in vivo, la toxicité, et le métabolisme4. Outre les préoccupations financières, la découverte de médicaments naturels fait face à d’autres défis concernant les coûts et les difficultés techniques liées à l’isolement et à la purification des composés, ce qui, à son tour, peut rendre difficile l’obtention de quantités de plusieurs milligrammes ou même de grammes dans les premières étapes du processus de découverte5,6. Par conséquent, il est de la plus haute importance dans la recherche sur les produits naturels d’être en mesure d’effectuer un dépistage primaire de pointe avec des quantités de composés minimes afin de prendre une décision éclairée sur d’autres investissements aient permis de rendre un nouveau produit naturel accessible au développement préclinique. Avec l’utilisation d’IMC pour le profilage antibactérien, la quantité de composé nécessaire est considérablement réduite par rapport aux méthodes standard. La technique fournit également des informations plus approfondies sur l’interaction de nouveaux médicaments avec la communauté microbienne7.
L’IMC est une méthode bien établie pour mesurer l’énergie totale à la suite de tous les processus et réactions biologiques, physiques et biochimiques dans un système biologique. La libération d’énergie bactérienne est proportionnelle aux réactions métaboliques totales8. Dans un système fermé, tel que le microcalorimètre utilisé, les niveaux de chaleur peuvent être mesurés dans la gamme de microwatts pour étudier la cinétique métabolique des bactéries9,,10,11,12. La chaleur (énergie) qui est libérée par les bactéries est liée à des fonctions cellulaires qui sous-tendent leur métabolisme et qui ne sont pas nécessairement proportionnelles à la biomasse cellulaire.
Initialement, l’applicabilité de la calorimétrie isotherme pour les tests microbiologiques a été limitée en raison de son faible débit et des volumes élevés d’essai. Cependant, le microcalorimètre utilisé est unique car il combine les avantages de la calorimétrie isotherme avec un débit accru et des besoins composés inférieurs, ce qui en fait un outil précieux pour les applications de découverte de médicaments10. En outre, l’instrument offre d’autres avantages par rapport aux méthodes alternatives de mesure de la cinétique de croissance bactérienne, telles que la méthode standard de turbidité, qui est basée sur la mesure de la densité optique à 600 nm (OD<600). La mesure de l’OD600 repose sur l’hypothèse que l’augmentation de la densité optique est égale à la croissance microbienne, négligeant ainsi la présence de cellules non viables. Cette méthode a également été critiquée car elle exclut les petites variantes de colonies et les cellules persistantes11. En revanche, IMC permet l’observation en temps réel de n’importe quel type de cellules viables. Si les cellules sont dormantes, elles présentent encore une activité métabolique et elles peuvent ainsi être détectées par IMC, alors que ces phénomènes ne sont pas détectables par la méthode standard de turbidité11. D’autres avantages de l’IMC incluent un temps de test de susceptibilité antimicrobienne plus court, la mesure des interactions médicamenteuses dans une communauté complexe et des méthodes d’analyse standard sans détruire l’échantillon7.
La technologie IMC a été mise en œuvre dans un large éventail d’études, allant de la microbiologie à la thermogenèse et la biologie du cancer13,14,15,16,17. Les applications microbiennes comprennent la détermination de concentrations inhibitrices minimales (MIC) de composés contre diverses souches bactériennes. Plusieurs études ont été faites et il a été conclu que les données mic de la calorimétrie isotherme pour la majorité des espèces bactériennes peuvent être obtenues plus rapidement et les résultats sont similaires à d’autres méthodes (standard) pour la détermination mic12,18,19. D’autres applications de l’IMC comprennent l’observation de l’interaction des médicaments et la combinaison de traitements médicamenteux avec des communautés bactériennes complexes telles que les biofilms11. Une étude portant sur le profilage du MoA a montré que le microcalorimètre peut détecter une différence dans les céphalosporines de première et deuxième génération, tandis que différents antibiotiques avec le même MoA présentent une courbe de flux de chaleur similaire par rapport à l’autre18.
Ici, nous décrivons l’utilisation de l’IMC pour le profilage moA de nouveaux produits naturels à l’aide du nouvel instrument isothermal de microcalorimétrie. La méthode est utilisée pour déterminer les concentrations efficaces d’antibiotiques et pour décrire les caractéristiques des antibiotiques en termes de mécanismes bactéricides ou bactériostatiques. La méthode peut être largement mise en œuvre dans le profilage moA des composés et elle pourrait remplacer ou au moins compléter les méthodes microbiologiques standard. Les études futures comprendront des analyses approfondies des empreintes digitales qui permettront de différencier les classes d’antibiotiques en fonction des mécanismes cibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

En raison de la menace mondiale d’une résistance aux antimicrobiens croissante, de nouveaux antibiotiques sont nécessaires de toute urgence. Nous étudions les produits naturels de Myxobacteria comme une source innovante de ces nouveaux composés. Un goulot d’étranglement dans le processus est généralement l’élucidation de leur mode d’action. Nous avons récemment établi la microcalorimétrie isothermale dans le cadre d’un pipeline de profilage de routine. Cette technologie permet d’étudier l’effet de l’exposition aux antibiotiques sur la réponse métabolique bactérienne totale, y compris les processus qui sont découplés de la formation de biomasse. Fait important, les effets bactériostatiques et bactéricides se distinguent facilement sans aucune intervention de l’utilisateur pendant les mesures. Cependant, la microcalorimétrie isotherme est une approche assez nouvelle et l’application de cette méthode à différentes espèces bactériennes nécessite habituellement une pré-évaluation des conditions de mesure appropriées. Il existe quelques thermogrammes de référence disponibles de certaines bactéries, facilitant grandement l’interprétation des résultats. Comme le pool de données de référence ne cesse de croître, nous nous attendons à ce que la méthodologie ait un impact croissant à l’avenir et nous nous attendons à ce qu’elle permette des analyses approfondies des empreintes digitales permettant la différenciation des classes d’antibiotiques.

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Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

L’élucidation du mode d’action d’un nouvel antibiotique est une tâche difficile dans le processus de découverte de médicaments. Le but de la méthode décrite ici est l’application de la microcalorimétrie isotherme en utilisant calScreener dans le profilage antibactérien pour fournir un aperçu supplémentaire des interactions médicament-microbe.

Profilage métabolique pour déterminer les effets bactéricides ou bactériostatiques des nouveaux produits naturels à l’aide de la microcalorimétrie isothermale

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Comprendre le mode d’action des nouveaux composés antibactériens est une tâche importante mais difficile. Cette méthode donne un aperçu de ces mécanismes et il est facile à implémenter. Cette technique permet une observation en temps réel des effets antibactériens d’une manière non invasive permettant une analyse plus poussée de l’échantillon.Bien que la pratique avec des techniques microbiologiques soit une condition préalable, l’expérience est facile à réaliser. Prendre votre temps avec l’analyse des données est très important lors de l’exécution de la microcalorimétrie pour la première fois. Commencez par utiliser un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres pour mesurer la densité optique de la culture nocturne.Diluer la culture à 5 fois 10 à la 5ème colonie formant des unités par millilitre de concentration moyenne fraîche de MHB et ajouter 150 microlitres de cellules à chaque tube d’antibiotique de 1,5 millilitre à la concentration d’intérêt. Ensuite, mélanger le composé avec les cellules par vortex. Pour préparer les inserts, ajouter 120 microlitres de chaque mélange d’antibiotiques bactéries dans des inserts individuels en plastique dans les puits appropriés d’une plaque de 48 puits et utiliser des pinces à épiler pour placer tous les flacons de titane dans les porte-porte.Transférer délicatement les inserts dans les flacons de titane dans la plaque du support et placer lâchement les couvercles de titane sur tous les flacons. Lorsque tous les inserts ont été transférés, placez le support sur la zone désignée sur la station d’échantillonnage et utilisez une clé de couple réglée à 40 mètres centinewton pour serrer tous les couvercles. Dans le logiciel système, démarrer une nouvelle expérience et retirer le bras d’insertion de l’échantillon de l’instrument.Placez le porte-gobelet sur le pont avec la colonne huit face à l’ouverture d’insertion de l’échantillon et poussez doucement le porte-gobelet dans l’instrument à la position 1. Attendez 10 minutes pour que le système se stabilise avant d’étiqueter les puits expérimentaux. Ensuite, poussez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce que le porte-gobelet soit à la position deux.Après avoir permis au système de se stabiliser pendant 20 minutes, poussez le bras d’insertion de l’échantillon pour en positionner trois et rétractez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit en position de course. Mettez en surbrillance tous les puits du logiciel et sélectionnez le démarrage de la réaction, puis exécutez l’expérience jusqu’à ce que les lisages d’émission de chaleur soient habilement de retour à zéro. À la fin de l’analyse, sélectionnez arrêt.Le logiciel vous demandera alors si vous en êtes sûr. Sélectionnez oui et enregistrez l’expérience pour l’analyse des données. Insérez ensuite complètement le bras d’insertion de l’échantillon dans l’instrument et engagez les aimants pour récupérer le porte-gobelet.Pour analyser les données, ouvrez le logiciel et sélectionnez l’expérience ouverte. Dans la fenêtre popup, sélectionnez l’expérience d’intérêt et cliquez sur ouvrir. Cliquez sur sélectionnez tous et définissez la ligne de base pour normaliser les données dans chaque position.Dans la fenêtre popup, sélectionnez une période de temps supérieure à 30 minutes dans la phase de décalage. Après sélection, la ligne de base apparaîtra en vert dans le thermogramme. Fermez la fenêtre définir la section de base, puis cliquez sur enregistrer et fermer le logiciel.Ensuite, ouvrez l’application d’analyse calorimétrique SymCel basée sur le Web. Cliquez sur parcourir pour télécharger le fichier d’intérêt et sélectionnez l’expérience. Les paramètres métaboliques seront automatiquement calculés pour les 32 échantillons.Pour adapter les données de flux de chaleur aux modèles Gompertz et/ou Richards Growth, cliquez sur fonction de croissance. Les modèles de croissance seront affichés dans la section cumulative pour comparaison avec les données brutes de la section flux. Pour télécharger les paramètres calculés, cliquez sur les mesures de téléchargement, sélectionnez l’emplacement du fichier et cliquez sur enregistrer.Le fichier sera exporté vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Ici, les thermogrammes obtenus en exposant A.baumannii DSM-30008 à la ciprofloxacine dans la dilution en série sont affichés. Les concentrations entre 0,005 et 0,1 micromolaire ont un effet minimal sur la croissance et le métabolisme d’A.baumannii.Le traitement des cellules avec 0,5 micromolaire ciprofloxacine, cependant, conduit à un changement significatif dans la durée de la phase de décalage et à un débit de chaleur maximum inférieur. Ces deux changements affectent ensemble le temps de pointe, ce qui entraîne une augmentation d’environ six heures. Dans ce chiffre, la chaleur cumulative libérée est tracée contre le temps avec l’effet de chaque concentration reflétée par une pente de pente.Quantification de l’inclinaison thermogramme permet le calcul du taux métabolique maximum de A.baumannii en présence de ciprofloxacine avec une diminution concomitante du taux métabolique observé dans les cellules traitées avec 0,5 ciprofloxacine micromolaire. Le traitement à la rifampicine a un effet dramatique sur les thermogrammes d’A.baumannii DSM-30008. Une réduction significative des émissions de chaleur corrélatrice avec une diminution de l’activité métabolique est également observée.Notez l’augmentation du temps de pointe pour toutes les concentrations testées et la diminution du taux métabolique causée par la diminution de la pente pour toutes les concentrations qui sont habituellement attribuées à un effet bactéricide. Pour obtenir des résultats optimaux, utilisez le tuyautage inversé et empêchez le liquide supplémentaire sur les côtés de l’insert lors du transfert de l’échantillon, assurez-vous également que les couvercles sont bien fermés.

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