Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Die Autoren danken dem Team von Symcel für die fruchtbaren Gespräche und würdigen die große Unterstützung von Ganna Oliynyk und Wilhelm Paulander. Wir danken auch Daniel Kohnhäuser für die Bereitstellung des Naturprodukts und Stefanie Schmidt für die kompetente technische Unterstützung.

HINWEIS: Die Gerätetemperatur muss gemäß dem Bakterium eingestellt werden, das mindestens einen Tag im Voraus verwendet wird, um die Stabilität des Systems zu gewährleisten. Hier werden Acinetobacter baumannii DSM30008 Proben bei 30 °C ausgeführt.
1. Kulturvorbereitung
<ol><li>Streichen Sie den untersuchten Stamm (hier: A. baumannii) auf einer CASO-Agarplatte aus und inkubieren Sie über Nacht in einem statischen Inkubator bei 30 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Nachtkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in MHB (Mueller-Hinton-Brühe) impfen und auf einem Schüttelinkubator bei 180 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C brüten.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie 1,5 ml-Rohre, um den Konzentrationsbereich ausgewählter Arzneimittel oder Verbindungen vorzubereiten (z. B. durch Zugabe von 1,5 l 100-fachen Stofflösungen in DMSO; siehe Schritt 2.3).</li>
	<li>Verwässern Sie die Übernachtungskultur im MHB-Medium.<ol>
<li>Messen Sie die optische Dichte der Nachtkultur mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Kultur, um 5 x 105 koloniebildende Einheiten (CFU)/ml in frischem MHB-Medium zu erhalten. Eine OD600 von einem entspricht etwa 5 x 108 KBE/ml (z.B. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). HINWEIS: Es ist wichtig, den Umrechnungsfaktor OD600 in CFU/mL für jeden einzelnen Bakterienstamm unter den angewandten Kultivierungsbedingungen zu kalibrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 150 l der Zellen in die in Schritt 2.1 hergestellten Reagenzgläser ein, um eine korrekte Endkonzentration des getesteten Arzneimittels oder der getesteten Verbindung und eine korrekte endgültige Zellkonzentration zu gewährleisten.</li>
	<li>Mischen Sie die Verbindung mit den Zellen durch Wirbeln. ANMERKUNG: Die Probenplatte (siehe Materialtabelle)hat sechs Reihen mit jeweils acht Brunnen, insgesamt 48 Brunnen; Zeile A und Zeile F sind die thermodynamische Referenz. Daher können keine Proben in diese Brunnen geladen werden, entsprechende Medien werden in diese Brunnen geladen. 32 Testproben können pro Durchlauf mit Bohrungen in den Zeilen B-E gemessen werden. Einzelne Testproben sollten mindestens in doppelter Ausführung ausgeführt werden (hier: alle Proben wurden als Triplicate ausgeführt). Wachstumskontrollen sollten einbezogen werden.</li>
</ol>3. Präparation einfügen
<ol><li>120 l aus dem in Schritt 2.4 hergestellten Gemisch auf die Kunststoffeinsätze übertragen. HINWEIS: Verwenden Sie die Umgekehrte Pipettierung in Schritt 3.1, um zu verhindern, dass Flüssigkeit auf die Seiten der Kunststoffeinsätze sprüht, was zu Störungen bei korrekten Signalauslesungen führen kann.</li>
	<li>Legen Sie alle Titanfläschchen mit einer Pinzette in die Halterungen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Tragen Sie die Einsätze vorsichtig in die Titanfläschchen in der Halterplatte.</li>
	<li>Legen Sie Titandeckel lose auf alle Titan-Fläschchen.</li>
</ol>4. Einstecken des Ladens
<ol><li>Übertragen Sie den Halter mit Titanbechern auf die Probenstation und legen Sie sie auf einen ausgewiesenen Bereich.</li>
	<li>Verwenden Sie den Auf 40 cNm Kraft eingestellten Drehmomentschlüssel, um alle Deckel festzuziehen.</li>
</ol>5. Ausführen von Proben
<ol><li>Starten Sie in der calView-Software ein neues Experiment (ergänzende Abbildung 1).</li>
	<li>Ziehen Sie den Probeneinsteckarm vom Instrument ein.</li>
	<li>Stellen Sie den Becherhalter auf die "Brücke", Spalte 8 zur Probeneinlageöffnung und drücken Sie den Becherhalter vorsichtig in das Instrument an der angegebenen "Position 1". Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat. Beschriften Sie die experimentellen Brunnen.</li>
	<li>Drücken Sie den Probeneinsteckarm, bis sich der Becherhalter an der angegebenen "Position 2" befindet. Warten Sie 20 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat.</li>
	<li>Drücken Sie den Probeneinschubarm in "Position 3" und ziehen Sie den Probeneinsteckarm so lange zurück, bis er sich an der "Laufposition" befindet. Markieren Sie alle Brunnen in der Software und wählen Sie Reaktionsstart (Ergänzende Abbildung 4).</li>
	<li>Führen Sie das Experiment aus, bis die Wärmeemissionswerte stabil wieder bei Null liegen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich alle Brunnen in diesen Schritten ähnlich verhalten. Ergänzende Abbildung 5 zeigt, was zu beachten ist, wenn die Brunnen richtig geladen sind. Wenn Sie falsch geladen sind, wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Entfernen Sie den Becherhalter
<ol><li>Wählen Sie in der Software Stop (Supplemental Abbildung 6). Die Software wird dann fragen, ob "Sie sicher sind", wählen Sie Ja (Ergänzende Abbildung 7) und speichern Sie das Experiment auf einem Laufwerk oder Desktop für die Datenanalyse (Ergänzende Abbildung 8).</li>
	<li>Setzen Sie den Probeneinsteckarm vollständig in das Instrument ein und greifen Sie die Magnete an, um den Becherhalter abzurufen.</li>
	<li>Lösen Sie die Deckel, entfernen Sie die Einsätze und legen Sie Fläschchen und Deckel in Glashalter und legen Sie sie 4 Stunden bei 180 °C, gefolgt von der Platzierung der Fläschchen und Deckel in einen Trockenbau, um sicherzustellen, dass Deckel und Fläschchen trocken sind.</li>
</ol>7. Analysieren von Daten
<ol><li>Öffnen Sie die Software (Ergänzende Abbildung 9), wählen Sie Experiment in der linken oberen Ecke öffnen (Ergänzende Abbildung 10). Wählen Sie im Popup-Fenster das Experiment von Interesse aus und drücken Sie Open (Ergänzende Abbildung 11). Die Anwendung öffnet das Experiment in der Standardbrunnenansicht (Ergänzende Abbildung 12).</li>
	<li>Drücken Sie Alle auswählen oder Strg+A (Ergänzende Abbildung 13).</li>
	<li>Drücken Sie Baseline definieren, normalisiert dieser Parameter die Daten an jeder Position (Ergänzende Abbildung 14). Wählen Sie im Popup-Fenster einen Zeitraum von >30 min in der Verzögerungsphase aus (der Wärmestrom muss niedrig sein, zwischen null und zehn W; Ergänzende Abbildung 15). Nach der Auswahl des Basislinienzeitraums wird die gewählte Basislinie im Thermogramm grün angezeigt. Schließen Sie das Fenster Basislinienabschnitt definieren.</li>
	<li>Drücken Sie Speichern oder Strg+S und schließen Sie die Software (Ergänzende Abbildung 16).</li>
	<li>Öffnen Sie die webbasierte Symcel Calorimetry Analysis Application (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Um die Datei in die Calorimetry-Analyseanwendung hochzuladen, drücken Sie Durchsuchen (Ergänzende Abbildung 17), wählen Sie das Experiment aus und drücken Sie Open (Supplemental Figure 18). Die metabolischen Parameter werden automatisch für die 32 Proben in der Webanwendung berechnet (Ergänzungsabbildung 19).</li>
	<li>Um die Wärmeflussdaten an Gompertz und/oder Richards Wachstumsmodelle anzupassen, klicken Sie auf Growth Function. Wachstumsmodelle passen werden im Abschnitt "Kumulativ" angezeigt, auch im Vergleich zu den Rohdaten im Abschnitt "Flow" (Ergänzende Abbildung 20).</li>
	<li>Um alle berechneten Parameter herunterzuladen, drücken Sie Download Measures. Wählen Sie den Speicherort der Datei aus, und drücken Sie Speichern (Ergänzende Abbildung 21). Die Datei wird für weitere Berechnungen in eine Kalkulationstabelle exportiert.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Das Projekt wurde in Zusammenarbeit mit Symcel, dem Entwickler der calScreener-Technologie, durchgeführt. Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die isotherme Mikrokalormetrie misst die von einer Probe im Laufe der Zeit emittierte Energie, und diese Energiefreisetzung ist das Ergebnis aller biologischen, physikalischen und (bio-)chemischen Prozesse. Der gemessene Wärmestrom kann genutzt werden, um antibakterielle Wirkungen von Substanzen zu bewerten oder zu bestimmen, da er eine kontinuierliche Echtzeitüberwachung der Stoffwechselaktivität ermöglicht.
Um zuverlässige Daten für die Analyse zu erhalten, müssen für jede verwendete Art oder Sorte die richtigen beginnenden koloniebildenden Einheiten (CFU) individuell bestimmt werden. Falls die KBE-Zahl zu niedrig ist, führt dies zu einer längeren Verzögerungsphase, da es länger dauert, bis das System eine kritische Menge an Biomasse erreicht, die genügend Wärme erzeugt, um erkannt zu werden. Falls die KBE-Zahl zu hoch ist, wird die Verzögerungsphase sehr kurz sein, und die erzeugte Wärmemenge kann zu Wärmeübertragung entoseln (Referenz- und Versuchsbrunnen) und Verzerrungen der Thermogramme verursachen. Eine hohe Anzahl von KBE wird auch zu einem schnelleren Sauerstoffmangel führen und auf anaerobe Bedingungen umstellen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass während der ersten 30 Minuten des Experiments, wenn das System ausgeglichen wird, die Datenerhebung nicht möglich ist und die tatsächliche Erfassung der Effekte verzögert wird. Darüber hinaus führt eine falsche KBE-Bestimmung zu einer falschen MIC-Bestimmung, die letztlich das Experiment und die beobachteten Veränderungen beeinflusst25. Ein weiterer kritischer Punkt ist die korrekte Bestimmung der Basislinie. Normalerweise wird das Basissignal während der Verzögerungsphase ausgewählt, wenn das Wärmeflusssignal Null ist und idealerweise der Zeitbereich für die Basisliniendefinition >30 min beträgt. Dies ist jedoch nicht immer möglich, da die Zeit, die die Bakterien benötigen, um die Wärmesignalerkennungsgrenze zu erreichen, zwischen Stämmen und Arten unterschiedlich ist. Einige Arten oder Stämme benötigen mehr als 30 Minuten, um die Wärmesignalerkennungsgrenze zu erreichen, während andere Stämme oder Arten sie innerhalb der ersten 30 Minuten erreichen. In diesem Fall ist es möglich, das Basissignal am Ende des Experiments auszuwählen, wenn alle Wärmesignale wieder auf Null gefallen sind und stabil bleiben. Alternativ können Baselines aus anderen Experimenten mit dem gleichen Bakterienstamm verwendet werden, was jedoch nicht empfohlen wird.
Das System ermöglicht eine gewisse Flexibilität bei der Konzeption und Optimierung von Experimenten und Fehlerbehebung. Die verwendeten Mengen liegen im Bereich von 100-300 l bei Verwendung von Kunststoffeinsätzen und 100-600 l bei Verwendung von Titanbechern ohne Kunststoffeinsätze. Das vom Hersteller empfohlene Arbeitsvolumen beträgt 120 l. Die Verwendung unterschiedlicher Volumina bei der Einrichtung einer neuen Versuchsreihe und bei der Suche nach optimalen Bedingungen für Messungen wirkt sich hauptsächlich auf zwei Parameter aus. Durch die Verwendung geringerer Mengen kann die Menge der benötigten Prüfmasse verringert werden, was besonders wichtig für Verbindungen ist, die nur in geringen Mengen erhältlich sind. Darüber hinaus wirkt sich das verwendete Volumen direkt auf die Sauerstoffverfügbarkeit während der Messung aus, wobei geringere Volumina die Menge an verfügbarem Sauerstoff erhöhen, die für das Bakterienwachstum benötigt wird. Der Sauerstoffmangel ist einer der Hauptfaktoren, die zur maximal möglichen Dauer des Experiments beitragen. Wichtig ist, dass es möglich ist, feste Medien zu verwenden, nicht nur flüssige Medien. Dies ist besonders wichtig für langsam wachsende Mikroorganismen, da das Wachstum an der Schnittstelle zwischen Feststoff- und Gasphase einen besseren Sauerstoffzugang ermöglicht9.
IMC ist ein nützliches Analysewerkzeug, um unbekannte Prozesse mit Anwendungen in Physik, Chemie und Biologie zu entdecken. Das Verfahren misst den Wärmeaustausch innerhalb eines geschlossenen Systems und die Analyse des aufgezeichneten Wärmeaustauschs liefert zusätzliche Informationen, die nicht immer mit Standardmethoden gewonnen werden können. In der Mikrobiologie und Antibiotikaforschung ist einer der größten Vorteile von IMC seine Fähigkeit, zwischen lebenden, toten und persistenten oder ruhenden Zellen zu unterscheiden, was mit Standard-Trübungsmethoden nicht möglich ist11. Darüber hinaus ist IMC hochempfindlich und kann Wärmeemissionen von nur 104-105 Zellen9erkennen. Ein weiterer Vorteil ist, dass das experimentelle Setup schnell und einfach ist, und es ermöglicht eine kontinuierliche Echtzeit-Tracking mit minimalen bis keine Benutzereingriffe. Darüber hinaus ist IMC zerstörungsfrei, was eine weitere Analyse von Proben ermöglicht. Die Datenanalyse ermöglicht die Entkopplung der Biomassebildung bis zur späten exponentiellen oder frühen stationären Phase und der metabolischen Aktivität in der stationären Phase.
Neben den oben erwähnten neuartigen und spannenden Anwendungsmerkmalen gibt es auch Nachteile dieser Methode. Die Hauptbeschränkung besteht darin, dass IMC-Instrumente die gesamte erzeugte und freigesetzte Wärme in einem bestimmten System messen, zu denen auch unspezifische Signale gehören. Dies unterstreicht die Bedeutung der experimentellen Planung mit geeigneten Steuerungen, um die Wärmesignaländerungen beurteilen zu können, die durch Aufzeichnung des Wärmestroms9,20gemessen werden.
In unseren Händen ist IMC ein wichtiges Werkzeug, um antibakterielle Wirkungen neuer Naturprodukte zu untersuchen und effektive Konzentrationsbereiche zu bestimmen. Abgesehen von der Differenzierung der bakteridären und bakteriziden Wirkungen könnte es in Zukunft als Teil von Zielidentifikationsstudien und MoA-Bestimmung verwendet werden. Dies kann durch den Vergleich von Thermogrammen verschiedener Antibiotikaklassen mit Thermogrammen neuer Wirkstoffe, wie hier dargestellt, erfolgen. Es muss jedoch noch untersucht werden, ob bestimmte quantifizierbare Parameter, die aus den gemessenen Daten extrahiert werden können, für solche Vergleiche ausreichen oder ob es notwendig sein wird, an Algorithmen zu arbeiten, die Fingerabdrücke auf der Grundlage vollständiger Thermogramme erhalten. Eine weitere mögliche Anwendung auf dem Gebiet der Antibiotikaforschung ist der Vergleich von Wildtyp mit resistenten Klonen, gekoppelt mit der vollständigen Genomsequenzierung, die helfen kann, die Art-of-Resistenz (MoR) neuer Antibakterien aufzuklären. Aufgrund der statischen Natur der Methode könnte die Untersuchung der Wirksamkeit neuer Wirkstoffe bei der Biofilmbildung oder auf bereits etablierten Biofilmen zu einem besseren Verständnis des biologischen Prozesses und der Wirkung ausgewählter Wirkstoffe auf Mikroben in verschiedenen Stadien des Ruhezustands führen. IMC zeichnet die Gesamtenergie auf, die in Form von Wärme freigesetzt wird, was es zu einer geeigneten Methode macht, um auch subhemmende Wirkungen von Wirkstoffen zu untersuchen, die mit Transkriptomik gekoppelt werden könnten. Diese Methode kann auch in klinischen Umgebungen verwendet werden, um Kontamination von Proben zu erkennen oder für die Bestimmung von Antibiogrammen, die helfen, schnell über eine bestimmte Behandlung der Patienten zu entscheiden11.

Ziel dieser Methode ist es, die isotherme Mikrokalorimetrie (IMC) als Mitteldurchsatz-Assay bei der Wirkungsart(MoA)-Profilierung neuer antibakterieller Verbindungen anzuwenden. Diese Methode zeigt Daten über die Aktivität von Verbindungen auf bakteriellen Arten und liefert Informationen über die bakterizide oder bakteriostatische Natur der Verbindung selbst.
Der Anstieg der aufkommenden antimikrobiellen Resistenz (AMR) ist ein globales Problem und führt zu weniger wirksamen Behandlungen von häufigen Infektionen mit bekannten Antibiotika1. Die Suche nach neuen Verbindungen und Medikamenten, die ersetzen oder in Kombination mit bekannten Antibiotika arbeiten können, ist jedoch im Gange und baut auf verschiedenen Ansätzen auf. Natürliche Produkte sind ein wichtiger Akteur in aktuellen Drogen-Entdeckungskampagnen und vor allem bei der Entdeckung von Anti-Infektions-Medikamenten2. Die Identifizierung neuer Bleistrukturen für die Entwicklung von Antibiotika ist jedoch ein langwieriger und finanziell anspruchsvoller Prozess3. Daher sind die frühen Entdeckungsschritte extrem wichtig, um schon frühzeitig auf die vielversprechendsten Gerüste zu filtern. Erste Schritte bei der Entdeckung von Arzneimitteln für Natürliche produkte umfassen die Erlangung der Struktur einer Verbindung, die Bestimmung der Aktivität in vitro zusammen mit MoA und Zielidentifikation. Die erfolgreichsten Verbindungen, die für die Weiterentwicklung in Frage kommen, sollten ein günstiges Aktivitätsspektrum aufweisen (d. h. breitspektrumige Aktivität bei Antibakterien) und ein neuartiges MoA aufweisen, mit dem bereits bestehende AMR überwunden werden können. Vielversprechende Gerüste werden dann in der Regel in sekundären Assays gescreent, die In-vivo-Bioverfügbarkeit, Toxizität und Stoffwechsel umfassen4. Neben den finanziellen Bedenken steht die Entdeckung von Arzneimitteln für Naturprodukte vor weiteren Herausforderungen in Bezug auf die Kosten und technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Isolierung und Reinigung von Verbindungen, die es wiederum schwierig machen können, in den frühen Stadien des Entdeckungsprozesses mehrere Milligramm oder sogar Grammmengen zu erhalten5,6. Daher ist es in der Naturproduktforschung von größter Bedeutung, in der Lage zu sein, modernste sittliche Primärscreenings mit minimalen ZusammengesetztenMengen durchzuführen, um eine fundierte Entscheidung über weitere Investitionen zu treffen, um ein neuartiges Naturprodukt für die präklinische Entwicklung zugänglich zu machen. Mit der Verwendung von IMC für antibakterielle Profilierung wird die benötigte Menge an Verbindung im Vergleich zu Standardmethoden deutlich reduziert. Die Technik bietet auch tiefergehende Informationen über die Wechselwirkung neuer Medikamente mit der mikrobiellen Gemeinschaft7.
IMC ist eine etablierte Methode zur Messung der Gesamtenergie als Ergebnis aller biologischen, physikalischen und biochemischen Prozesse und Reaktionen in einem biologischen System. Die bakterielle Energiefreisetzung ist proportional zu den gesamten Stoffwechselreaktionen8. Innerhalb eines geschlossenen Systems, wie dem verwendeten Mikrokalorimeter, können die Wärmeniveaus im Mikrowattbereich gemessen werden, um die metabolische Kinetik von Bakterien9,10,11,12zu untersuchen. Die Wärme (Energie), die von Bakterien freigesetzt wird, ist mit zellulären Funktionen verbunden, die ihrem Stoffwechsel zugrunde liegen und die nicht unbedingt proportional zur zellulären Biomasse sind.
Anfangs war die Anwendbarkeit der isothermen Kalorimetrie für mikrobiologische Assays aufgrund des geringen Durchsatzes und der hohen Testvolumina begrenzt. Das verwendete Mikrokalorimeter ist jedoch einzigartig, da es die Vorteile der isothermen Kalorimetrie mit erhöhtem Durchsatz und geringeren Zusammengesetzten Anforderungen kombiniert, was es zu einem wertvollen Werkzeug für Anwendungen zur Arzneimittelentdeckung macht10. Darüber hinaus bietet das Instrument weitere Vorteile gegenüber alternativen Methoden zur Messung der bakteriellen Wachstumskinetik, wie z.B. der Standard-Trübungsmethode, die auf der Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD<600)basiert. Die Messung von OD600 basiert auf der Annahme, dass eine erhöhte optische Dichte dem mikrobiellen Wachstum gleichkommt, wodurch das Vorhandensein nicht lebensfähiger Zellen vernachlässigt wird. Diese Methode wurde auch kritisiert, da sie kleine Kolonievarianten und Persistenzzellen11ausschließt. Im Gegensatz dazu ermöglicht IMC die Echtzeitbeobachtung jeder Art von lebensfähigen Zellen. Wenn Zellen ruhen, weisen sie immer noch metabolische Aktivität auf und können daher von IMC erkannt werden, während solche Phänomene mit der Standard-Trübungsmethode11nicht nachweisbar sind. Weitere Vorteile von IMC sind eine kürzere antimikrobielle Anfälligkeitstestzeit, die Messung von Arzneimittelwechselwirkungen in einer komplexen Gemeinschaft und Standardanalysemethoden, ohne die Probe zu zerstören7.
Die IMC-Technologie wurde in einer breiten Palette von Studien implementiert, von Mikrobiologie bis Thermogenese und Krebsbiologie13,14,15,16,17. Die mikrobiellen Anwendungen umfassen die Bestimmung von minimalen hemmenden Konzentrationen (MIC) von Verbindungen gegen verschiedene Bakterienstämme. Mehrere Studien wurden durchgeführt, und es wurde der Schluss gezogen, dass MIC-Daten aus der isothermen Kalorimetrie für die Meisten Bakterienarten schneller gewonnen werden können und die Ergebnisse im Vergleich zu anderen (Standard-)Methoden für die MIC-Bestimmung12,18,19vergleichbar sind. Weitere Anwendungen von IMC sind die Beobachtung der Wechselwirkung von Medikamenten und die Kombination von medikamentösen Behandlungen mit komplexen bakteriellen Gemeinschaften wie Biofilme11. Eine Studie, die sich auf MoA-Profilierung konzentrierte, zeigte, dass das Mikrokalorimeter einen Unterschied in Cephalosporinen der ersten und zweiten Generation erkennen kann, während verschiedene Antibiotika mit dem gleichen MoA eine ähnliche Wärmeflusskurve aufweisen wie die anderen18.
Hier beschreiben wir die Verwendung von IMC für die MoA-Profilierung neuer Naturprodukte mit dem neuen isothermen Mikrokalorimetrie-Instrument. Die Methode wird verwendet, um wirksame Antibiotikakonzentrationen zu bestimmen und die Eigenschaften von Antibiotika in Bezug auf bakterizide oder bakteriostatische Mechanismen zu beschreiben. Die Methode kann weitgehend in MoA-Profilierung von Verbindungen implementiert werden und könnte Standard mikrobiologische Methoden ersetzen oder zumindest ergänzen. Zukünftige Studien werden eingehende Fingerabdruckanalysen umfassen, die eine Differenzierung von Antibiotikaklassen auf der Grundlage von Zielmechanismen ermöglichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

Aufgrund der globalen Bedrohung durch steigende Antibiotikaresistenzen werden neue Antibiotika dringend benötigt. Wir untersuchen natürliche Produkte aus Myxobacteria als innovative Quelle solcher neuen Verbindungen. Ein Engpass im Prozess ist in der Regel die Aufklärung ihrer Wirkungsweise. Kürzlich haben wir die isotherme Mikrokalorimetrie als Teil einer routinemäßigen Profiling-Pipeline etabliert. Diese Technologie ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Antibiotika-Exposition auf die gesamte bakterielle Stoffwechselreaktion, einschließlich Von der Biomassebildung entkoppelter Prozesse. Wichtig ist, dass bakteriostatische und bakterizide Wirkungen ohne Benutzereingriffe während der Messungen leicht zu unterscheiden sind. Die isotherme Mikrokalorimetrie ist jedoch ein ziemlich neuer Ansatz, und die Anwendung dieser Methode auf verschiedene Bakterienarten erfordert in der Regel eine Vorbewertung geeigneter Messbedingungen. Es gibt einige Referenz-Thermogramme von bestimmten Bakterien, die die Interpretation der Ergebnisse erheblich erleichtern. Da der Pool an Referenzdaten stetig wächst, erwarten wir, dass die Methodik in Zukunft eine zunehmende Wirkung haben wird, und erwarten, dass sie eingehende Fingerabdruckanalysen ermöglicht, die eine Differenzierung der Antibiotikaklassen ermöglichen.

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Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Die Aufklärung der Wirkungsweise eines neuartigen Antibiotikums ist eine herausfordernde Aufgabe im Prozess der Arzneimittelentdeckung. Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist die Anwendung der isothermen Mikrokalorimetrie mit calScreener in antibakteriellem Profiling, um zusätzliche Einblicke in Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Mikroben zu geben.

Metabolische Profilerstellung zur Bestimmung bakterizider oder bakteridarischer Wirkungen neuer Naturprodukte mit isothermen Mikrokalorimetrie

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Das Verständnis der Wirkungsweise neuartiger antibakterieller Verbindungen ist eine wichtige, aber schwierige Aufgabe. Diese Methode bietet Einblicke in solche Mechanismen und es ist einfach zu implementieren. Diese Technik ermöglicht eine Echtzeitbeobachtung antibakterieller Wirkungen auf nichtinvasive Weise, was eine weitere Probenanalyse ermöglicht.Obwohl das Üben mit mikrobiologischen Techniken eine Voraussetzung ist, ist das Experiment einfach durchzuführen. Die Zeit mit der Datenanalyse ist sehr wichtig, wenn Sie zum ersten Mal Mikrokalorimetrie durchführen. Beginnen Sie mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern, um die optische Dichte der Nachtkultur zu messen.Verdünnen Sie die Kultur auf eine 5 mal 10 bis die 5. Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter frischer MHB-mittlerer Konzentration und fügen Sie 150 Mikroliter Zellen in der Konzentration des Interesses zu jeder 1,5 Milliliter Tube Antibiotikum hinzu. Dann mischen Sie die Verbindung mit den Zellen durch Wirbeln. Zur Vorbereitung der Einsätze 120 Mikroliter jedes Bakterien-Antibiotikagemischs in einzelne Kunststoffeinsätze in den entsprechenden Brunnen einer 48-Well-Platte geben und mit einer Pinzette alle Titanfläschchen in die Halterungen legen.Übertragen Sie die Einsätze vorsichtig in die Titanfläschchen in der Halterplatte und legen Sie Titandeckel lose auf alle Fläschchen. Wenn alle Einsätze übertragen wurden, legen Sie den Halter auf den vorgesehenen Bereich auf der Probenstation und verwenden Sie einen Drehmomentschlüssel, der auf 40 Centinewtonmeter eingestellt ist, um alle Deckel festzuziehen. Starten Sie in der Systemsoftware ein neues Experiment und ziehen Sie den Probeneinsteckarm vom Instrument ab.Stellen Sie den Becherhalter auf die Brücke mit Dersäule acht gegenüber der Probeneinlageöffnung und drücken Sie den Becherhalter vorsichtig an Position eins in das Instrument. Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat, bevor Sie die experimentellen Brunnen beschriften. Als nächstes drücken Sie den Probeneinsteckarm, bis sich der Becherhalter an Position zwei befindet.Nachdem Sie das System 20 Minuten lang stabilisieren konnten, drücken Sie den Probeneinschubarm auf Position drei und ziehen Sie den Probeneinschubarm zurück, bis er sich an der Laufposition befindet. Markieren Sie alle Brunnen in der Software und wählen Sie den Reaktionsstart aus, und führen Sie dann das Experiment aus, bis die Wärmeemissionswerte stabil wieder bei Null liegen. Wählen Sie am Ende der Analyse Stopp aus.Die Software wird dann fragen, ob Sie sicher sind. Wählen Sie ja aus, und speichern Sie das Experiment für die Datenanalyse. Legen Sie dann den Probeneinsteckarm vollständig in das Instrument ein und greifen Sie die Magnete an, um den Becherhalter zu erhalten.Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Software, und wählen Sie das offene Experiment aus. Wählen Sie im Popup-Fenster das Experiment aus, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf Alle auswählen, und definieren Sie die Basislinie, um die Daten an jeder Position zu normalisieren.Wählen Sie im Popupfenster innerhalb der Verzögerungsphase einen Zeitraum von mehr als 30 Minuten aus. Nach der Auswahl wird die Basislinie im Thermogramm grün angezeigt. Schließen Sie das Fenster zum Definieren des Basislinienabschnitts, und klicken Sie dann auf Speichern und Schließen der Software.Öffnen Sie anschließend die webbasierte SymCel-Berechnungsanalyseanwendung. Klicken Sie auf Navigieren, um die interessierte Datei hochzuladen, und wählen Sie das Experiment aus. Die metabolischen Parameter werden automatisch für die 32 Proben berechnet.Um die Wärmeflussdaten an Gompertz- und/oder Richards Growth-Modelle anzupassen, klicken Sie auf die Wachstumsfunktion. Wachstumsmodelle werden im kumulativen Abschnitt zum Vergleich mit den Rohdaten im Flow-Abschnitt angezeigt. Um die berechneten Parameter herunterzuladen, klicken Sie auf Messgrößen herunterladen, wählen Sie den Speicherort der Datei aus und klicken Sie auf Speichern.Die Datei wird zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle exportiert. Hier werden die Thermogramme angezeigt, die durch Aussetzen von A.baumannii DSM-30008 ciprofloxacin in serieller Verdünnung gewonnen wurden. Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,1 Mikromolaren haben einen minimalen Einfluss auf das Wachstum und den Stoffwechsel von A.baumannii.Die Behandlung der Zellen mit 0,5 mikromolarem Ciprofloxacin führt jedoch zu einer signifikanten Verschiebung der Verzögerungsphasendauer und zu einem geringeren maximalen Wärmestrom. Diese beiden Änderungen zusammen beeinflussen die Zeit bis zum Höhepunkt, was zu einer Erhöhung um etwa sechs Stunden führt. In dieser Abbildung wird die kumulativ eklamierte Wärme gegen die Zeit dargestellt, mit dem Effekt jeder Konzentration, die durch eine Steigung der Steigung reflektiert wird.Die Quantifizierung der Thermogrammneigung ermöglicht die Berechnung der maximalen Stoffwechselrate von A.baumannii in Gegenwart von Ciprofloxacin mit einer gleichzeitigen Abnahme der Stoffwechselrate, die in Zellen beobachtet wird, die mit 0,5 mikromolarem Ciprofloxacin behandelt werden. Die Rifampicin-Behandlung hat eine dramatische Wirkung auf die Thermogramme von A.baumannii DSM-30008. Eine signifikante Verringerung der Wärmeemission im Zusammenhang mit einer Abnahme der metabolischen Aktivität wird auch beobachtet.Beachten Sie die Erhöhung der Zeit bis zum Höhepunkt für alle getesteten Konzentrationen und die Abnahme der Stoffwechselrate durch die Abnahme der Steigung für alle Konzentrationen, die in der Regel auf eine bakterizide Wirkung zugeschrieben werden. Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, verwenden Sie die umgekehrte Pipettierung und verhindern Sie zusätzliche Flüssigkeit an den Seiten des Einsatzes, wenn Sie die Probe übertragen, stellen Sie außerdem sicher, dass die Deckel ordnungsgemäß geschlossen sind.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Forschung

Biotechnik

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

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Metabolische Glykan der Sialinsäure Säure mit N-Acyl-Mannosamines geändert

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Herstellung von Nafion-beschichtet, reduziert Graphene Oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor Monitor pH in Echtzeit während der mikrobiellen Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Standardprüfverfahren ASTM D 7998-19 zur kohäsiven Festigkeitsentwicklung von Holzklebstoffen

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

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Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...