Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לצוות של Symcel על דיונים פוריים ואנחנו רוצים להכיר בתמיכה הגדולה של גאנה אוליניק ווילהלם פולנדר. ברצוננו גם להודות דניאל Kohnhäuser על מתן המוצר הטבעי סטפני שמידט עבור תמיכה טכנית מיומנת.

הערה: יש להגדיר את טמפרטורת המכשיר בהתאם לחיידק המשמש לפחות יום מראש כדי להבטיח את יציבות המערכת. כאן, דגימות Acinetobacter baumannii DSM30008 פועלות ב-30 מעלות צלזיוס.
1. הכנת תרבות
<ol><li>פס החוצה המתח תחת חקירה (כאן: A. baumannii)על לוח אגר CASO דגירה לילה באינקובטור סטטי ב 30 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו תרבות לילה על ידי לחסן מושבה אחת ב-MHB (מרק מולר-הינטון) ותדגירה על אינקובטור רועד ב-180 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. הכנת מדגם
<ol><li>השתמש 1.5 מ"ל צינורות כדי להכין את טווח הריכוז של תרופה או תרכובת שנבחרו (למשל, על ידי הוספת 1.5 μL של פתרונות מניות 100x ב DMSO; ראה שלב 2.3).</li>
	<li>לדלל את תרבות הלילה במדיום MHB.<ol>
<li>למדוד את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 מיליאמפר.</li>
		<li>לדלל את התרבות כדי לקבל 5 x 105 מושבה יוצרים יחידות (CFU)/ מ"ל במדיום MHB טרי. OD600 של אחד שווה כ 5 x 108 CFU / מ"ל (למשל, Escherichia קולי, Staphylococcus aureus, A. baumannii). הערה: חשוב לכייל את גורם ההמרה OD600 ל- CFU/mL עבור כל זן חיידקי בודד תחת תנאי ההתבולה החלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 150 μL של התאים למבחנות שהוכנו בשלב 2.1, הבטחת ריכוז סופי נכון של תרופה נבדקה או תרכובת וריכוז התא הסופי הנכון.</li>
	<li>מערבבים את המתחם עם התאים על ידי מערבולת. הערה: לוח המדגם (ראה טבלת חומרים)כולל שש שורות, שכל אחת מהן מכילה שמונה בארות, בסך הכל 48 בארות; שורה א' ושורה F הן ההפניה התרמודינמית. לכן, אין דוגמאות ניתן לטעון לתוך בארות אלה, מדיה מתאימה נטען לתוך בארות אלה. ניתן למדוד 32 דגימות בדיקה בכל הפעלה, באמצעות בארות בשורות B-E. יש להפעיל דגימת בדיקה בודדת לכל הפחות בכפילויות (כאן: כל הדגימות נוהלו כשלי 3licates). יש לכלול בקרות צמיחה.</li>
</ol>3. הוסף הכנה
<ol><li>מעבירים 120 μL מהתערובת שהוכנה בשלב 2.4 לתוססות הפלסטיק. הערה: השתמש בצנרת הפוכה בשלב 3.1 כדי למנוע ריסוס נוזלים בצידי תוספות הפלסטיק, דבר שיכול להוביל להפרעה לקריאות אותות נכונות.</li>
	<li>מניחים את כל בקבוקוני הטיטניום במחזיקים (ראו טבלתחומרים) עם פינצטה.</li>
	<li>מעבירים בעדינות את התוסיפים לתוך בקבוקוני הטיטניום בצלחת המחזיק.</li>
	<li>מניחים באופן רופף מכסי טיטניום על כל בקבוקוני הטיטניום.</li>
</ol>4. הוסף טעינה
<ol><li>מעבירים את המחזיק עם כוסות טיטניום לתחנת הדגימה ומעבירים על האזור המיועד.</li>
	<li>השתמש במפתח הברגים מומנט, להגדיר כוח 40 cNm, כדי להדק את כל העפעפיים.</li>
</ol>5. הפעלת דגימות
<ol><li>בתוכנה calView, להתחיל ניסוי חדש(דמות משלימה 1).</li>
	<li>משוך את זרוע הכניסה לדוגמה מהמכשיר.</li>
	<li>מניחים את מחזיק הספל על "הגשר", עמודה 8 מול פתח הכניסה לדוגמה ודוחפים בעדינות את מחזיק הספל לכלי ב"עמדה 1" הייעודית. המתן 10 דקות עד שהמערכת תתייצב. תייג את בארות הניסוי.</li>
	<li>לחץ על זרוע הכניסה לדוגמה עד מחזיק הספל הוא ב"מיקום 2" המיועד. המתן 20 דקות עד שהמערכת תתייצב.</li>
	<li>דחפו את זרוע הכניסה לדוגמה ל"מיקום 3" ומשוך את זרוע הכניסה לדוגמה עד שהיא נמצאת ב"תנוח הריצה". סמן את כל הבארים בתוכנה ובחר תגובה להתחיל (איור משלים 4).</li>
	<li>הפעל את הניסוי עד פליטת החום קורא הם בחזרה בייצבות באפס. הערה: ודא שכל הבארים מתנהגות דומות בשלבים אלה. איור משלים 5 ממחיש מה יש לצפות אם הבארים נטענים כראוי. אם נטען באופן שגוי, חזור על שלבים 5.2-5.4.</li>
</ol>6. הסר את מחזיק הספל
<ol><li>בתוכנה, בחר עצור (איור משלים 6). לאחר מכן התוכנה תשאל אם "אתה בטוח", בחר כן (איור משלים 7) ולשמוראת הניסוי על כונן או שולחן עבודה לניתוח נתונים(דמות משלימה 8).</li>
	<li>הכנס את זרוע הכניסה לדוגמה לחלוטין לתוך המכשיר ולהפעיל את המגנטים כדי לאחזר את מחזיק הספל.</li>
	<li>שחררו את המכסים, הסירו את התוספות והניחתו בקבוקונים ומכסים במחזיקי זכוכית והניחתם למשך 4 שעות ב-180 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הניחו את הבקבוקונים והמכסים במתייבש כדי להבטיח שהמכסים והבקבוקונים יבשים.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את התוכנה(איור משלים 9), בחר פתח ניסוי בפינה השמאלית העליונה(איור משלים 10). בחלון המוקפץ בחר את הניסוי של עניין ולחץ על פתח (איור משלים 11). היישום יפתח את הניסוי בתצוגת בארות ברירת מחדל(איור משלים 12).</li>
	<li>לחץ על בחר את כל או Ctrl+A (איור משלים 13).</li>
	<li>לחץ על הגדרתוכנית בסיסית , פרמטר זה מנרמל את הנתונים בכל מיקום(איור משלים 14). בחלון המוקפץ בחר פרק זמן של >30 דקות הממוקם בשלב ההשהיה (זרימת החום צריכה להיות נמוכה, בין אפס לעשרה μW; דמות משלימה 15). לאחר בחירת פרק זמן של קו בסיס, התוכנית הבסיסית שנבחרה תופיע בירוק בתרמוגרמה. סגור את החלון הגדרת מקטע בסיסי.</li>
	<li>לחץ על שמור או Ctrl+S וסגור את התוכנה(איור משלים 16).</li>
	<li>פתח יישום ניתוח סימצ'ל קלורימטריה מבוסס אינטרנט (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>כדי להעלות את הקובץ ליישום ניתוח Calorimetry, לחץ עיון (איור משלים 17),בחר את הניסוי ולחץ על פתח (איור משלים 18). הפרמטרים חילוף החומרים יחושבו באופן אוטומטי עבור 32 דגימות ביישום האינטרנט (איור משלים 19).</li>
	<li>על מנת להתאים את נתוני זרימת החום ל-Gompertz ו/או למודלים של ריצ'רד, לחץ על פונקציית צמיחה. מודלי צמיחה מתאימים יוצגו בסעיף "מצטבר", בהשוואה גם לנתונים הגולמיים בסעיף "זרימה" (איור משלים 20).</li>
	<li>כדי להוריד את כל הפרמטרים המחושבים, לחץ על אמצעי הורדה. בחר את מיקום הקובץ ולחץ על שמור(איור משלים 21). הקובץ ייוצא גיליון אלקטרוני לחישובים נוספים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

הפרויקט בוצע בשיתוף עם Symcel, המפתחת של טכנולוגיית calScreener. לסופרים אין מה לחשוף.

מיקרוקלורימטריה איזותרמית מודדת אנרגיה הנפלטת מדגימה לאורך זמן ושחרור אנרגיה זה הוא תוצאה של כל התהליכים הכימיים הביולוגיים, הפיזיים (הביולוגיים והביו-כימיים). זרימת החום נמדד ניתן לנצל כדי להעריך או לקבוע השפעות אנטיבקטריאליות של חומרים כפי שהוא מאפשר ניטור רציף בזמן אמת של פעילות מטבולית.
על מנת להשיג נתונים אמינים לניתוח, יש לקבוע יחידות נכון של מושבה (CFU) בנפרד עבור כל מין או זן המשמשים. במקרה ספירת CFU הוא נמוך מדי, זה מוביל שלב השהיה ממושכת כפי שלוקח זמן רב יותר עבור המערכת להגיע כמות קריטית של ביומסה לייצר מספיק חום כדי להתגלות. במקרה שספירת CFU גבוהה מדי, שלב ההשהיה יהיה קצר מאוד, וכמות החום המיוצר עלולה לגרום להעברת חום לתאי חיישנים סמוכים (הפניה ובבארות ניסיוניות) ולגרום לעיוותים של התרמוגרם. מספרים גבוהים של CFU גם יובילו לדלדול חמצן מהיר יותר ולעבור לתנאים אנאירוביים. יש לקחת בחשבון גם כי במהלך 30 הדקות הראשונות של הניסוי, כאשר המערכת משווה, איסוף נתונים אינו אפשרי וההקלטה בפועל של אפקטים מתעכבת. בנוסף, קביעת CFU שגויה מובילה לקביעת MIC כוזבת, ובסופו של דבר משפיעה על הניסוי ועל השינויים שנצפו25. נקודה קריטית נוספת היא הקביעה הנכונה של קו הבסיס. בדרך כלל, האות הבסיסי נבחר במהלך שלב ההשהיה כאשר אות זרימת החום הוא אפס ובאופן אידיאלי, טווח הזמן להגדרה בסיסית הוא >30 דקות. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כמו הזמן כי החיידקים דורשים להגיע למגבלת זיהוי אותות חום שונה בין זנים מינים. מינים או זנים מסוימים דורשים יותר מ-30 דקות כדי להגיע למגבלת זיהוי אותות החום בעוד זנים או מינים אחרים מגיעים אליהם ב-30 הדקות הראשונות. במקרה זה, ניתן לבחור את האות הבסיסי בסוף הניסוי כאשר כל אותות החום ירדו בחזרה לאפס ולהישאר יציבים. לחלופין, ניתן להשתמש בנספות מניסויים אחרים עם אותו זן חיידקי, אשר עם זאת אינו מומלץ.
המערכת מאפשרת גמישות מסוימת במונחים של עיצוב ואופטימיזציה של ניסויים ופתרון בעיות. כרכים בשימוש נמצאים בטווח של 100-300 μL בעת שימוש תוספות פלסטיק 100-600 μL בעת שימוש כוסות טיטניום ללא תוספות פלסטיק. נפח העבודה המומלץ על ידי היצרן הוא 120 μL. השימוש בכמויות שונות בהקמת סדרה ניסיונית חדשה, ותוך מציאת תנאים אופטימליים למדידות, משפיע בעיקר על שני פרמטרים. באמצעות אמצעי אחסון נמוכים יותר, ניתן להקטין את כמות תרכובת הבדיקה הנדרשת, דבר שחשוב במיוחד עבור תרכובות, הזמינות רק בכמויות קטנות. בנוסף, הנפח בשימוש משפיע ישירות על זמינות החמצן במהלך המדידה עם נפחים נמוכים יותר להגדיל את כמות החמצן הזמין הנדרש לצמיחה חיידקים. דלדול חמצן הוא אחד הגורמים העיקריים התורמים למשך הזמן המרבי האפשרי של הניסוי. חשוב לציין, ניתן להשתמש במדיה מוצקה, לא רק במדיה נוזלית. זה חשוב במיוחד עבור מיקרואורגניזמים בצמיחה איטית כמו צמיחה בממשק בין שלב מוצק וגז מאפשר גישה טובה יותר חמצן9.
IMC הוא כלי אנליטי שימושי לגילוי תהליכים לא ידועים עם יישומים בפיזיקה, כימיה וביולוגיה. השיטה מודדת את חילופי החום בתוך מערכת סגורה וניתוח של חילופי החום המתוקליטים מספק מידע נוסף שלא תמיד ניתן להשיג בשיטות סטנדרטיות. במחקר מיקרוביולוגיה ואנטיביוטיקה, אחד היתרונות הגדולים ביותר של IMC היא היכולת שלה להבחין בין תאים חיים, מתים ו persister או רדום, אשר אינו אפשרי באמצעות שיטות טורביותסטנדרטיות 11. בנוסף, IMC הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות פליטת חום מ כמה שיותר 104-105 תאים9. יתרון נוסף הוא שההתקנה הניסיונית מהירה וקלה, והיא מאפשרת מעקב רציף בזמן אמת עם מינימום עד ללא הפרעה למשתמש. יתר על כן, IMC הוא לא הרסני, המאפשר ניתוח נוסף של דגימות. ניתוח נתונים מאפשר פענוח של היווצרות ביומסה עד שלב אקספוננציאלי מאוחר או נייח מוקדם ופעילות מטבולית בשלב נייח.
מלבד תכונות היישום הרומן והמרגש שהוזכרו לעיל, יש גם חסרונות לשיטה זו. המגבלה העיקרית היא שמכשירי IMC מודדים את החום הכולל המיוצר ומשוחרר בתוך מערכת ספציפית, הכוללת גם אותות לא ספציפיים. זה מדגיש את החשיבות של תכנון ניסיוני עם פקדים מתאימים כדי להיות מסוגל להעריך את שינויי אות החום הנמדדים על ידיהקלטת זרימת חום 9,20.
בידיים שלנו, IMC הוא כלי חשוב ללמוד השפעות אנטיבקטריאליות של מוצרים טבעיים חדשים ולקבוע טווחי ריכוז יעילים. מלבד הבדיל בין השפעות bacteriostatic ו bactericidal, זה יכול לשמש בעתיד כחלק מחקרי זיהוי היעד ונחישות MoA. זה יכול להיעשות על ידי השוואת תרמוגרם של מחלקות אנטיביוטיקה שונות לתרמוגרם של תרכובות פעילות חדשות כפי שמוצג כאן. עם זאת, עדיין צריך לחקור אם פרמטרים מסוימים הניתנים לכימות שניתן לחלץ מהנתונים הנמדדים מספיקים להשוואות כאלה או אם יהיה צורך לעבוד על אלגוריתמים המעניקים טביעות אצבעות המבוססות על תרמוגרם מלא. יישום אפשרי נוסף בתחום המחקר האנטיביוטיקה הוא השוואה של wildtype שיבוטים עמידים, יחד עם רצף הגנום כולו, אשר יכול לעזור בהדרת מצב ההתנגדות (MoR) של אנטיבקטריאליים חדשים. בשל האופי הסטטי של השיטה, חקירת היעילות של סוכנים חדשים על היווצרות biofilm או על biofilms כבר הוקמה יכול להוביל להבנה טובה יותר של התהליך הביולוגי ואת ההשפעה של סוכנים נבחרים על חיידקים בשלבים שונים של רדום. IMC רשומות אנרגיה כוללת שוחרר בצורה של חום מה שהופך אותו שיטה מתאימה לחקור גם השפעות תת מעכבות של חומרים פעילים שעשויים להיות יחד עם תעתיק. שיטה זו יכולה לשמש גם בהגדרות קליניות כדי לזהות זיהום של דגימות או לקביעת אנטיביוגרמות עוזר להחליט במהירות על טיפול מוגדר שלהחולים 11.

מטרת שיטה זו היא להחיל מיקרוקלורימטריה isothermal (IMC) כמו תפוקה בינונית assay במצב של פעולה (MoA) פרופיל של תרכובות אנטיבקטריאליות חדשות. שיטה זו חושפת נתונים לגבי הפעילות של תרכובות על מינים חיידקיים ומספקת מידע על האופי bactericidal או bacteriostatic של המתחם עצמו.
עלייתה של עמידות מיקרוביאלית המתעוררים (AMR) היא בעיה גלובלית וזה מוביל טיפולים פחות יעילים של זיהומים נפוצים עם אנטיביוטיקהידועה 1. עם זאת, החיפוש אחר תרכובות ותרופות חדשות שיכולות להחליף או לעבוד בשילוב עם אנטיביוטיקה ידועה נמשכות וזה בנוי על גישות מגוונות. מוצרים טבעיים הם שחקן מפתח בקמפיינים הנוכחיים גילוי סמים ובמיוחד בגילוי תרופות נגדזיהומים 2. עם זאת, זיהוי מבני עופרת חדשים לפיתוח אנטיביוטיקה הוא תהליך ארוך ותובעני מבחינה כלכלית3. לכן, השלבים המוקדמים של הגילוי חשובים מאוד על מנת לסנן על הפיגומים המבטיחים ביותר כבר בשלב מוקדם. צעדים ראשוניים בגילוי תרופות מוצר טבעי כוללים השגת מבנה של מתחם, קביעת הפעילות במבחנה יחד עם MoA וזיהוי היעד. רוב התרכובות המוצלחות להיות זכאי לפיתוח נוסף צריך להציג ספקטרום חיובי של פעילות (כלומר, פעילות ספקטרום רחב במקרה של אנטיבקטריאליים) רומן MoA שבו AMR קיים מראש ניתן להתגבר. פיגומים מבטיחים מוקרנים בדרך כלל בהנאות משנית, הכוללים זמינות ביולוגית vivo, רעילות, וחילוף חומרים4. מלבד החששות הכספיים, גילוי תרופות מוצר טבעי עומד בפני אתגרים נוספים לגבי העלויות וקשיים טכניים הקשורים בידוד מורכב טיהור, אשר, בתורו, יכול לעשות את זה קשה להשיג כמויות מרובות מיליגרם או אפילו גרם בשלבים המוקדמים שלתהליך הגילוי 5,6. לכן, יש חשיבות עליונה במחקר המוצר הטבעי כדי להיות מסוגל לבצע ההקרנה העיקרית המדינה-of-the-art עם כמויות מורכבות מינימליות על מנת לקחת החלטה מושכלת על השקעות נוספות כדי להפוך מוצר טבעי חדשני נגיש לפיתוח פרה-קליני. עם השימוש IMC עבור פרופיל אנטיבקטריאלי, כמות המתחם הדרוש מופחת באופן משמעותי בהשוואה לשיטות סטנדרטיות. הטכניקה מספקת גם מידע מעמיק יותר לגבי האינטראקציה של תרופות חדשות עם הקהילה המיקרוביאלית7.
IMC היא שיטה מבוססת למדידת אנרגיה כוללת כתוצאה מכל התהליכים הביולוגיים, הפיזיים והביוכימיים והתגובות במערכת ביולוגית. שחרור אנרגיה חיידקית הוא פרופורציונלי לתגובות חילוף החומרים הכולל8. בתוך מערכת סגורה, כגון מיקרוקלורימטר בשימוש, ניתן למדוד את רמות החום בטווח microwatt כדי ללמוד את הקינטיות חילוף החומרים שלחיידקים 9,10,11,12. החום (אנרגיה) המשתחרר על ידי חיידקים מקושר לפונקציות תאיות כי בבסיס חילוף החומרים שלהם, כי הם לא בהכרח פרופורציונליים ביומסה התא.
בתחילה, הישימות של קלורימטריה isothermal עבור בדיקות מיקרוביולוגיות הוגבלה בשל התפוקה הנמוכה שלה ונפחי בדיקה גבוהים. עם זאת, microcalorimeter בשימוש הוא ייחודי כפי שהוא משלב את היתרונות של קלורימטריה איזותרמית עם תפוקה מוגברת ודרישות מורכבות נמוכות יותר, מה שהופך אותו לכלי בעל ערך עבוריישומי גילוי סמים 10. יתר על כן, המכשיר מספק יתרונות נוספים על פני שיטות חלופיות למדידת קינטיקה צמיחה חיידקית, כגון שיטת המערבולת הסטנדרטית, אשר מבוסס על מדידה של צפיפות אופטית ב 600 טנ"מ (OD<600). מדידת OD600 מבוססת על ההנחה כי צפיפות אופטית מוגברת שווה לצמיחה מיקרוביאלית, ובכך מזניחה את הנוכחות של תאים שאינם קיימא. שיטה זו גם זכתה לביקורת מכך שהיא אינה כוללת משתני מושבה קטנים ותאים Persister11. לעומת זאת, IMC מאפשר תצפית בזמן אמת של כל סוג של תאים קיימא. אם התאים רדומים, הם עדיין מפגינים פעילות מטבולית ולכן הם יכולים להתגלות על ידי IMC, בעוד תופעות כאלה אינן ניתנות לזיהוי על ידי שיטת המערבולתהסטנדרטית 11. יתרונות אחרים של IMC כוללים זמן בדיקה קצר יותר של רגישות מיקרוביאלית, מדידת אינטראקציות סמים בקהילה מורכבת ושיטות ניתוח סטנדרטיות מבלי להרוס אתהמדגם 7.
טכנולוגיית IMC יושמה במגוון רחב של מחקרים, החל ממיקרוביולוגיה ועד תרמוגנזהוביולוגיה של סרטן 13,,14,,15,,16,,17. היישומים המיקרוביאליים כוללים את הקביעה של ריכוזים מעכבים מינימליים (MIC) של תרכובות נגד זנים חיידקיים שונים. מספר מחקרים נעשו והוסכם כי נתוני מיקרופון מקלורימטריה isothermal עבור רוב המינים חיידקים ניתן להשיג מהר יותר והתוצאות דומות בהשוואה לשיטות אחרות (סטנדרטיות) לקביעת מיקרופון12,18,19. יישומים נוספים של IMC כוללים התבוננות באינטראקציה של תרופות ושילוב של טיפולים תרופתיים עם קהילות חיידקים מורכבים כגון biofilms11. מחקר המתמקד בפרופיל MoA הראה כי מיקרוקלורימטר יכול לזהות הבדל צפלוספורינים הדור הראשון והשני, בעוד אנטיביוטיקה שונה עם אותו MoA להפגין עקומת זרימת חום דומה בהשוואהזה לזה 18.
כאן, אנו מתארים את השימוש IMC עבור פרופיל MoA של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מכשיר מיקרוקלורימטריה isothermal החדש. השיטה משמשת כדי לקבוע ריכוזים אנטיביוטיים יעילים ולתאר מאפיינים של אנטיביוטיקה במונחים של מנגנוני bactericidal או bacteriostatic. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב בפרופיל MoA של תרכובות וזה עשוי להחליף או לפחות להשלים שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. מחקרים עתידיים יכללו ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים שיאפשרו בידול של מחלקות אנטיביוטיות בהתבסס על מנגנוני היעד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

בשל האיום העולמי של עמידות מיקרוביאלית עולה, אנטיביוטיקה רומן נחוצים בדחיפות. אנו חוקרים מוצרים טבעיים מ Myxobacteria כמקור חדשני של תרכובות חדשות כאלה. צוואר בקבוק אחד בתהליך הוא בדרך כלל ההברה של מצב הפעולה שלהם. לאחרונה הקמנו מיקרוקלורימטריה isothermal כחלק צינור פרופיל שגרתי. טכנולוגיה זו מאפשרת לחקור את ההשפעה של חשיפה לאנטיביוטיקה על התגובה המטבולית החיידקית הכוללת, כולל תהליכים המפוענחים מהיווצרות ביומסה. חשוב לציין, אפקטים bacteriostatic ו bactericidal ניתן להבחין בקלות ללא כל התערבות המשתמש במהלך המדידות. עם זאת, מיקרוקלורימטריה isothermal היא גישה חדשה למדי ויישום שיטה זו על מינים חיידקיים שונים בדרך כלל דורש הערכה מראש של תנאי מדידה מתאימים. ישנם כמה תרמוגרם התייחסות זמין של חיידקים מסוימים, מאוד להקל על פרשנות של תוצאות. ככל שבריכת נתוני ההתייחסות גדלה בהתמדה, אנו מצפים שלמתודולוגיה תהיה השפעה גוברת בעתיד ומצפים שהיא תאפשר ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים המאפשרים בידול של שיעורי אנטיביוטיקה.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

ההברה של מצב הפעולה של אנטיביוטיקה חדשנית היא משימה מאתגרת בתהליך גילוי התרופה. מטרת השיטה המתוארת כאן היא היישום של מיקרוקלורימטריה isothermal באמצעות calScreener בפרופיל אנטיבקטריאלי כדי לספק תובנה נוספת על אינטראקציות סמים-חיידקים.

פרופיל חילוף חומרים כדי לקבוע את ההשפעות Bactericidal או Bacteriostatic של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מיקרוקלורימטריה איזותרמית

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

הבנת אופן הפעולה של תרכובות אנטיבקטריאליות חדשניות היא משימה חשובה אך קשה. שיטה זו מספקת תובנות על מנגנונים כאלה וקל ליישם אותה. טכניקה זו מאפשרת התבוננות בזמן אמת של השפעות אנטיבקטריאליות באופן לא פולשני המאפשר ניתוח מדגם נוסף.למרות שהתרגול בטכניקות מיקרוביולוגיות הוא תנאי מוקדם, קל לבצע את הניסוי. לוקח את הזמן שלך עם ניתוח נתונים חשוב מאוד בעת ביצוע מיקרוקלורימטריה בפעם הראשונה. התחל באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר כדי למדוד את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה.לדלל את התרבות 5 פעמים 10 למושבה החמישית להרכיב יחידות למיליליטר של ריכוז בינוני MHB טרי ולהוסיף 150 microliters של תאים לכל 1.5 צינור מיליליטר של אנטיביוטיקה בריכוז העניין. ואז לערבב את המתחם עם התאים על ידי מערבולת. כדי להכין את התוספות, להוסיף 120 microliters של כל תערובת אנטיביוטית חיידקים לתוך מוסיף פלסטיק בודדים בארות המתאימות של צלחת 48 היטב ולהשתמש פינצטה למקם את כל בקבוקוני טיטניום לתוך המחזיקים.מעבירים בעדינות את המכניסים לתוך בקבוקוני הטיטניום בצלחת המחזיק ומכניסים באופן רופף מכסי טיטניום על כל הבקבוקונים. לאחר שכל המוסיף הועבר, הנח את המחזיק על האזור המיועד בתחנת הדגימה ולהשתמש מפתח ברגים מומנט להגדיר 40 מטרים כדי להדק את כל המכסים. בתוכנת המערכת, התחל ניסוי חדש והתמשוך את זרוע ההכנסה לדוגמה מהמכשיר.מניחים את מחזיק ה על הגשר עם עמוד שמונה מול פתיחת הכנסה מדגם בעדינות לדחוף את מחזיק ה לתוך המכשיר בעמדה אחת. המתן 10 דקות עד שהמערכת תתייצב לפני שתסמן את בארות הניסוי. לאחר מכן, לדחוף את זרוע החדרת מדגם עד מחזיק ה הוא בעמדה 2.לאחר מתן אפשרות למערכת להתייצב במשך 20 דקות, לדחוף את זרוע החדרת המדגם למיקום שלוש ולחזור בזרוע החדרת המדגם עד שהוא נמצא במצב ריצה. הדגש את כל בארות התוכנה ובחר להתחיל תגובה, ולאחר מכן להפעיל את הניסוי עד קריאות פליטת החום הם בחזרה בחזרה באפס. בסוף הניתוח, בחר עצור.לאחר מכן התוכנה תשאל אם אתה בטוח. בחר כן ושמור את הניסוי לניתוח נתונים. לאחר מכן הכנס את זרוע החדרת הדגימה לחלוטין לתוך המכשיר ו לעסוק מגנטים כדי לאחזר את מחזיק ה.כדי לנתח את הנתונים, פתח את התוכנה ובחר ניסוי פתוח. בחלון המוקפץ, בחר את הניסוי המעניין ולחץ על פתח. לחץ על בחר הכל והגדר תוכנית בסיסית כדי לנרמל את הנתונים בכל מיקום.בחלון המוקפץ, בחר פרק זמן של יותר מ- 30 דקות בתוך שלב ההשהיה. לאחר הבחירה, תוכנית הבסיס תופיע בירוק בתרמוגרם. סגור את חלון המקטע הגדרת בסיס ולאחר מכן לחץ על שמור וסגור את התוכנה.לאחר מכן, פתח את יישום ניתוח הקלורימטריה SymCel מבוסס האינטרנט. לחץ על עיון כדי להעלות את קובץ העניין ובחר את הניסוי. הפרמטרים המטבוליים יחושבו באופן אוטומטי עבור 32 הדגימות.כדי להתאים את נתוני זרימת החום למודלים של Gompertz ו/או Richards Growth, לחץ על פונקציית הצמיחה. מודלי צמיחה יוצגו במקטע המצטבר לשם השוואה לנתונים הגולמיים במקטע הזרימה. כדי להוריד את הפרמטרים המחושבים, לחץ על מידות הורדה, בחר את מיקום הקובץ ולחץ על שמור.הקובץ ייוצא לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. כאן, תרמוגרמים שהושגו על ידי חשיפת A.baumannii DSM-30008 כדי ציפרופלוקסאצין בדילול סדרתי מוצגים. ריכוזים בין 0.005 ו 0.1 micromolar יש השפעה מינימלית על הצמיחה A.baumannii ומטבוליזם.טיפול בתאים עם ציפרופלוקסאצין מיקרומולרי 0.5, לעומת זאת, מוביל לשינוי משמעותי במשך שלב ההשהיה ולזרימת חום מקסימלית נמוכה יותר. שני שינויים אלה יחד משפיעים על הזמן לשיא, וכתוצאה מכך עלייה של כשש שעות. בנתון זה, החום המצטבר המשוחרר מתווה נגד הזמן עם ההשפעה של כל ריכוז המשתקפת על ידי שיפוע של שיפוע.כימות של שיפוע תרמוגרם מאפשר חישוב של קצב חילוף החומרים המרבי של A.baumannii בנוכחות ציפרופלוקסאצין עם ירידה במקביל בקצב חילוף החומרים שנצפה בתאים שטופלו 0.5 ציפרופלוקסאצין מיקרומולרי. טיפול ריפאמפיצין יש השפעה דרמטית על תרמוגרמים של A.baumannii DSM-30008. כמו כן נצפתה הפחתה משמעותית של פליטת החום המתואמת עם ירידה בפעילות המטבולית.שים לב לעלייה בזמן לשיא עבור כל הריכוזים שנבדקו ואת הירידה בקצב חילוף החומרים הנגרמת על ידי ירידה במדרון עבור כל הריכוזים המיוחסים בדרך כלל אפקט bactericidal. כדי להבטיח תוצאות מיטביות, יש להשתמש בצנרת הפוכה ולמנוע נוזל נוסף בצידי ההכנסה בעת העברת הדגימה, גם לוודא כי המכסים סגורים כראוי.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

שיטת בדיקה סטנדרטית ASTM D 7998-19 לפיתוח חוזק מלוכד של דבקי עץ

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...