Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Gli autori ringraziano il team di Symcel per le fruttune discussioni e vorremmo riconoscere il grande sostegno di Ganna Oliynyk e Wilhelm Paulander. Ringraziamo anche Daniel Kohnh-user per aver fornito il prodotto naturale e Stefanie Schmidt per un abile supporto tecnico.

NOTA: La temperatura dello strumento deve essere impostata in base al batterio utilizzato con almeno un giorno di anticipo per garantire la stabilità del sistema. Qui, i campioni di Acinetobacter baumannii DSM30008 sono eseguiti a 30 gradi centigradi.
1. Preparazione della cultura
<ol><li>Strisciare il ceppo in esame (qui: A. baumannii) su una piastra di agar CASO e incubare durante la notte in un incubatore statico a 30 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare una coltura notturna inoculando una singola colonia in MHB (brodo di Mueller-Hinton) e incubare su un incubatore di tre scosse a 180 giri/min a 30 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Utilizzare tubi da 1,5 mL per preparare l'intervallo di concentrazione di un farmaco o di un composto selezionato (ad esempio, aggiungendo 1,5 L di 100x soluzioni di stock in DMSO; vedere il punto 2.3).</li>
	<li>Diluire la coltura notturna in mezzo MHB.<ol>
<li>Misurare la densità ottica della coltura notturna utilizzando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm.</li>
		<li>Diluire la coltura per ottenere 5 x10 5 unità di formazione colonia (CFU)/mL in mezzo MHB fresco. Un OD600 di uno equivale a circa 5 x10 8 CFU/mL (ad esempio, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). NOTA: È importante calibrare il fattore di conversione OD600 in CFU/mL per ogni singolo ceppo batterico nelle condizioni di coltura applicate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 150 L delle cellule alle provette preparate al punto 2.1, garantendo la corretta concentrazione finale del farmaco o del composto testato e la corretta concentrazione finale delle cellule.</li>
	<li>Mescolare il composto con le cellule da vortice. NOTA: La piastra campione (vedi Tabella dei Materiali) ha sei file, ognuna contenente otto pozzetti, per un totale di 48 pozzi; La riga A e la riga F sono il riferimento termodinamico. Pertanto, nessun campione può essere caricato in quei pozzi, i supporti corrispondenti vengono caricati in quei pozzi. 32 campioni di prova possono essere misurati per corsa, utilizzando pozzi nelle righe B-E. Il singolo campione di test deve essere eseguito al minimo in duplicato (qui: tutti i campioni sono stati eseguiti come triplicati). Dovrebbero essere inclusi i controlli alla crescita.</li>
</ol>3. Inserire la preparazione
<ol><li>Trasferire 120 L dalla miscela preparata al punto 2.4 agli inserti in plastica. NOTA: Utilizzare il tubo inverso al punto 3.1 per evitare che il liquido irrorazione sui lati degli inserti di plastica, che può portare a interferenze con le corrette operazioni di lettura del segnale.</li>
	<li>Mettere tutte le fiale in titanio nei supporti (vedi Tabella dei Materiali) con una pinzetta.</li>
	<li>Trasferire delicatamente gli inserti nelle fiale di titanio nella piastra del supporto.</li>
	<li>Posizionare liberamente i coperchi in titanio su tutte le fiale in titanio.</li>
</ol>4. Inserire il carico
<ol><li>Trasferire il supporto con tazze di titanio sulla stazione campione e posizionarlo sull'area designata.</li>
	<li>Utilizzare la chiave di coppia, impostata su 40 cNm forza, per stringere tutti i coperchi.</li>
</ol>5. Esecuzione di campioni
<ol><li>Nel software calView, avviare un nuovo esperimento ( Figura 1 ).</li>
	<li>Ritirare il braccio di inserimento del campione dallo strumento.</li>
	<li>Posizionare il portacoppa sul "ponte", la colonna 8 di fronte all'apertura dell'inserimento del campione e spingere delicatamente il supporto della tazza nello strumento nella "Posizione 1" designata. Attendere 10 minuti per la stabilizzazione del sistema. Etichettare i pozzi sperimentali.</li>
	<li>Spingere il braccio di inserimento del campione fino a quando il supporto della tazza si trova nella "Posizione 2" designata. Attendere 20 minuti per la stabilizzazione del sistema.</li>
	<li>Spingere il braccio di inserimento del campione nella "Posizione 3" e ritrarre il braccio di inserimento del campione fino a quando non si trova nella "posizione di corsa". Evidenziare tutti i pozzetti nel software e selezionare Reaction Start (Supplemental Figure 4).</li>
	<li>Eseguire l'esperimento fino a quando le letture di emissione di calore sono stabilmente indietro a zero. NOTA: Assicurarsi che tutti i pozzetti si comportino in modo simile all'interno di questi passaggi. La Figura supplementare 5 illustra cosa si deve osservare se i pozzi vengono caricati correttamente. Se caricato in modo non corretto, ripetere i passaggi 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Rimuovere il portacoppa
<ol><li>Nel software, selezionare Interrompi (Figura supplementare 6). Il software chiederà quindi se "si è sicuri", selezionare Sì (Figura supplementare 7) e salvare l'esperimento su un'unità o desktop per l'analisi dei dati (Supplemental Figura 8).</li>
	<li>Inserire completamente il braccio di inserimento campione nello strumento e attivare i magneti per recuperare il supporto della tazza.</li>
	<li>Allentare i coperchi, togliere gli inserti e posizionare fiale e coperchi in portasoli di vetro e posizionare per 4 ore a 180 gradi centigradi, quindi mettere le fiale e i coperchi in un desiccatore per garantire che i coperchi e le fiale siano asciutti.</li>
</ol>7. Analisi dei dati
<ol><li>Aprire il software ( Figura 9 ), selezionare Apri nell'angolo superioresinistro ( Figura 10 ). Open experiment Nella finestra popup selezionare l'esperimento di interesse e premere Apri ( Figura 11 ). L'applicazione aprirà l'esperimento nella visualizzazione pozzi predefinita (Figura supplementare 12).</li>
	<li>Premere Seleziona tutto o Ctrl -A (Figura supplementare 13).</li>
	<li>Premere Definisci lineadi base , questo parametro normalizza i dati in ogni posizione( Figura supplementare 14). Nella finestra popup selezionare un periodo di tempo di >30 min situato nella fase di ritardo (il flusso di calore deve essere basso, tra zero e dieciW; Supplementare Figura 15). Dopo la selezione del periodo di tempo della linea di base, la linea di base scelta apparirà in verde nel termogramma. Chiudere la finestra Definisci sezione baseline.</li>
	<li>Premete Salva (Save) o Ctrl -S e chiudete il software (Supplemental Figure 16).</li>
	<li>Aprire l'applicazione di analisi Symcel Calorimetry basata sul Web (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Per caricare il file nell'applicazione di analisi Calorimetry, premere Sfoglia ( Figura 17 ), selezionare l'esperimento e premere Apri ( Figura 18 ). I parametri metabolici verranno calcolati automaticamente per i 32 campioni nell'applicazione Web ( Figura 19 ).</li>
	<li>Per adattare i dati del flusso di calore ai modelli di crescita di Gompertz e/o Richard, fare clic su Funzione di crescita. I modelli di crescita verranno visualizzati nella sezione "Cumulativo", anche rispetto ai dati non elaborati nella sezione "Flusso" ( Figura 20 ).</li>
	<li>Per scaricare tutti i parametri calcolati, premere Scarica misure. Selezionare il percorso del file e premere Salva ( Figura 21 ). Il file verrà esportato in un foglio di calcolo per ulteriori calcoli.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. 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Il progetto è stato eseguito in collaborazione con Symcel, sviluppatore della tecnologia calScreener. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La microcalometria isotermica misura l'energia emessa da un campione nel tempo e questo rilascio di energia è il risultato di tutti i processi biologici, fisici e (bio-)chimici. Il flusso di calore misurato può essere sfruttato per valutare o determinare gli effetti antibatterici delle sostanze in quanto consente un monitoraggio continuo in tempo reale dell'attività metabolica.
Per ottenere dati affidabili per l'analisi, è necessario determinare singolarmente le unità di formazione delle colonie di partenza corrette (CFU) per ogni specie o ceppo utilizzato. Nel caso in cui il numero di CFU sia troppo basso, questo porta a una fase di ritardo prolungata in quanto ci vuole più tempo perché il sistema raggiunga una quantità critica di biomassa che produce abbastanza calore da essere rilevato. Nel caso in cui il numero di CFU sia troppo alto, la fase di ritardo sarà molto breve e la quantità di calore prodotta può causare il trasferimento di calore alle celle vicine del sensore (pozzi di riferimento e sperimentali) e causare distorsioni dei termogrammi. Un numero elevato di CFU porterà anche ad un più veloce esaurimento di ossigeno e passare a condizioni anaerobiche. Va inoltre preso in considerazione che durante i primi 30 minuti dell'esperimento, quando il sistema è in equilibrio, la raccolta dei dati non è possibile e la registrazione effettiva degli effetti è ritardata. Inoltre, la determinazione errata della CFU porta alla falsa determinazione del MIC, che in ultima analisi influisce sull'esperimento e sui cambiamentiosservati 25. Un altro punto critico è la corretta determinazione della linea di base. Di solito, il segnale di base viene selezionato durante la fase di ritardo quando il segnale di flusso di calore è zero e idealmente, l'intervallo di tempo per la definizione della linea di base è >30 min. Tuttavia, questo non è sempre possibile in quanto il tempo che i batteri richiedono per raggiungere il limite di rilevamento del segnale di calore differisce tra ceppi e specie. Alcune specie o ceppi richiedono più di 30 minuti per raggiungere il limite di rilevamento del segnale di calore, mentre altri ceppi o specie lo raggiungono entro i primi 30 minuti. In tal caso, è possibile selezionare il segnale di base alla fine dell'esperimento quando tutti i segnali di calore sono scesi a zero e rimangono stabili. In alternativa, possono essere utilizzate linee di base da altri esperimenti con lo stesso ceppo batterico, il che non è tuttavia raccomandato.
Il sistema consente una certa flessibilità in termini di progettazione e ottimizzazione degli esperimenti e risoluzione dei problemi. I volumi utilizzati sono nell'intervallo di 100-300 L quando si utilizzano inserti in plastica e 100-600 L quando si utilizzano tazze in titanio senza gli inserti in plastica. Il volume di lavoro consigliato dal produttore è di 120 L. L'uso di diversi volumi nella creazione di una nuova serie sperimentale, e pur trovando condizioni ottimali per le misurazioni, ha un impatto principalmente su due parametri. Utilizzando volumi più bassi, la quantità di composto di prova richiesto può essere diminuita, che è particolarmente importante per i composti, che sono disponibili solo in piccole quantità. Inoltre, il volume utilizzato influisce direttamente sulla disponibilità di ossigeno durante la misurazione con volumi inferiori che aumentano la quantità di ossigeno disponibile necessaria per la crescita batterica. L'esaurimento dell'ossigeno è uno dei principali fattori che contribuiscono alla durata massima possibile dell'esperimento. È importante sottolineare che è possibile utilizzare supporti solidi, non solo supporti liquidi. Ciò è particolarmente importante per i microrganismi a crescita lenta, in quanto la crescita dell'interfaccia tra fase solida e gassogena consente un migliore accessoall'ossigeno 9.
IMC è un utile strumento analitico per scoprire processi sconosciuti con applicazioni in fisica, chimica e biologia. Il metodo misura lo scambio di calore all'interno di un sistema chiuso e l'analisi dello scambio di calore registrato fornisce informazioni aggiuntive che non possono sempre essere ottenute con metodi standard. Nella ricerca di microbiologia e antibiotici, uno dei maggiori vantaggi di IMC è la sua capacità di distinguere tra cellule vive, morte e persistenti o dormienti, che non è possibile utilizzando i metodi di torbidità standard11. Inoltre, IMC è altamente sensibile e può rilevare l'emissione di calore da appena 104-105 celle9. Un altro vantaggio è che la configurazione sperimentale è semplice e veloce e consente un monitoraggio continuo e in tempo reale con un'interferenza minima o nessuna da parte dell'utente. Inoltre, IMC non è distruttivo, il che consente un'ulteriore analisi dei campioni. L'analisi dei dati consente il disaccoppiamento della formazione della biomassa fino alla fase esponenziale tardiva o precoce e all'attività metabolica in fase stazionaria.
Oltre alle nuove ed entusiasmanti funzionalità dell'applicazione di cui sopra, ci sono anche svantaggi di questo metodo. La limitazione principale è che gli strumenti IMC misurano il calore totale prodotto e rilasciato all'interno di un sistema specifico, che includono anche segnali non specifici. Ciò evidenzia l'importanza della pianificazione sperimentale con controlli appropriati per poter valutare i cambiamenti del segnale di calore misurati registrando il flusso dicalore 9,20.
Nelle nostre mani, IMC è uno strumento importante per studiare gli effetti antibatterici di nuovi prodotti naturali e per determinare le gamme di concentrazione efficaci. Oltre a differenziare gli effetti batteriostatici e batteriricidi, potrebbe essere utilizzato in futuro come parte degli studi di identificazione del bersaglio e della determinazione del MoA. Questo può essere fatto confrontando termogrammi di diverse classi di antibiotici a termogrammi di nuovi composti attivi come mostrato qui. Tuttavia, è ancora necessario verificare se alcuni parametri quantificabili che possono essere estratti dai dati misurati siano sufficienti per tali confronti o se sarà necessario lavorare su algoritmi che dia impronte digitali basate su termogrammi completi. Un'altra possibile applicazione nel campo della ricerca antibiotica è il confronto tra wildtype e cloni resistenti, insieme al sequenziamento dell'intero genoma, che può aiutare a chiarire la modalità di resistenza (MoR) dei nuovi antibatterici. A causa della natura statica del metodo, lo studio dell'efficacia di nuovi agenti sulla formazione di biofilm o su biofilm già stabiliti potrebbe portare a una migliore comprensione del processo biologico e dell'effetto di agenti selezionati sui microbi in diverse fasi di dormienza. IMC registra l'energia totale rilasciata sotto forma di calore rendendolo un metodo adatto per studiare anche gli effetti sub-inibitori di sostanze attive che potrebbero essere accoppiate alla trascridamica. Questo metodo può essere utilizzato anche in ambienti clinici per rilevare la contaminazione dei campioni o per la determinazione di antibiogrammi contribuendo a decidere rapidamente il trattamento definito dei pazienti11.

Lo scopo di questo metodo è quello di applicare la microcalorimetria isotermica (IMC) come analisi della produttività media nella profilazione mode-of-action (MoA) di nuovi composti antibatterici. Questo metodo rivela dati riguardanti l'attività dei composti sulle specie batteriche e fornisce informazioni sulla natura batterica o batteriostatica del composto stesso.
L'aumento della resistenza antimicrobica emergente (AMR) è un problema globale e porta a trattamenti meno efficaci di infezioni comuni con antibiotici noti1. Tuttavia, la ricerca di nuovi composti e farmaci che possono sostituire o lavorare in combinazione con antibiotici noti sono in corso e questo è costruito su diversi approcci. I prodotti naturali sono un attore chiave nelle attuali campagne di scoperta di farmaci e in particolare nella scoperta di farmaci anti-infettivi2. Tuttavia, l'identificazione di nuove strutture di piombo per lo sviluppo di antibiotici è un processo lungo e finanziariamente impegnativo3. Pertanto, le prime fasi della scoperta sono estremamente importanti per filtrare sulla maggior parte degli scaffold più promettenti già in una fase iniziale. I primi passi nella scoperta di farmaci naturali includono l'ottenimento della struttura di un composto, la determinazione dell'attività in vitro insieme al MoA e all'identificazione del bersaglio. La maggior parte dei composti di successo ammissibili per un ulteriore sviluppo dovrebbe mostrare uno spettro favorevole di attività (cioè, attività ad ampio spettro nel caso di antibatterici) e un nuovo MoA con cui la resistenza anti-esistente può essere superata. Le impalcature promettenti vengono quindi in genere vagliate in saggi secondari, che includono la biodisponibilità in vivo, la tossicità e il metabolismo4. Oltre alle preoccupazioni finanziarie, la scoperta di farmaci per prodotti naturali deve affrontare ulteriori sfide riguardanti i costi e le difficoltà tecniche legate all'isolamento e alla purificazione dei composti, che, a loro volta, possono rendere difficile ottenere quantità multi-milligrammo o addirittura grammo nelle prime fasi del processo discoperta 5,6. Pertanto, è della massima importanza nella ricerca sui prodotti naturali essere in grado di eseguire screening primari all'avanguardia con quantità composte minime al fine di prendere una decisione ben informata su ulteriori investimenti per rendere un nuovo prodotto naturale accessibile per lo sviluppo pre-clinico. Con l'uso di IMC per la profilazione antibatterica, la quantità di composto necessario è significativamente ridotta rispetto ai metodi standard. La tecnica fornisce anche informazioni più approfondite riguardanti l'interazione di nuovi farmaci con la comunità microbica7.
IMC è un metodo consolidato per misurare l'energia totale come risultato di tutti i processi biologici, fisici e biochimici e le reazioni in un sistema biologico. Il rilascio di energia batterica è proporzionale alle reazioni metaboliche totali8. All'interno di un sistema chiuso, come il microcalorimetro usato, i livelli di calore possono essere misurati nella gamma di microwatt per studiare la cinetica metabolica dei batteri9,10,11,12. Il calore (energia) che viene rilasciato dai batteri è legato alle funzioni cellulari che sono alla base del loro metabolismo e che non sono necessariamente proporzionali alla biomassa cellulare.
Inizialmente, l'applicabilità della calorimetria isotermica per i test microbiologici è stata limitata a causa della sua bassa produttività e degli elevati volumi di test. Tuttavia, il microcalorimetro usato è unico in quanto combina i vantaggi della calorimetria isotermica con una maggiore produttività e minori requisiti composti, il che lo rende uno strumento prezioso per le applicazioni di scoperta difarmaci 10. Inoltre, lo strumento offre ulteriori vantaggi rispetto ai metodi alternativi per misurare la cinetica della crescita batterica, come il metodo di torbidità standard, che si basa sulla misurazione della densità ottica a 600 nm (OD<600). La misurazione di OD600 si basa sul presupposto che una maggiore densità ottica sia uguale alla crescita microbica, trascurando così la presenza di cellule non vitali. Questo metodo è stato anche criticato in quanto esclude piccole varianti di colonia e le cellule persistenti11. Al contrario, IMC consente l'osservazione in tempo reale di qualsiasi tipo di cellule vitali. Se le cellule sono dormienti, presentano ancora attività metaboliche e possono quindi essere rilevate da IMC, mentre tali fenomeni non sono rilevabili dal metodo di torbidità standard11. Altri vantaggi di IMC includono un tempo di test di suscettibilità antimicrobico più breve, misurare le interazioni farmacologiche in una comunità complessa e metodi di analisi standard senza distruggere il campione7.
La tecnologia IMC è stata implementata in una vasta gamma di studi, che vanno dalla microbiologia alla termogenesi e alla biologia del cancro13,14,15,16,17. Le applicazioni microbiche includono la determinazione delle concentrazioni minime inibitorie (MIC) dei composti contro vari ceppi batterici. Diversi studi sono stati fatti ed è stato concluso che i dati MIC provenienti dalla calorimetria isotermica per la maggior parte delle specie batteriche possono essere ottenuti più velocemente e i risultati sono simili rispetto ad altri metodi (standard) per la determinazione MIC12,18,19. Ulteriori applicazioni di IMC includono l'osservazione dell'interazione di farmaci e la combinazione di trattamenti farmacologici con comunità batteriche complesse come i biofilm11. Uno studio incentrato sulla profilazione moA ha mostrato che il microcalorimetro è in grado di rilevare una differenza nelle cefalosporine di prima e seconda generazione, mentre diversi antibiotici con lo stesso MoA presentano una curva di flusso di calore simile rispettoall'altro 18.
Qui, descriviamo l'uso di IMC per la profilazione MoA di nuovi prodotti naturali utilizzando il nuovo strumento di microcalorimetria isotermica. Il metodo viene utilizzato per determinare concentrazioni antibiotiche efficaci e per descrivere le caratteristiche degli antibiotici in termini di meccanismi batterici o batteriostatici. Il metodo può essere ampiamente implementato nella profilazione MoA dei composti e potrebbe sostituire o almeno integrare i metodi microbiologici standard. Studi futuri includeranno analisi approfondite delle impronte digitali che consentiranno la differenziazione delle classi di antibiotici basate su meccanismi target.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

A causa della minaccia globale di una crescente resistenza agli antimicrobici, sono urgentemente necessari nuovi antibiotici. Indaghiamo sui prodotti naturali di Myxobacteria come fonte innovativa di tali nuovi composti. Un collo di bottiglia nel processo è in genere il chiarimento della loro modalità di azione. Recentemente abbiamo stabilito la microcalorimetria isotermica come parte di una pipeline di profilazione di routine. Questa tecnologia consente di studiare l'effetto dell'esposizione agli antibiotici sulla risposta metabolica batterica totale, compresi i processi che sono disaccoppiati dalla formazione di biomassa. È importante sottolineare che gli effetti batteriostatici e battericidicidi sono facilmente distinguibili senza alcun intervento da parte dell'utente durante le misurazioni. Tuttavia, la microcalorimetria isotermica è un approccio piuttosto nuovo e l'applicazione di questo metodo a diverse specie batteriche richiede di solito una pre-valutazione delle condizioni di misura idonee. Ci sono alcuni termogrammi di riferimento disponibili di alcuni batteri, facilitando notevolmente l'interpretazione dei risultati. Poiché il pool di dati di riferimento è in costante crescita, ci aspettiamo che la metodologia abbia un impatto crescente in futuro e ci aspettiamo che consenta analisi approfondite delle impronte digitali che consentano la differenziazione delle classi antibiotiche.

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Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Il chiarimento della modalità d'azione di un nuovo antibiotico è un compito impegnativo nel processo di scoperta dei farmaci. L'obiettivo del metodo qui descritto è l'applicazione di microcalorimetria isotermica utilizzando calScreener nella profilazione antibatterica per fornire ulteriori informazioni sulle interazioni farmaco-microbo.

Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Comprendere la modalità di azione dei nuovi composti antibatterici è un compito importante ma difficile. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su tali meccanismi ed è facile da implementare. Questa tecnica consente un'osservazione in tempo reale degli effetti antibatterici in modo non invasivo consentendo un'ulteriore analisi del campione.Sebbene praticare con tecniche microbiologiche sia un prerequisito, l'esperimento è facile da eseguire. Prendersi il proprio tempo con l'analisi dei dati è molto importante quando si esegue la microcalorimetria per la prima volta. Inizia usando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri per misurare la densità ottica della coltura notturna.Diluire la coltura ad una 5 per 10 alla 5a colonia formando unità per millilitro di concentrazione media MHB fresca e aggiungere 150 microlitri di cellule a ciascun tubo di antibiotico da 1,5 millilitri alla concentrazione di interesse. Quindi mescolare il composto con le cellule vortice. Per preparare gli inserti, aggiungere 120 microlitri di ogni miscela antibiotica batterica in singoli inserti di plastica nei pozzi appropriati di una piastra da 48 porri e utilizzare una pinzetta per posizionare tutte le fiale di titanio nei supporti.Trasferire delicatamente gli inserti nelle fiale in titanio nella piastra portante e posizionare liberamente i coperchi in titanio su tutte le fiale. Una volta trasferiti tutti gli inserti, posizionare il supporto sull'area designata sulla stazione campione e utilizzare una chiave di coppia impostata su 40 centinewton metri per stringere tutti i coperchi. Nel software di sistema, avviare un nuovo esperimento e ritrarre il braccio di inserimento del campione dallo strumento.Posizionare il portasili sul ponte con la colonna otto rivolta verso l'apertura di inserimento del campione e spingere delicatamente il portasili nello strumento in posizione uno. Attendere 10 minuti prima che il sistema si stabilizzi prima di etichettare i pozzi sperimentali. Quindi, spingere il braccio di inserimento del campione fino a quando il supporto della tazza non è in posizione due.Dopo aver permesso al sistema di stabilizzarsi per 20 minuti, spingere il braccio di inserimento del campione per posizionarlo e ritrarre il braccio di inserimento del campione fino a quando non si trova in posizione di corsa. Evidenziare tutti i pozzi del software e selezionare l'inizio della reazione, quindi eseguire l'esperimento fino a quando le letture delle emissioni di calore sono stabilmente tornate a zero. Al termine dell'analisi, selezionare Interrompi.Il software ti chiederà quindi se sei sicuro. Selezionare sì e salvare l'esperimento per l'analisi dei dati. Quindi inserire completamente il braccio di inserimento del campione nello strumento e innestare i magneti per recuperare il supporto della tazza.Per analizzare i dati, aprire il software e selezionare esperimento aperto. Nella finestra popup selezionare l'esperimento di interesse e fare clic su apri. Fare clic su seleziona tutto e definire la linea di base per normalizzare i dati in ogni posizione.Nella finestra popup selezionare un periodo di tempo superiore a 30 minuti all'interno della fase di ritardo. Dopo la selezione, la linea di base apparirà in verde nel termogramma. Chiudere la finestra della sezione definire la linea di base, quindi fare clic su Salva e chiudere il software.Aprire quindi l'applicazione di analisi calorimetrica SymCel basata sul Web. Fare clic su sfoglia per caricare il file di interesse e selezionare l'esperimento. I parametri metabolici saranno calcolati automaticamente per i 32 campioni.Per adattare i dati del flusso di calore ai modelli Gompertz e/o Richards Growth, fare clic sulla funzione di crescita. I modelli di crescita verranno visualizzati nella sezione cumulativa per il confronto con i dati grezzi nella sezione del flusso. Per scaricare i parametri calcolati, fare clic su misure di download, selezionare il percorso del file e fare clic su Salva.Il file verrà esportato in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Qui vengono visualizzati i termogrammi ottenuti esponendo A.baumannii DSM-30008 alla ciprofloxacina in diluizione seriale. Concentrazioni tra 0,005 e 0,1 micromolare hanno un effetto minimo sulla crescita e sul metabolismo di A.baumannii.Il trattamento delle cellule con ciprofloxacina 0,5 micromolare, tuttavia, porta a uno spostamento significativo della durata della fase di ritardo e a un flusso di calore massimo inferiore. Questi due cambiamenti insieme influenzano il tempo al picco, con un conseguente aumento di circa sei ore. In questa figura, il calore rilasciato cumulativo viene tracciato rispetto al tempo con l'effetto di ogni concentrazione riflessa da un'inclinazione di pendenza.La quantificazione dell'inclinazione del termogramma consente di calcolo del tasso metabolico massimo di A.baumannii in presenza di ciprofloxacina con una concomitante diminuzione del tasso metabolico osservato nelle cellule trattate con ciprofloxacina micromolare 0,5. Il trattamento con rifampicina ha un effetto drammatico sui termogrammi di A.baumannii DSM-30008. Si osserva anche una significativa riduzione delle emissioni di calore correlate con una diminuzione dell'attività metabolica.Si noti l'aumento del time-to-peak per tutte le concentrazioni testate e la diminuzione del tasso metabolico causata dalla diminuzione della pendenza per tutte le concentrazioni che di solito sono attribuite ad un effetto battericida. Per garantire risultati ottimali, utilizzare la pipettazione inversa e prevenire il liquido aggiuntivo ai lati dell'inserto durante il trasferimento del campione, assicurarsi anche che i coperchi siano correttamente chiusi.

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