Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke symcelteamet for fruktbare diskusjoner, og vi vil gjerne anerkjenne den store støtten fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også takke Daniel Kohnhäuser for å ha gitt det naturlige produktet og Stefanie Schmidt for dyktig teknisk støtte.

MERK: Instrumenttemperaturen må stilles inn i henhold til bakterien som brukes minst en dag i forveien for å sikre stabiliteten i systemet. Her kjøres Acinetobacter baumannii DSM30008 prøver ved 30 °C.
1. Kulturforberedelse
<ol><li>Strek ut belastningen som er under etterforskning (her: A. baumannii) på en CASO agar plate og inkuber over natten i en statisk inkubator ved 30 ° C.</li>
	<li>Forbered en kultur over natten ved å vaksinere en enkelt koloni i MHB (Mueller-Hinton buljong) og inkubere på en ristende inkubator ved 180 rpm ved 30 ° C.</li>
</ol>2. Prøve forberedelse
<ol><li>Bruk 1,5 ml rør for å forberede konsentrasjonsområdet til valgt legemiddel eller forbindelse (f.eks. ved å legge til 1,5 μL μL 100x lagerløsninger i DMSO; se trinn 2.3).</li>
	<li>Fortynn nattkulturen i MHB medium.<ol>
<li>Mål den optiske tettheten av overnattingskulturen ved hjelp av et spektrofotometer ved en bølgelengde på 600 nm.</li>
		<li>Fortynn kulturen for å få 5 x 105 kolonidannende enheter (CFU)/ml i friskt MHB-medium. En OD600 av en tilsvarer ca. 5 x 108 CFU/ml (f.eks. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). MERK: Det er viktig å kalibrere konverteringsfaktoren OD600 til CFU/ml for hver enkelt bakteriestamme under de påførte kulteringsforholdene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilsett 150 μL av cellene til testrørene som er utarbeidet i trinn 2.1, noe som sikrer riktig endelig konsentrasjon av testet legemiddel eller forbindelse og riktig endelig cellekonsentrasjon.</li>
	<li>Bland forbindelsen med cellene ved å virvle. MERK: Prøveplaten (se Materialtabell)har seks rader, hver med åtte brønner, totalt 48 brønner; Rad A og Rad F er den termodynamiske referansen. Derfor kan ingen prøver lastes inn i disse brønnene, tilsvarende medier lastes inn i disse brønnene. 32 testprøver kan måles per kjøring, ved hjelp av brønner i rad B-E. Individuell testprøve bør kjøres minst i duplikat (her: alle prøver ble kjørt som triplicates). Vekstkontroller bør inkluderes.</li>
</ol>3. Sett inn forberedelse
<ol><li>Overfør 120 μL fra blandingen tilberedt i trinn 2.4 til plastinnsatsene. MERK: Bruk omvendt pipettering i trinn 3.1 for å hindre at væske sprøyter på sidene av plastinnsatsene, noe som kan føre til interferens med korrekte signalavlesninger.</li>
	<li>Plasser alle hetteglass med titan i holderne (se Materialtabell) med pinsett.</li>
	<li>Overfør innsatser forsiktig inn i titanhettelene i holderplaten.</li>
	<li>Legg titanlokkene løst på alle hetteglass med titan.</li>
</ol>4. Sett inn lasting
<ol><li>Overfør holderen med titankopper til prøvestasjonen og plasser på angitt område.</li>
	<li>Bruk momentnøkkelen, sett til 40 cNm kraft, for å stramme alle lokkene.</li>
</ol>5. Kjøring av prøver
<ol><li>I calView-programvaren starter du et nytt eksperiment (Tilleggsfigur 1).</li>
	<li>Trekk prøveinnsettingsarmen tilbake fra instrumentet.</li>
	<li>Plasser koppholderen på "broen", kolonne 8 vendt mot prøveinnsettingsåpningen og skyv forsiktig koppholderen inn i instrumentet ved den angitte "Posisjon 1". Vent i 10 minutter til systemet stabiliserer seg. Merk de eksperimentelle brønnene.</li>
	<li>Skyv prøveinnsettingsarmen til koppholderen er på den angitte "Posisjon 2". Vent i 20 minutter til systemet stabiliserer seg.</li>
	<li>Skyv prøveinnsettingsarmen inn i "Posisjon 3" og trekk inn prøveinnsettingsarmen til den er i "Løpsposisjon". Fremhev alle brønnene i programvaren, og velg Reaksjonsstart (Tilleggstall 4).</li>
	<li>Kjør eksperimentet til varmeutslippene leses er stabilt tilbake på null. MERK: Pass på at alle brønner oppfører seg likt innenfor disse trinnene. Supplerende figur 5 illustrerer hva som bør observeres hvis brønnene lastes riktig. Hvis lastet feil, gjentar du trinn 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Fjern koppholderen
<ol><li>Velg Stopp ( Tilleggsfigur 6) i programvaren. Programvaren vil da spørre om "du er sikker", velg Ja (Supplerende figur 7) og lagre eksperimentet på en stasjon eller stasjonær pc for dataanalyse (Tilleggs figur 8).</li>
	<li>Sett prøveinnsettingsarmen helt inn i instrumentet og sett magnetene inn for å hente koppholderen.</li>
	<li>Løsne lokkene, fjern innsatsene og legg hetteglassene og lokkene i glassholdere og plasser i 4 timer ved 180 °C etterfulgt av å plassere hetteglassene og lokkene i en desiccator for å sikre at lokk og hetteglass er tørre.</li>
</ol>7. Analysere data
<ol><li>Åpne programvaren (Tilleggsfigur 9), velg Åpent eksperiment i venstre øvre hjørne (Tilleggstall 10). I popup-vinduet velger du eksperimentet av interesse og trykk Åpne (Tilleggsfigur 11). Søknaden vil åpne eksperimentet i standard brønnvisning (Supplerende figur 12).</li>
	<li>Trykk Merk alle eller Ctrl+A (Tilleggsfigur 13).</li>
	<li>Trykk Defineropprinnelig plan , denne parameteren normaliserer dataene i hver posisjon( Tilleggstall 14). I popup-vinduet velger du en tidsperiode på > 30 min plassert i forsinkelsesfasen (varmestrømmen må være lav, mellom null og ti μW; Tilleggstall 15). Etter valg av basislinjetidsperiode vises den valgte grunnlinjen i grønt i termogrammet. Lukk vinduet Definer opprinnelig inndeling.</li>
	<li>Trykk Lagre eller Ctrl+S og lukk programvaren (Tilleggsfigur 16).</li>
	<li>Åpne nettbasert Symcel Calorimetry analyse søknad (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Hvis du vil laste opp filen til calorimetry analyseprogrammet, trykker du Bla gjennom (tilleggsfigur 17), velger eksperimentet og trykker Åpne (tilleggsfigur 18). De metabolske parametrene vil bli beregnet automatisk for de 32 prøvene i webapplikasjonen( Supplerende figur 19).</li>
	<li>For å passe varmeflytdataene til Gompertz og/eller Richards vekstmodeller klikker du Vekstfunksjon. Vekstmodeller som passer vil bli vist i avsnittet "Kumulativ", også sammenlignet med rådata i avsnittet "Flow" (Tilleggstall 20).</li>
	<li>Hvis du vil laste ned alle beregnede parametere, trykker du Last ned tiltak. Velg filplasseringen, og trykk Lagre ( Tilleggstall 21). Filen eksporteres til et regneark for ytterligere beregninger.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Prosjektet ble utført i samarbeid med Symcel, utvikler av calScreener-teknologien. Forfatterne har ingenting å avsløre.

Isotermisk mikrokalorimetri måler energi som slippes ut fra en prøve over tid, og denne energiutgivelsen er et resultat av alle biologiske, fysiske og (bio-)kjemiske prosesser. Den målte varmestrømmen kan utnyttes til å evaluere eller bestemme antibakterielle effekter av stoffer som det muliggjør kontinuerlig sanntidsovervåking av metabolsk aktivitet.
For å få pålitelige data for analyse, må korrekte startkolonidannende enheter (CFU) bestemmes individuelt for hver art eller belastning som brukes. Hvis CFU-tellingen er for lav, fører dette til en lengre forsinkelsesfase, da det tar lengre tid før systemet når en kritisk mengde biomasse som produserer nok varme til å bli oppdaget. Hvis CFU-tellingen er for høy, vil forsinkelsesfasen være svært kort, og mengden varme som produseres kan føre til varmeoverføring til nærliggende sensorceller (referanse og eksperimentelle brønner) og forårsake forvrengninger av termogrammene. Høyt antall CFU vil også føre til en raskere oksygenuttømming og bytte til anaerobe forhold. Det må også tas hensyn til at i løpet av de første 30 minuttene av eksperimentet, når systemet er likevekt, er datainnsamling ikke mulig og selve opptaket av effekter er forsinket. I tillegg fører feil CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som til slutt påvirker eksperimentet og endringene observert25. Et annet kritisk punkt er riktig bestemmelse av grunnlinjen. Vanligvis velges grunnlinjesignalet under forsinkelsesfasen når varmestrømssignalet er null, og ideelt sett er tidsintervallet for baselinedefinisjon > 30 min. Dette er imidlertid ikke alltid mulig da tiden bakteriene krever for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen varierer mellom stammer og arter. Noen arter eller stammer krever mer enn 30 minutter for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen, mens andre stammer eller arter når den i løpet av de første 30 minuttene. I så fall er det mulig å velge grunnlinjesignalet på slutten av eksperimentet når alle varmesignalene har falt tilbake til null og forblir stabile. Alternativt kan baselines fra andre eksperimenter med samme bakterielle belastning brukes, noe som imidlertid ikke anbefales.
Systemet gir en viss fleksibilitet når det gjelder design og optimalisering av eksperimenter og feilsøking. Volumer som brukes er i området 100-300 μL ved bruk av plastinnsatser og 100-600 μL ved bruk av titankopper uten plastinnsatsene. Det anbefalte arbeidsvolumet fra produsenten er 120 μL. Bruken av ulike volumer i å sette opp en ny eksperimentell serie, og samtidig som de finner optimale forhold for målinger, har det hovedsakelig innvirkning på to parametere. Ved hjelp av lavere volumer, mengden av nødvendig test sammensatte kan reduseres, noe som er spesielt viktig for forbindelser, som er tilgjengelig bare i små mengder. I tillegg påvirker det brukte volumet direkte oksygentilgjengeligheten under målingen med lavere volumer som øker mengden tilgjengelig oksygen som kreves for bakteriell vekst. Oksygenuttømming er en av de viktigste faktorene som bidrar til maksimal mulig varighet av eksperimentet. Viktigere er det mulig å bruke faste medier, ikke bare flytende medier. Dette er spesielt viktig for sakte voksende mikroorganismer som vekst på grensesnittet mellom fast og gass fase gir bedre oksygen tilgang9.
IMC er et nyttig analytisk verktøy for å oppdage ukjente prosesser med applikasjoner i fysikk, kjemi og biologi. Metoden måler varmeutvekslingen i et lukket system, og analyse av den registrerte varmeutvekslingen gir ytterligere informasjon som ikke alltid kan oppnås med standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en av de største fordelene med IMC er dens evne til å skille mellom levende, døde og persister eller sovende celler, som ikke er mulig ved hjelp av standard turbiditet metoder11. I tillegg er IMC svært følsom, og det kan oppdage varmeutslipp fra så få som 104-105 celler9. En annen fordel er at det eksperimentelle oppsettet er raskt og enkelt, og det gir mulighet for kontinuerlig sanntidssporing med minimal eller ingen brukerforstyrrelser. Videre er IMC ikke-destruktiv, noe som muliggjør videre analyse av prøver. Dataanalyse gjør det mulig å koble fra biomassedannelse til sen eksponentiell eller tidlig stasjonær fase og metabolsk aktivitet i stillefasen.
Foruten romanen og spennende applikasjonsfunksjoner nevnt ovenfor, er det også ulemper med denne metoden. Den store begrensningen er at IMC-instrumenter måler den totale varmen som produseres og frigjøres i et bestemt system, som også inkluderer ikke-spesifikke signaler. Dette understreker viktigheten av eksperimentell planlegging med egnede kontroller for å kunne vurdere varmesignalendringene som måles ved å registrere varmestrøm9,20.
I våre hender er IMC et viktig verktøy for å studere antibakterielle effekter av nye naturlige produkter og for å bestemme effektive konsentrasjonsområder. Bortsett fra differensiering bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter, kan den brukes i fremtiden som en del av målidentifikasjonsstudier og MoA-bestemmelse. Dette kan gjøres ved å sammenligne termogrammer av ulike antibiotikaklasser med termogrammer av nye aktive forbindelser som vises her. Det må imidlertid fortsatt undersøkes om visse kvantifiserbare parametere som kan hentes ut fra de målte dataene, er tilstrekkelige for slike sammenligninger, eller om det vil være nødvendig å jobbe med algoritmer som gir fingeravtrykk basert på fulle termogrammer. En annen mulig anvendelse innen antibiotikaforskning er sammenligningen av wildtype til resistente kloner, kombinert med hele genomsekvensering, som kan bidra til å belyse resistensmodus (MoR) av nye antibakterielle. På grunn av metodens statiske natur kan undersøkelse av effekt av nye midler på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerte biofilmer føre til bedre forståelse av den biologiske prosessen og effekten av utvalgte midler på mikrober i forskjellige stadier av dvalen. IMC registrerer total energi utgitt i form av varme, noe som gjør det til en passende metode for å undersøke også sub-hemmende effekter av aktive stoffer som kan være koplet til transkripsjonsmikromer. Denne metoden kan også brukes i kliniske omgivelser for å oppdage forurensning av prøver eller for bestemmelse av antibiogrammer som bidrar til å raskt bestemme bestemt behandling av pasientene11.

Målet med denne metoden er å bruke isotermisk mikrokalorimetri (IMC) som en middels gjennomstrømningsanalyse i handlingsmodus (MoA) profilering av nye antibakterielle forbindelser. Denne metoden avslører data om aktiviteten til forbindelser på bakterielle arter og gir informasjon om den bakteriedrepende eller bakteriostatiske naturen til selve forbindelsen.
Fremveksten av fremvoksende antimikrobiell resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger av vanlige infeksjoner med kjente antibiotika1. Imidlertid er søket etter nye forbindelser og legemidler som kan erstatte eller fungere i kombinasjon med kjente antibiotika pågående, og dette er bygget på ulike tilnærminger. Naturlige produkter er en sentral aktør i dagens narkotikaoppdagelseskampanjer og spesielt i anti-infeksiøs narkotikaoppdagelse2. Å identifisere nye blystrukturer for antibiotikautvikling er imidlertid en lang og økonomisk krevende prosess3. Dermed er de tidlige trinnene i oppdagelsen ekstremt viktig for å filtrere på de mest lovende stillasene allerede på et tidlig stadium. Innledende trinn i naturlig produkt narkotika funn inkluderer å skaffe en sammensatt struktur, bestemme aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikasjon. De fleste vellykkede forbindelser som er kvalifisert for videre utvikling bør vise et gunstig spekter av aktivitet (det vil si bredspektret aktivitet i tilfelle av antibakterielle) og en roman MoA som eksisterende AMR kan overvinnes. Lovende stillas blir deretter vanligvis screenet i sekundære analyser, som inkluderer in vivo biotilgjengelighet, toksisitet, og metabolisme4. Foruten de økonomiske bekymringene står naturlig produktstofffunn overfor ytterligere utfordringer om kostnadene og tekniske vanskeligheter knyttet til sammensatt isolasjon og rensing, noe som igjen kan gjøre det vanskelig å få flere milligram eller gram mengder i de tidlige stadiene avoppdagelsesprosessen 5,,6. Derfor er det av største betydning i naturlig produktforskning å kunne utføre toppmoderne primærscreening med minimale sammensatte mengder for å ta en godt informert beslutning om ytterligere investeringer for å gjøre et nytt naturlig produkt tilgjengelig for preklinisk utvikling. Ved bruk av IMC for antibakteriell profilering reduseres mengden sammensatt som trengs betydelig i forhold til standardmetoder. Teknikken gir også mer detaljert informasjon om samspillet mellom nye legemidler med mikrobiell samfunn7.
IMC er en veletablert metode for måling av total energi som følge av alle biologiske, fysiske og biokjemiske prosesser og reaksjoner i et biologisk system. Bakteriell energiutløsning er proporsjonal med de totale metabolske reaksjonene8. Innenfor et lukket system, for eksempel det brukte mikrokalorimeteret, kan varmenivåene måles i mikrowattområdet for å studere metabolsk kinetikk av bakterier9,,10,,11,,12. Varmen (energien) som frigjøres av bakterier er knyttet til cellulære funksjoner som ligger til grunn for stoffskiftet, og som ikke nødvendigvis er proporsjonal med cellulær biomasse.
I utgangspunktet har anvendeligheten av isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser vært begrenset på grunn av lav gjennomstrømning og høye testvolumer. Det brukte mikrokalorimeteret er imidlertid unikt da det kombinerer fordelene med isotermisk kalorimetri med økt gjennomstrømning og lavere sammensatte krav, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for narkotikaoppdagelsesapplikasjoner10. Videre gir instrumentet ytterligere fordeler fremfor alternative metoder for måling av bakteriell vekstkinetikk, for eksempel standard turbiditetsmetode, som er basert på måling av optisk tetthet ved 600 nm (OD<600). Måling av OD600 er basert på antagelsen om at økt optisk tetthet er lik mikrobiell vekst, og dermed forsømmer tilstedeværelsen av ikke-levedyktige celler. Denne metoden har også blitt kritisert da den utelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I motsetning tillater IMC sanntidsobservasjon av alle typer levedyktige celler. Hvis cellene er sovende, viser de fortsatt metabolsk aktivitet, og de kan dermed oppdages av IMC, mens slike fenomener ikke kan oppdages ved standard turbiditetsmetode11. Andre fordeler med IMC inkluderer en kortere antimikrobiell følsomhetstesttid, måling av legemiddelinteraksjoner i et komplekst fellesskap og standard analysemetoder uten å ødeleggeprøven 7.
IMC-teknologien er implementert i et bredt spekter av studier, alt fra mikrobiologi til termotilblivelsen og kreftbiologi13,,14,,15,,16,,17. De mikrobielle applikasjonene inkluderer bestemmelse av minimum hemmende konsentrasjoner (MIC) av forbindelser mot ulike bakterielle stammer. Flere studier er gjort, og det har blitt konkludert med at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for de fleste bakterielle arter kan oppnås raskere og resultatene er like sammenlignet med andre (standard) metoder for MIC bestemmelse12,18,19. Videre anvendelser av IMC inkluderer å observere samspillet mellom narkotika og kombinasjon av narkotikabehandlinger med komplekse bakterielle samfunn som biofilmer11. En studie med fokus på MoA profilering viste at mikrocalorimeter kan oppdage en forskjell i første- og andregenerasjons cefalosporiner, mens forskjellige antibiotika med samme MoA viser en lignende varmestrømningskurve sammenlignet med hverandre18.
Her beskriver vi bruken av IMC for MoA profilering av nye naturlige produkter ved hjelp av det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrumentet. Metoden brukes til å bestemme effektive antibiotikakonsentrasjoner og for å beskrive egenskapene til antibiotika når det gjelder bakteriedrepende eller bakteriostatiske mekanismer. Metoden kan implementeres bredt i MoA profilering av forbindelser, og det kan erstatte eller i det minste utfylle standard mikrobiologiske metoder. Fremtidige studier vil omfatte grundige fingeravtrykksanalyser som vil muliggjøre differensiering av antibiotikaklasser basert på målmekanismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

På grunn av den globale trusselen om økende antimikrobiell resistens, er det presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøker naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til slike nye forbindelser. En flaskehals i prosessen er vanligvis belysningen av deres handlingsmodus. Vi har nylig etablert isotermisk mikroberegning som en del av en rutinemessig profileringsrørledning. Denne teknologien gjør det mulig å undersøke effekten av antibiotikaeksponering på den totale bakterielle metabolske responsen, inkludert prosesser som er koblet fra biomassedannelse. Viktigere, bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter er lett å skilles uten brukermedvirkning under målingene. Imidlertid er isotermisk mikrocalorimetry en ganske ny tilnærming, og bruk av denne metoden på forskjellige bakterielle arter krever vanligvis forhåndsevaluering av egnede måleforhold. Det er noen referanse termogrammer tilgjengelig for visse bakterier, sterkt tilrettelegge tolkning av resultater. Etter hvert som utvalget av referansedata vokser jevnt og trutt, forventer vi at metodikken vil ha økende innvirkning i fremtiden og forventer at den tillater grundige fingeravtrykksanalyser som muliggjør differensiering av antibiotikaklasser.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Oppklaringen av handlingsmåten til et nytt antibiotika er en utfordrende oppgave i narkotikaoppdagelsesprosessen. Målet med metoden som er beskrevet her er anvendelsen av isotermisk mikrocalorimetry ved hjelp av calScreener i antibakteriell profilering for å gi ytterligere innsikt i interaksjoner mellom stoff og mikrobe.

Metabolsk profilering for å bestemme bakteriedrepende eller bakteriostatiske effekter av nye naturlige produkter ved hjelp av isotermisk mikrocalorimetry

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Forstå handlingsmåten til nye antibakterielle forbindelser er en viktig, men vanskelig oppgave. Denne metoden gir innsikt i slike mekanismer, og det er enkelt å implementere. Denne teknikken tillater en sanntidsobservasjon av antibakterielle effekter på en ikke-invasiv måte som muliggjør ytterligere prøveanalyse.Selv om det å praktisere med mikrobiologiske teknikker er en forutsetning, er eksperimentet lett å utføre. Å ta deg tid med dataanalyse er svært viktig når du utfører mikroberegning for første gang. Begynn med å bruke et spektrofotometer ved en bølgelengde på 600 nanometer for å måle den optiske tettheten til nattkulturen.Fortynn kulturen til en 5 ganger 10 til den femte koloniformingsenhetene per milliliter frisk MHB middels konsentrasjon og tilsett 150 mikroliter celler til hver 1,5 milliliter tube antibiotika ved konsentrasjon av interesse. Bland deretter forbindelsen med cellene ved å virvle. For å forberede innsatsene, tilsett 120 mikroliter av hver bakterieantibiotikumblanding i individuelle plastinnsatser i de riktige brønnene på en 48-brønns plate og bruk pinsett for å plassere alle titanhetsnealene i holderne.Overfør innsatsene forsiktig inn i titanhettebreene i holderplaten og legg titanlokkene løst på alle hetteglassene. Når alle innsatsene er overført, plasserer du holderen på det angitte området på prøvestasjonen og bruker en momentnøkkel satt til 40 centinewton meter for å stramme alle lokkene. I systemprogramvaren starter du et nytt eksperiment og trekker prøveinnsettingsarmen tilbake fra instrumentet.Plasser koppholderen på broen med kolonne åtte mot prøveinnsettingsåpningen og skyv forsiktig koppholderen inn i instrumentet i posisjon en. Vent 10 minutter til systemet stabiliserer seg før du merker de eksperimentelle brønnene. Deretter skyver du prøveinnsettingsarmen til koppholderen er i posisjon to.Etter at systemet har stabilisert seg i 20 minutter, skyver du prøveinnsettingsarmen til posisjon tre og trekker inn prøveinnsettingsarmen til den er i løpestilling. Fremhev alle brønnene i programvaren og velg reaksjonsstart, og kjør deretter eksperimentet til varmeutslippene er stabilt tilbake på null. Velg stopp på slutten av analysen.Programvaren vil da spørre om du er sikker. Velg ja, og lagre eksperimentet for dataanalyse. Sett deretter prøveinnsettingsarmen helt inn i instrumentet og sett magnetene inn for å hente koppholderen.Hvis du vil analysere dataene, åpner du programvaren og velger åpent eksperiment. I popup-vinduet velger du eksperimentet av interesse og klikker åpent. Klikk merk alle, og definer opprinnelig plan for å normalisere dataene i hver posisjon.I popup-vinduet velger du en tidsperiode på mer enn 30 minutter i forsinkelsesfasen. Etter valg vil grunnlinjen vises grønt i termogrammet. Lukk vinduet definer opprinnelig plan, og klikk deretter lagre og lukk programvaren.Deretter åpner du den nettbaserte SymCel-kalorimetrianalyseapplikasjonen. Klikk bla gjennom for å laste opp filen av interesse og velg eksperimentet. De metabolske parametrene vil automatisk bli beregnet for de 32 prøvene.Hvis du vil tilpasse varmeflytdataene til Gompertz- og/eller Richards Growth-modellene, klikker du vekstfunksjonen. Vekstmodeller vises i den kumulative delen for sammenligning med rådata i flytdelen. Hvis du vil laste ned de beregnede parameterne, klikker du på Nedlastingsmål, velger filplasseringen og klikker lagre.Filen vil bli eksportert til et regneark for videre analyse. Her vises termogrammene oppnådd ved å utsette A.baumannii DSM-30008 til ciprofloksacin i seriell fortynning. Konsentrasjoner mellom 0,005 og 0,1 mikromos har en minimal effekt på A.baumannii vekst og metabolisme.Behandling av cellene med 0,5 mikromolar ciprofloxacin fører imidlertid til en betydelig endring i forsinkelsesfasens varighet og til en lavere maksimal varmestrøm. Disse to endringene påvirker sammen tiden til toppen, noe som resulterer i en økning på ca. seks timer. I dette tallet plottes den kumulative frigjorte varmen mot tiden med effekten av hver konsentrasjon reflektert av en helling av skråningen.Kvantifisering av termograminline muliggjør beregning av maksimal metabolsk rate av A.baumannii i nærvær av ciprofloxacin med samtidig reduksjon i metabolske rate observert i celler behandlet med 0,5 mikromolar ciprofloxacin. Rifampicin behandling har en dramatisk effekt på termogrammene i A.baumannii DSM-30008. En betydelig reduksjon av varmeutslipp korrelerer med en reduksjon i metabolsk aktivitet observeres også.Legg merke til økningen i tid til topp for alle de testede konsentrasjonene og reduksjonen i metabolsk hastighet forårsaket av reduksjon i helling for alle konsentrasjonene som vanligvis tilskrives en bakteriedrepende effekt. For å sikre optimale resultater, bruk omvendt pipettering og forhindre ekstra væske på sidene av innsatsen når du overfører prøven, og pass også på at lokkene er ordentlig lukket.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktivert Noninvasiv Metabolsk profilering

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantifisering og Size-profilering av Ekstracellulær Blemmer Bruke Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolsk Glycoengineering Sialic syre med N-acyl-endret Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Produksjon av en Nafion-belagt, redusert Grafén oksid/Polyaniline Chemiresistive Sensor til skjermen pH i sanntid under mikrobiell gjæring

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær avklaring av CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjelp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Standard testmetode ASTM D 7998-19 for sammenhengende styrkeutvikling av trelim

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Rask montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av modulær golden gate-kloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Flytende kromatografi kombinert med brytningsindeks eller massespektrometrisk deteksjon for metabolittprofilering i lysatebaserte cellefrie systemer

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...