Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer à equipe da Symcel por discussões frutíferas e gostaríamos de reconhecer o grande apoio de Ganna Oliynyk e Wilhelm Paulander. Também gostaríamos de agradecer a Daniel Kohnhäuser por fornecer o produto natural e Stefanie Schmidt por suporte técnico hábil.

NOTA: A temperatura do instrumento deve ser definida de acordo com a bactéria usada com pelo menos um dia de antecedência para garantir a estabilidade do sistema. Aqui, as amostras de Acinetobacter baumannii DSM30008 são executadas a 30 °C.
1. Preparação para a cultura
<ol><li>Estirpe fora da tensão sob investigação (aqui: A. baumannii) em uma placa DE ágar CASO e incubar durante a noite em uma incubadora estática a 30 °C.</li>
	<li>Prepare uma cultura noturna inoculando uma única colônia em MHB (caldo Mueller-Hinton) e incubar em uma incubadora a 180 rpm a 30 °C.</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>Use tubos de 1,5 mL para preparar a faixa de concentração de droga ou composto selecionado (por exemplo, adicionando 1,5 μL de soluções de estoque de 100x no DMSO; ver o passo 2.3).</li>
	<li>Diluir a cultura da noite para o dia no meio MHB.<ol>
<li>Meça a densidade óptica da cultura da noite para o dia usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nm.</li>
		<li>Diluir a cultura para obter 5 x 105 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL em meio MHB fresco. Um OD600 de um equivale a aproximadamente 5 x 108 UFC/mL (por exemplo, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). NOTA: É importante calibrar o fator de conversão OD600 para CFU/mL para cada cepa bacteriana individual sob as condições de cultivo aplicadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 150 μL das células aos tubos de ensaio preparados na etapa 2.1, garantindo a concentração final correta da droga ou composto testado e corrija a concentração final da célula.</li>
	<li>Misture o composto com as células por vórtice. NOTA: A placa de amostra (ver Tabela de Materiais) possui seis linhas, cada uma contendo oito poços, um total de 48 poços; A linha A e a Linha F são a referência termodinâmica. Portanto, nenhuma amostra pode ser carregada nesses poços, a mídia correspondente é carregada nesses poços. 32 amostras de teste podem ser medidas por corrida, utilizando poços nas linhas B-E. A amostra de ensaio individual deve ser executada no mínimo em duplicata (aqui: todas as amostras foram executadas como triplicados). Os controles de crescimento devem ser incluídos.</li>
</ol>3. Inserir preparação
<ol><li>Transfira 120 μL da mistura preparada na etapa 2.4 para as pastilhas plásticas. NOTA: Use a tubulação reversa na etapa 3.1 para evitar que o líquido borrife nas laterais das pastilhas plásticas, o que pode levar a interferências com leituras corretas de sinal.</li>
	<li>Coloque todos os frascos de titânio nos suportes (ver Tabela de Materiais) com pinças.</li>
	<li>Transfira suavemente as inserções nos frascos de titânio na placa do suporte.</li>
	<li>Coloque livremente tampas de titânio em todos os frascos de titânio.</li>
</ol>4. Inserir carregamento
<ol><li>Transfira o suporte com copos de titânio para a estação de amostra e coloque na área designada.</li>
	<li>Use a chave de torque, fixada em 40 cNm de força, para apertar todas as tampas.</li>
</ol>5. Execução de amostras
<ol><li>No software calView, inicie um novo experimento(Figura Suplementar 1).</li>
	<li>Retraia o braço de inserção da amostra do instrumento.</li>
	<li>Coloque o porta-copos na "ponte", coluna 8 de frente para a abertura da inserção da amostra e empurre suavemente o porta-copos para dentro do instrumento na "Posição 1" designada. Espere 10 minutos para o sistema estabilizar. Rotule os poços experimentais.</li>
	<li>Empurre o braço de inserção da amostra até que o porta-copo esteja na "Posição 2" designada. Espere 20 minutos para o sistema estabilizar.</li>
	<li>Empurre o braço de inserção da amostra para "Posição 3" e retraia o braço de inserção da amostra até que esteja na "posição de execução". Destaque todos os poços do software e selecione Reaction Start (Figura Suplementar 4).</li>
	<li>Execute o experimento até que as leituras de emissão de calor sejam de volta a zero. NOTA: Certifique-se de que todos os poços se comportam de forma semelhante dentro dessas etapas. A Figura Suplementar 5 ilustra o que deve ser observado se os poços estiverem carregados corretamente. Se estiver carregado incorretamente, repita as etapas 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Remova o porta-copos
<ol><li>No software, selecione Stop (Figura Suplementar 6). Em seguida, o software perguntará se "você tem certeza", selecionará Sim (Figura Suplementar 7) e salvará o experimento em uma unidade ou desktop para análise de dados(Figura Suplementar 8).</li>
	<li>Insira completamente o braço de inserção da amostra no instrumento e engaje os ímãs para recuperar o porta-copos.</li>
	<li>Solte as tampas, retire as pastilhas e coloque frascos e tampas em suportes de vidro e coloque por 4 horas a 180 °C seguido de colocar os frascos e tampas em um desiccator para garantir que as tampas e os frascos estejam secos.</li>
</ol>7. Análise de dados
<ol><li>Abra o software(Figura Suplementar 9),selecione Experiência aberta no canto superior esquerdo(Figura Suplementar 10). Na janela pop-up selecione o experimento de interesse e pressione Open (Figura Suplementar 11). O aplicativo abrirá o experimento na exibição de poços padrão(Figura Suplementar 12).</li>
	<li>Pressione Selecionar todos ou Ctrl+A (Figura Suplementar 13).</li>
	<li>Pressione Definir linha de base,este parâmetro normaliza os dados em cada posição (Figura Suplementar 14). Na janela pop-up selecione um período de tempo de >30 min localizado na fase de defasagem (o fluxo de calor deve ser baixo, entre zero e dez μW; Figura Suplementar 15). Após a seleção do período de tempo da linha de base, a linha de base escolhida aparecerá em verde no termograma. Feche a janela Definir a seção de linha de base.</li>
	<li>Pressione Salvar ou Ctrl+S e feche o software(Figura Suplementar 16).</li>
	<li>Aplicativo de análise de calorimetria Symcel baseado na Web (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Para enviar o arquivo para o aplicativo de análise calorimetria, pressione Browse (Figura Suplementar 17),selecione o experimento e pressione Aberto (Figura Suplementar 18). Os parâmetros metabólicos serão calculados automaticamente para as 32 amostras na aplicação web (Figura Suplementar 19).</li>
	<li>Para encaixar os dados de fluxo de calor aos modelos de crescimento da Gompertz e/ou de Richard, clique em Growth Function. Os modelos de crescimento fit serão exibidos na seção "Cumulativo", também comparados aos dados brutos da seção "Fluxo"(Figura Suplementar 20).</li>
	<li>Para baixar todos os parâmetros calculados, pressione Medidas de Download. Selecione o local do arquivo e pressione Salvar (Figura Suplementar 21). O arquivo será exportado para uma planilha para mais cálculos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. 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O projeto foi realizado em colaboração com a Symcel, desenvolvedora da tecnologia calScreener. Os autores não têm nada a revelar.

A microcalorimetria isotérmica mede a energia emitida de um espécime ao longo do tempo e essa liberação de energia é resultado de todos os processos biológicos, físicos e (bio-)químicos. O fluxo de calor medido pode ser explorado para avaliar ou determinar efeitos antibacterianos das substâncias, pois permite o monitoramento contínuo em tempo real da atividade metabólica.
Para obter dados confiáveis para análise, as unidades de formação de colônias (UFC) corretas precisam ser determinadas individualmente para cada espécie ou cepa utilizada. Caso a contagem de UFC seja muito baixa, isso leva a uma fase de defasagem prolongada, pois leva mais tempo para que o sistema atinja uma quantidade crítica de biomassa produzindo calor suficiente para ser detectado. Caso a contagem da UFC seja muito alta, a fase de defasagem será muito curta, e a quantidade de calor produzida pode causar transferência de calor para células sensoriais vizinhas (referência e poços experimentais) e causar distorções dos termogramas. Um alto número de UFC também levará a um esgotamento mais rápido do oxigênio e mudará para condições anaeróbicas. Também deve-se levar em conta que durante os primeiros 30 minutos do experimento, quando o sistema está se equilibrando, a coleta de dados não é possível e o registro real dos efeitos é adiado. Além disso, a determinação incorreta da UFC leva à falsa determinação do MIC, afetando o experimento e as alterações observadas25. Outro ponto crítico é a determinação correta da linha de base. Normalmente, o sinal de linha de base é selecionado durante a fase de defasagem quando o sinal de fluxo de calor é zero e, idealmente, o intervalo de tempo para definição da linha de base é de >30 min. No entanto, isso nem sempre é possível, pois o tempo que a bactéria requer para atingir o limite de detecção de sinal de calor difere entre cepas e espécies. Algumas espécies ou cepas requerem mais de 30 minutos para atingir o limite de detecção de sinal de calor, enquanto outras cepas ou espécies chegam a ela nos primeiros 30 minutos. Nesse caso, é possível selecionar o sinal de linha de base no final do experimento quando todos os sinais de calor caíram para zero e permanecem estáveis. Alternativamente, podem ser utilizadas linhas de base de outros experimentos com a mesma cepa bacteriana, o que, no entanto, não é recomendado.
O sistema permite alguma flexibilidade em termos de design e otimização de experimentos e solução de problemas. Os volumes utilizados estão na faixa de 100-300 μL quando se utiliza de pastilhas plásticas e 100-600 μL ao usar copos de titânio sem as pastilhas plásticas. O volume de trabalho recomendado pelo fabricante é de 120 μL. O uso de diferentes volumes na criação de uma nova série experimental, e ao mesmo tempo em que encontra condições ideais para medições, tem um impacto principalmente em dois parâmetros. Usando volumes mais baixos, a quantidade de composto de teste necessário pode ser diminuída, o que é particularmente importante para os compostos, que estão disponíveis apenas em pequenas quantidades. Além disso, o volume utilizado impacta diretamente a disponibilidade de oxigênio durante a medição com volumes menores aumentando a quantidade de oxigênio disponível necessária para o crescimento bacteriano. O esgotamento do oxigênio é um dos principais fatores que contribuem para a duração máxima possível do experimento. É importante ressaltar que é possível usar mídia sólida, não apenas mídia líquida. Isso é especialmente importante para microrganismos de crescimento lento, pois o crescimento na interface entre a fase sólida e o gás permite um melhor acesso ao oxigênio9.
O IMC é uma ferramenta analítica útil para descobrir processos desconhecidos com aplicações em física, química e biologia. O método mede a troca de calor dentro de um sistema fechado e a análise da troca de calor registrada fornece informações adicionais que nem sempre podem ser obtidas com métodos padrão. Na pesquisa de microbiologia e antibióticos, uma das maiores vantagens da IMC é sua capacidade de distinguir entre células vivas, mortas e pervasas ou dormentes, o que não é possível usando métodos padrão de turbidez11. Além disso, o IMC é altamente sensível e pode detectar emissão de calor de apenas 104-105 células9. Outra vantagem é que a configuração experimental é rápida e fácil, e permite um rastreamento contínuo em tempo real com interferência mínima a nenhuma do usuário. Além disso, o IMC não é destrutivo, o que permite uma análise mais aprofundada das amostras. A análise dos dados permite a dissociação da formação de biomassa até a fase estacionária tardia ou inicial e a atividade metabólica em fase estacionária.
Além dos novos e emocionantes recursos de aplicação mencionados acima, há também desvantagens para este método. A maior limitação é que os instrumentos IMC medem o calor total produzido e liberado dentro de um sistema específico, que também incluem sinais não específicos. Isso destaca a importância do planejamento experimental com controles adequados para poder avaliar as mudanças de sinal de calor que são medidas pelo registro do fluxo de calor9,,20.
Em nossas mãos, a IMC é uma ferramenta importante para estudar efeitos antibacterianos de novos produtos naturais e determinar faixas de concentração eficazes. Além de diferenciar efeitos bacteriostáticos e bactericidas, poderia ser usado no futuro como parte de estudos de identificação de alvos e determinação do MoA. Isso pode ser feito comparando termogramas de diferentes classes de antibióticos com termogramas de novos compostos ativos como mostrado aqui. No entanto, ainda precisa ser investigado se certos parâmetros quantificáveis que podem ser extraídos dos dados medidos são suficientes para tais comparações ou se será necessário trabalhar em algoritmos que dão impressões digitais com base em termogramas completos. Outra possível aplicação no campo da pesquisa de antibióticos é a comparação do tipo selvagem com clones resistentes, juntamente com o sequenciamento do genoma inteiro, que pode ajudar a elucidar o modo de resistência (MoR) de novos antibacterianos. Devido à natureza estática do método, a investigação da eficácia de novos agentes na formação de biofilmes ou em biofilmes já estabelecidos poderia levar a uma melhor compreensão do processo biológico e do efeito dos agentes selecionados sobre micróbios em diferentes estágios de dormência. A IMC registra energia total liberada sob a forma de calor tornando-se um método adequado para investigar também efeitos subibitórios de substâncias ativas que podem ser acoplado à transcriômica. Este método também pode ser usado em ambientes clínicos para detectar contaminação de amostras ou para a determinação de antibiogramas que ajudem a decidir rapidamente sobre o tratamento definitivo dos pacientes11.

O objetivo deste método é aplicar a microcalorimetria isotérmica (IMC) como um ensaio de rendimento médio no perfil do modo de ação (MoA) de novos compostos antibacterianos. Este método revela dados sobre a atividade de compostos em espécies bacterianas e fornece informações sobre a natureza bactericida ou bacteriostática do próprio composto.
O aumento da resistência antimicrobiana emergente (AMR) é um problema global e leva a tratamentos menos eficazes de infecções comuns com antibióticos conhecidos1. No entanto, a busca por novos compostos e medicamentos que possam substituir ou trabalhar em combinação com antibióticos conhecidos está em andamento e isso é construído em diversas abordagens. Os produtos naturais são um ator-chave nas campanhas atuais de descoberta de drogas e particularmente na descoberta de drogas anti-infecciosas2. No entanto, identificar novas estruturas de chumbo para o desenvolvimento de antibióticos é um processo demorado e financeiramente exigente3. Assim, os primeiros passos da descoberta são extremamente importantes para filtrar os andaimes mais promissores já em estágio inicial. As etapas iniciais na descoberta de medicamentos para produtos naturais incluem a obtenção da estrutura de um composto, determinação da atividade in vitro juntamente com o MoA e identificação de alvos. A maioria dos compostos bem-sucedidos elegíveis para o desenvolvimento adicional deve exibir um espectro favorável de atividade (ou seja, atividade de amplo espectro no caso de antibacterianos) e um novo MoA pelo qual a AMR pré-existente pode ser superada. Andaimes promissores são, então, tipicamente examinados em ensaios secundários, que incluem biodisponibilidade in vivo, toxicidade e metabolismo4. Além das preocupações financeiras, a descoberta de medicamentos para produtos naturais enfrenta ainda mais desafios em relação aos custos e dificuldades técnicas relacionadas ao isolamento e purificação compostos, o que, por sua vez, pode dificultar a obtenção de quantidades multiimilíficas ou até mesmo gramas nos estágios iniciais do processo de descoberta5,,6. Portanto, é de extrema importância na pesquisa de produtos naturais poder realizar a triagem primária de última geração com quantidades mínimas de compostos, a fim de tomar uma decisão bem informada sobre novos investimentos para tornar um novo produto natural acessível para o desenvolvimento pré-clínico. Com o uso de IMC para perfil antibacteriano, a quantidade de composto necessário é significativamente reduzida em comparação com os métodos padrão. A técnica também fornece informações mais aprofundadas sobre a interação de novos fármacos com a comunidade microbiana7.
O IMC é um método bem estabelecido para medir a energia total como resultado de todos os processos e reações biológicas, físicas e bioquímicas em um sistema biológico. A liberação de energia bacteriana é proporcional às reações metabólicas totais8. Dentro de um sistema fechado, como o microcalímetro utilizado, os níveis de calor podem ser medidos na faixa de microwatts para estudar a cinética metabólica das bactérias9,,10,,11,,12. O calor (energia) que é liberado por bactérias está ligado a funções celulares que sustentam seu metabolismo e que não são necessariamente proporcionais à biomassa celular.
Inicialmente, a aplicabilidade da calorimetria isotérmica para ensaios microbiológicos foi limitada devido ao seu baixo rendimento e alto volume de teste. No entanto, o microcalímetro usado é único, pois combina as vantagens da calorimetria isotérmica com o aumento da produtividade e exigências compostas mais baixas, o que o torna uma ferramenta valiosa para aplicações de descoberta de drogas10. Além disso, o instrumento oferece mais vantagens sobre métodos alternativos de medição da cinética de crescimento bacteriano, como o método padrão de turbidez, que se baseia na medição da densidade óptica a 600 nm (OD<600). A medição do OD600 baseia-se no pressuposto de que o aumento da densidade óptica é igual ao crescimento microbiano, negligenciando assim a presença de células não viáveis. Este método também tem sido criticado por excluir pequenas variantes de colônias e células persistência11. Em contraste, a IMC permite a observação em tempo real de qualquer tipo de células viáveis. Se as células estão dormentes, elas ainda apresentam atividade metabólica e podem, assim, ser detectadas pelo IMC, enquanto tais fenômenos não são detectáveis pelo método padrão de turbidez11. Outras vantagens da IMC incluem um tempo de teste de suscetibilidade antimicrobiana mais curto, medir interações medicamentosas em uma comunidade complexa e métodos de análise padrão sem destruir a amostra7.
A tecnologia IMC foi implementada em uma ampla gama de estudos, que vão desde microbiologia até termogênese e biologia do câncer13,,14,,15,,16,,17. As aplicações microbianas incluem a determinação de concentrações inibitórias mínimas (MIC) de compostos contra várias cepas bacterianas. Vários estudos foram feitos e concluiu-se que os dados mic da calimemetria isotérmica para a maioria das espécies bacterianas podem ser obtidos mais rapidamente e os resultados são semelhantes em comparação com outros métodos (padrão) para a determinação do MIC12,,18,,19. Outras aplicações da IMC incluem observar a interação de medicamentos e a combinação de tratamentos medicamentosos com comunidades bacterianas complexas, como biofilmes11. Um estudo com foco no perfil do MoA mostrou que o microcalorímetro pode detectar uma diferença nas cefalosporinas de primeira e segunda geração, enquanto diferentes antibióticos com o mesmo MoA exibem uma curva de fluxo de calor semelhante em comparação entresi 18.
Aqui, descrevemos o uso de IMC para perfil de MoA de novos produtos naturais usando o novo instrumento de microcalorimetria isotérmica. O método é usado para determinar concentrações eficazes de antibióticos e para descrever características de antibióticos em termos de mecanismos bacteriáticos ou bacteriostáticos. O método pode ser amplamente implementado no perfil moA de compostos e pode substituir ou pelo menos complementar métodos microbiológicos padrão. Estudos futuros incluirão análises aprofundadas de impressões digitais que permitirão a diferenciação de classes de antibióticos com base em mecanismos-alvo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

Devido à ameaça global de aumento da resistência antimicrobiana, novos antibióticos são urgentemente necessários. Investigamos produtos naturais da Myxobacteria como uma fonte inovadora de tais novos compostos. Um gargalo no processo é tipicamente a elucidação de seu modo de ação. Recentemente estabelecemos microcalorimetria isoteérmica como parte de um oleoduto de perfil de rotina. Esta tecnologia permite investigar o efeito da exposição a antibióticos na resposta metabólica bacteriana total, incluindo processos que são dissociados da formação de biomassa. É importante ressaltar que os efeitos bacteriostáticos e bactericidas são facilmente distinguíveis sem qualquer intervenção do usuário durante as medições. No entanto, a microcalorimetria isotérmica é uma abordagem bastante nova e aplicar este método a diferentes espécies bacterianas geralmente requer pré-avaliação de condições de medição adequadas. Existem alguns termogramas de referência disponíveis de certas bactérias, facilitando muito a interpretação dos resultados. Como o pool de dados de referência está crescendo constantemente, esperamos que a metodologia tenha um impacto crescente no futuro e esperamos que ela permita análises aprofundadas de impressões digitais que permitam a diferenciação das classes de antibióticos.

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Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

A elucidação do modo de ação de um novo antibiótico é uma tarefa desafiadora no processo de descoberta de medicamentos. O objetivo do método descrito aqui é a aplicação de microcalorimetria isoteral usando calScreener em perfil antibacteriano para fornecer informações adicionais sobre interações medicamentoso-micróbios.

Perfil metabólico para determinar efeitos bacteriáticos ou bacteriostáticos de novos produtos naturais usando microcalorimetria isotérmica

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Entender o modo de ação de novos compostos antibacterianos é uma tarefa importante, mas difícil. Este método fornece insights sobre tais mecanismos e é fácil de implementar. Esta técnica permite uma observação em tempo real dos efeitos antibacterianos de forma não invasiva, permitindo uma análise mais aprofundada da amostra.Embora praticar com técnicas microbiológicas seja um pré-requisito, o experimento é fácil de realizar. Tomar seu tempo com a análise de dados é muito importante na realização de microcalorimetria pela primeira vez. Comece usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nanômetros para medir a densidade óptica da cultura da noite para o dia.Diluir a cultura para uma 5 vezes 10 a 5ª colônia formando unidades por mililitro de concentração média mhb fresca e adicionar 150 microliters de células a cada tubo de 1,5 mililitro de antibiótico na concentração de interesse. Em seguida, misture o composto com as células por vórtice. Para preparar as pastilhas, adicione 120 microliters de cada mistura de antibióticos de bactérias em pastilhas plásticas individuais nos poços apropriados de uma placa de 48 poços e use pinças para colocar todos os frascos de titânio nos suportes.Transfira suavemente as pastilhas nos frascos de titânio na placa do suporte e coloque livremente as tampas de titânio em todos os frascos. Quando todas as pastilhas tiverem sido transferidas, coloque o suporte na área designada na estação de amostra e use uma chave de torque fixada em 40 metros centinewton para apertar todas as tampas. No software do sistema, inicie um novo experimento e retraia o braço de inserção da amostra do instrumento.Coloque o porta-copos na ponte com a coluna oito voltada para a abertura da inserção da amostra e empurre suavemente o porta-copos para dentro do instrumento na posição um. Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize antes de rotular os poços experimentais. Em seguida, empurre o braço de inserção da amostra até que o porta-copos esteja na posição dois.Depois de permitir que o sistema se estabilize por 20 minutos, empurre o braço de inserção da amostra para posicionar três e retraia o braço de inserção da amostra até que ele esteja na posição de execução. Destaque todos os poços do software e selecione o início da reação, em seguida, execute o experimento até que as leituras de emissão de calor sejam imediatamente de volta a zero. No final da análise, selecione parar.O software perguntará então se você tem certeza. Selecione sim e salve o experimento para análise de dados. Em seguida, insira o braço de inserção da amostra completamente no instrumento e engaje os ímãs para recuperar o suporte do copo.Para analisar os dados, abra o software e selecione o experimento aberto. Na janela pop-up, selecione o experimento de interesse e clique em abrir. Clique em selecionar todos e definir a linha de base para normalizar os dados em cada posição.Na janela pop-up, selecione um período de tempo superior a 30 minutos dentro da fase de defasagem. Após a seleção, a linha de base aparecerá em verde no termograma. Feche a janela de seção de linha de base definida e clique em salvar e feche o software.Em seguida, abra o aplicativo de análise de calorimetria SymCel baseado na Web. Clique em procurar para carregar o arquivo de interesse e selecione o experimento. Os parâmetros metabólicos serão calculados automaticamente para as 32 amostras.Para encaixar os dados de fluxo de calor nos modelos Gompertz e/ou Richards Growth, clique na função de crescimento. Os modelos de crescimento serão exibidos na seção cumulativa para comparação com os dados brutos na seção de fluxo. Para baixar os parâmetros calculados, clique em medidas de download, selecione o local do arquivo e clique em salvar.O arquivo será exportado para uma planilha para análise posterior. Aqui, são exibidos os termogramas obtidos expondo A.baumannii DSM-30008 à ciprofloxacina em diluição serial. As concentrações entre 0,005 e 0,1 micromolar têm um efeito mínimo no crescimento e metabolismo de A.baumannii.Tratar as células com ciprofloxacina micromolar de 0,5 micromolar, no entanto, leva a uma mudança significativa na duração da fase de defasagem e a um fluxo máximo de calor mais baixo. Essas duas mudanças juntas afetam o tempo de pico, resultando em um aumento de aproximadamente seis horas. Nesta figura, o calor liberado cumulativo é plotado contra o tempo com o efeito de cada concentração refletido por uma inclinação de inclinação.A quantificação da inclinação termograma permite o cálculo da taxa metabólica máxima de A.baumannii na presença de ciprofloxacina com uma diminuição concomitante na taxa metabólica observada em células tratadas com ciprofloxacina micromolar. O tratamento com rifampicina tem um efeito dramático nos termogramas de A.baumannii DSM-30008. Também é observada uma redução significativa da emissão de calor correlacionando-se com uma diminuição da atividade metabólica.Observe o aumento do tempo para o pico para todas as concentrações testadas e a diminuição da taxa metabólica causada pela diminuição da inclinação para todas as concentrações que geralmente são atribuídas a um efeito bactericida. Para garantir os melhores resultados, use a tubulação reversa e evite fluidos adicionais nas laterais da inserção ao transferir a amostra, certifique-se também de que as tampas estejam devidamente fechadas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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