Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить команду Symcel за плодотворные дискуссии, и мы хотели бы отметить большую поддержку со стороны Ганны Олийнык и Вильгельма Пауландера. Мы также хотели бы поблагодарить Даниэля Конхойзера за предоставление натурального продукта и Стефани Шмидт за искусную техническую поддержку.

ПРИМЕЧАНИЕ: Температура прибора должна быть установлена в соответствии с бактерией, используемой по крайней мере за день до начала для обеспечения стабильности системы. Здесь образцы Acinetobacter baumannii DSM30008 проходят при 30 градусах Цельсия.
1. Подготовка к культуре
<ol><li>Streak из штамма под следствием (здесь: A. baumannii) на Агар пластины CASO и инкубировать на ночь в статическом инкубаторе при 30 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Подготовьте ночную культуру, привив одну колонию в MHB (бульон Мюллер-Хинтон) и инкубировать на трясущимся инкубаторе при 180 об/мин при 30 градусах Цельсия.</li>
</ol>2. Пример подготовки
<ol><li>Используйте трубы 1,5 мл для подготовки диапазона концентрации выбранного препарата или соединения (например, путем добавления 1,5 мл 100-х растворов в DMSO; см. шаг 2.3).</li>
	<li>Разбавить ночную культуру в среде MHB.<ol>
<li>Измерьте оптическую плотность ночной культуры с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм.</li>
		<li>Разбавить культуру, чтобы получить 5 х10 5 колоний формирования единиц (CFU)/mL в свежем MHB среды. OD600 одного равен примерно 5 х 108 CFU/mL (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). ПРИМЕЧАНИЕ: Важно откалибровать коэффициент преобразования OD600 в CFU/mL для каждого отдельного бактериального штамма в условиях прикладного культивирования.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Добавьте 150 МКЛ клеток в пробирки, подготовленные в шаге 2.1, обеспечивая правильную окончательную концентрацию тестируемого препарата или соединения и исправляя окончательную концентрацию клеток.</li>
	<li>Смешайте соединение с клетками вихрем. ПРИМЕЧАНИЕ: Образец пластины (см. Таблица материалов) имеет шесть рядов, каждая из которых содержит восемь скважин, в общей сложности 48 скважин; Строка A и строка F являются термодинамической ссылкой. Поэтому в эти скважины нельзя загружать пробы, соответствующие средства массовой информации загружаются в эти скважины. 32 тестовых образца могут быть измерены за пробег, используя скважины в строках B-E. Индивидуальный тестовый образец должен быть запущен как минимум в дубликате (здесь: все образцы были запущены в три раза). Следует включить меры контроля за ростом.</li>
</ol>3. Вставьте препарат
<ol><li>Перенесите 120 МКЛ из смеси, подготовленной в шаге 2.4, в пластиковые вставки. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте обратную трубу в шаге 3.1, чтобы предотвратить распыление жидкости по бокам пластиковых вставок, что может привести к вмешательству в правильное считывание сигнала.</li>
	<li>Поместите все титановые флаконы в держатели (см. Таблицу материалов)с помощью пинцета.</li>
	<li>Аккуратно перенесите вставки в титановые флаконы в пластине держателя.</li>
	<li>Свободно поместите титановые крышки на все титановые флаконы.</li>
</ol>4. Вставка погрузки
<ol><li>Перенесите держатель с титановыми чашками на выборку станции и поместите на специально отведенной территории.</li>
	<li>Используйте гаечный ключ крутящего момента, установленный на 40 cNm силу, чтобы затянуть все крышки.</li>
</ol>5. Запуск образцов
<ol><li>В программном обеспечении calView, начать новый эксперимент (Дополнительный рисунок 1).</li>
	<li>Оттягивать руку вставки образца от инструмента.</li>
	<li>Поместите подготовку чашки на "мост", колонку 8, обращенную к открытию образца вставки, и аккуратно нажмите пододержатель чашки в инструмент на обозначенной "Позиции 1". Подождите 10 минут, пока система стабилизируется. Этикетка экспериментальных скважин.</li>
	<li>Нажмите на руку вставки образца до тех пор, пока пододержатель чашки не будет на обозначенной "Позиции 2". Подождите 20 минут, пока система стабилизируется.</li>
	<li>Нажмите на руку вставки образца в "Позицию 3" и втягивать руку вставки образца, пока она находится в "Бегущем положении". Выделите все скважины в программном обеспечении и выберите Начало реакции (Дополнительный рисунок 4).</li>
	<li>Запустите эксперимент до тех пор, пока тепловые выбросы не будут стабиливными на нуле. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все скважины ведут себя аналогичным образом в рамках этих шагов. Дополнительный рисунок 5 иллюстрирует, что следует соблюдать, если скважины загружены правильно. При неправильной загрузке повторите шаги 5.2-5.4.</li>
</ol>6. Снимите пододержатель чашки
<ol><li>В программном обеспечении выберите Stop (дополнительный рисунок 6). Программное обеспечение будет спросить, если "вы уверены", выберите Да (Дополнительный рисунок 7) и сохранить эксперимент на диске или рабочем столе для анализаданных (Дополнительный рисунок 8).</li>
	<li>Вставьте образец вставки руку полностью в инструмент и заниматься магниты для получения подставки.</li>
	<li>Ослабить крышки, удалить вставки и место флаконы и крышки в стеклянные держатели и место в течение 4 часов при 180 градусов по Цельсию с последующим размещением флаконов и крышек в децикатор для обеспечения крышки и флаконы сухие.</li>
</ol>7. Анализ данных
<ol><li>Откройте программное обеспечение(Дополнительный рисунок 9), выберите Открытый эксперимент в левом верхнем углу(Дополнительный рисунок 10). В всплывающем окне выберите эксперимент интереса и нажмите Open (Дополнительный рисунок 11). Приложение откроет эксперимент в представлении скважин по умолчанию(дополнительный рисунок 12).</li>
	<li>Нажмите Выберите все или Ctrl-A (Дополнительный рисунок 13).</li>
	<li>Нажмите Определить базовыйуровень , этот параметр нормализует данные в каждойпозиции (дополнительный рисунок 14). В всплывающем окне выберите период времени в 30 мин, расположенный в фазе задержки (поток тепла должен быть низким, между нулем и десятью МКВ; Дополнительная цифра 15). После выбора периода времени базовой линии выбранный базовый уровень появится зеленым цветом в термограмме. Закройте окно базовой секции.</li>
	<li>Сохранить пресс или Ctrl-S и закрыть программное обеспечение(дополнительный рисунок 16).</li>
	<li>Открытое веб-приложение для анализа Symcel Calorimetry (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Чтобы загрузить файл в приложение анализа калориметрии, нажмите Просмотр (Дополнительный рисунок 17), выберите эксперимент и нажмите Open (Дополнительный рисунок 18). Метаболические параметры будут рассчитываться автоматически для 32 образцов в веб-приложении(дополнительный рисунок 19).</li>
	<li>Для того, чтобы соответствовать тепловым потокам данных Gompertz и / или ричарда роста модели нажмите Функция роста. Модели роста подходят будут отображаться в разделе "Кумулятивный", также по сравнению с необработанными данными в разделе "Поток"(дополнительный рисунок 20).</li>
	<li>Чтобы загрузить все рассчитанные параметры, нажмите Скачать меры. Выберите местоположение файла и нажмите Сохранить (Дополнительный рисунок 21). Файл будет экспортироваться в электронную таблицу для дальнейших расчетов.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Проект был выполнен в сотрудничестве с Symcel, разработчиком технологии calScreener. Авторов нечего раскрывать.

Изотермальная микрокалориметрия измеряет энергию, выделяемую из образца с течением времени, и этот выброс энергии является результатом всех биологических, физических и (био-) химических процессов. Измеренный тепловой поток может быть использован для оценки или определения антибактериального воздействия веществ, поскольку он позволяет непрерывно контролировать метаболическую активность в режиме реального времени.
Для получения достоверных данных для анализа необходимо определить корректные стартовые единицы формирования колоний (КФУ) индивидуально для каждого используемого вида или штамма. В случае, если количество CFU слишком низко, это приводит к длительной фазе отставания, поскольку система занимает больше времени, чтобы достичь критического количества биомассы, производящей достаточно тепла для обнаружения. В случае, если количество CFU слишком высока, фаза задержки будет очень короткой, а произведенное количество тепла может привести к передаче тепла соседним сенсорным ячейкам (справочным и экспериментальным скважинам) и вызвать искажения термограмм. Большое количество CFU также приведет к более быстрому истощению кислорода и перейти к анаэробных условиях. Следует также учитывать, что в течение первых 30 минут эксперимента, когда система эквилибрирует, сбор данных не представляется возможным, а фактическая запись эффектов задерживается. Кроме того, неправильное определение CFU приводит к ложному определению MIC, в конечном счете, влияющих на эксперимент и изменения,наблюдаемые 25. Другим критическим моментом является правильное определение базовой линии. Как правило, базовый сигнал выбирается во время фазы отставания, когда сигнал теплового потока равна нулю и в идеале, диапазон времени для базового определения составляет 30 мин. Однако это не всегда возможно, так как время, необходимое бактериям для достижения предела обнаружения теплового сигнала, различается между штаммами и видами. Некоторым видам или штаммам требуется более 30 минут, чтобы достичь предела обнаружения теплового сигнала, в то время как другие штаммы или виды достигают его в течение первых 30 минут. В этом случае можно выбрать базовый сигнал в конце эксперимента, когда все тепловые сигналы упали обратно к нулю и остаются стабильными. Кроме того, базовые показатели от других экспериментов с тем же бактериальным штаммом могут быть использованы, который, однако, не рекомендуется.
Система обеспечивает некоторую гибкость в плане проектирования и оптимизации экспериментов и устранения неполадок. Используемые объемы находятся в диапазоне 100-300 йл при использовании пластиковых вставок и 100-600 МКЛ при использовании титановых стаканчиков без пластиковых вставок. Рекомендуемый производителем рабочий объем составляет 120 мл. Использование различных объемов при создании новой экспериментальной серии и при поиске оптимальных условий для измерений оказывает влияние главным образом на два параметра. Используя более низкие объемы, количество требуемого испытательного соединения может быть уменьшено, что особенно важно для соединений, которые доступны только в небольших количествах. Кроме того, используемый объем непосредственно влияет на доступность кислорода во время измерения с более низкими объемами, увеличивая количество доступного кислорода, необходимого для роста бактерий. Истощение кислорода является одним из основных факторов, способствующих максимально возможной продолжительности эксперимента. Важно отметить, что можно использовать твердые средства массовой информации, а не только жидкие средства массовой информации. Это особенно важно для медленно растущих микроорганизмов, так как рост на стыке твердой и газовой фазы обеспечивает лучший доступ к кислороду9.
IMC является полезным аналитическим инструментом для обнаружения неизвестных процессов с приложениями в физике, химии и биологии. Метод измеряет теплообмеся в закрытой системе, а анализ записанного теплообмесяя предоставляет дополнительную информацию, которую не всегда можно получить стандартными методами. В исследованиях микробиологии и антибиотиков, одним из самых больших преимуществ IMC является его способность различать живые, мертвые и упорствующие или спящие клетки, что невозможно с помощью стандартных методовмутности 11. Кроме того, IMC является высокочувствительным и он может обнаружить тепловые выбросы от всего лишь 104-105 клеток 9. Еще одним преимуществом является то, что экспериментальная установка быстро и легко, и это позволяет непрерывное, в режиме реального времени отслеживания с минимальным без вмешательства пользователя. Кроме того, ММК не является деструктивным, что позволяет проводить дальнейший анализ образцов. Анализ данных позволяет отделить образование биомассы до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы и метаболической активности в стационарной фазе.
Помимо новых и интересных функций приложения, упомянутых выше, Есть также недостатки этого метода. Основным ограничением является то, что приборы ММК измеряют общее тепло, производимое и высвобождаемое в рамках конкретной системы, которые также включают неспецифические сигналы. Это подчеркивает важность экспериментального планирования с соответствующими управлениями, чтобы иметь возможность оценить изменения теплового сигнала, которые измеряются путем записитеплового потока 9,20.
В наших руках IMC является важным инструментом для изучения антибактериального воздействия новых натуральных продуктов и определения эффективных диапазонов концентрации. Помимо дифференциации бактериостатических и бактерицидных эффектов, он может быть использован в будущем в рамках целевых исследований идентификации и определения МОА. Это можно сделать, сравнив термограммы различных классов антибиотиков с термограммами новых активных соединений, как показано здесь. Однако еще предстоит иззнать, достаточны ли для таких сопоставлений определенные поддающиеся количественной оценке параметры, которые могут быть извлечены из измеренных данных, или же необходимо будет работать над алгоритмами, дающие отпечатки пальцев на основе полных термограмм. Другим возможным применением в области исследований антибиотиков является сравнение дикого типа с устойчивыми клонами в сочетании с секвенированием всего генома, которое может помочь выяснить режим устойчивости (MOR) новых антибактериальных препаратов. Из-за статического характера метода, исследование эффективности новых агентов либо на биопленку формирования или на уже установленных биопленок может привести к лучшему пониманию биологического процесса и влияние отдельных агентов на микробы на различных стадиях покоя. IMC записывает общую энергию, выпущенную в виде тепла, что делает его подходящим методом для исследования также суб-ингибирующее воздействие активных веществ, которые могут быть соединены с транскриптомикой. Этот метод также может быть использован в клинических условиях для обнаружения загрязнения образцов или для определения антибиограмм, помогающих быстро принять решение о точномлечении пациентов 11.

Цель этого метода заключается в применении изотермальной микрокалориметрии (IMC) в качестве средней пропускной способности анализа в режиме действия (MOA) профилирования новых антибактериальных соединений. Этот метод раскрывает данные о активности соединений на бактериальных видах и предоставляет информацию о бактерицидной или бактериостатической природе самого соединения.
Рост формирующейся устойчивости к противомикробным препаратам (АМР) является глобальной проблемой, и это приводит к менее эффективному лечению распространенных инфекций с известнымиантибиотиками 1. Однако поиск новых соединений и лекарств, которые могут заменить или работать в сочетании с известными антибиотиками, продолжается, и это построено на различных подходах. Натуральные продукты являются ключевым игроком в текущих кампаниях по обнаружению наркотиков и, в частности, в обнаружении противоинфекционыхпрепаратов 2. Тем не менее, выявление новых свинцовой структуры для разработки антибиотиков является длительным и финансово требовательнымпроцессом 3. Таким образом, первые шаги открытия чрезвычайно важны для того, чтобы фильтровать на самых перспективных эшафотах уже на ранней стадии. Первоначальные шаги в открытии природного продукта наркотиков включают получение структуры соединения, определение активности в пробирке вместе с МОА и целевой идентификации. Большинство успешных соединений, имеющих право на дальнейшее развитие, должны отображать благоприятный спектр деятельности (т.е. активность широкого спектра в случае антибактериальных препаратов) и новый МОА, с помощью которого можно преодолеть уже существующие АМР. Перспективные леса, то, как правило, скрининг в вторичных анализов, которые включают в себя в vivo биодоступности, токсичности и метаболизма4. Помимо финансовых проблем, открытие природного продукта наркотиков сталкивается с дальнейшими проблемами, касающимися затрат и технических трудностей, связанных с сложной изоляцией и очисткой, что, в свою очередь, может сделать его трудным для получения нескольких миллиграммов или даже граммов суммы на ранних стадияхпроцесса открытия 5,6. Поэтому крайне важно в исследованиях натуральных продуктов иметь возможность проводить самый современной первичный скрининг с минимальными составными количествами, чтобы принять обоснованное решение о дальнейших инвестициях, чтобы сделать новый натуральный продукт доступным для доклинического развития. С использованием IMC для антибактериального профилирования, количество необходимых соединений значительно уменьшается по сравнению со стандартными методами. Техника также предоставляет более подробную информацию о взаимодействии новых препаратов с микробным сообществом7.
ММК является устоявшимся методом измерения общей энергии в результате всех биологических, физических и биохимических процессов и реакций в биологической системе. Высвобождение бактериальной энергии пропорционально общей метаболическойреакции 8. В закрытой системе, такой как используемый микрокалориметр, уровень тепла может быть измерен в диапазоне микроватт для изучения метаболическойкинетики бактерий 9,,10,,11,,12. Тепло (энергия), которое высвобождается бактериями, связано с клеточными функциями, которые лежат в основе их метаболизма и которые не обязательно пропорциональны клеточной биомассе.
Первоначально применимость изотермальной калорийности для микробиологических анализов была ограничена из-за низкой пропускной способности и высоких объемов испытаний. Тем не менее, используемый микрокалориметр уникален, поскольку он сочетает в себе преимущества изотермальной калорийиметрии с повышенной пропускной способностью и более низкими требованиями соединения, что делает его ценным инструментом для примененияобнаружения наркотиков 10. Кроме того, прибор предоставляет дополнительные преимущества по сравнению с альтернативными методами измерения кинетики роста бактерий, такими как стандартный метод мутности, который основан на измерении оптической плотности на уровне 600 нм (OD'lt;600). Измерение OD600 основано на предположении, что повышенная оптическая плотность равна росту микробов, тем самым пренебрегая наличием нежизнеспособных клеток. Этот метод также был подвергнут критике, поскольку он исключает небольшие варианты колонии и сохраняемыеклетки 11. В отличие от этого, IMC позволяет в режиме реального времени наблюдения любого типа жизнеспособных клеток. Если клетки находятся в состоянии покоя, они по-прежнему проявляют метаболическую активность, и таким образом они могут быть обнаружены IMC, в то время как такие явления не обнаруживаются стандартным методоммутности 11. Другие преимущества IMC включают более короткое время тестирования на противомикробную восприимчивость, измерение взаимодействия с наркотиками в сложном сообществе и стандартные методы анализа без уничтожения образца7.
Технология IMC была внедрена в широком диапазоне исследований, начиная от микробиологии до термогенезаи биологии рака 13,,14,,15,,16,,17. Микробные применения включают определение минимальных ингибирующие концентрации (MIC) соединений против различных бактериальных штаммов. Было проведено несколько исследований, и был сделан вывод о том, что данные МИЦ из изотермальной калорийиметрии для большинства видов бактерий могут быть получены быстрее и результаты аналогичны другим (стандартным) методам определения MIC12,,18,19. Дальнейшее применение IMC включает наблюдение за взаимодействием препаратов и сочетание медикаментозного лечения со сложными бактериальными сообществами, такими какбиопленки 11. Исследование, сосредоточенное на профилировании МОА, показало, что микрокалориметр может обнаружить разницу в цефалоспоринах первого и второго поколения, в то время как различные антибиотики с тем же МО обладают аналогичной кривой теплового потока по сравнению друг сдругом 18.
Здесь мы описываем использование IMC для moA профилирования новых натуральных продуктов с использованием нового изотермального инструмента микрокалориметрии. Метод используется для определения эффективных концентраций антибиотиков и описания характеристик антибиотиков с точки зрения бактерицидных или бактериостатические механизмы. Этот метод может быть широко внедрен в профилировании соединений МОА и может заменить или, по крайней мере, дополнить стандартные микробиологические методы. Будущие исследования будут включать углубленный анализ отпечатков пальцев, который позволит дифференцировать классы антибиотиков на основе целевых механизмов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

В связи с глобальной угрозой повышения устойчивости к противомикробным препаратам срочно необходимы новые антибиотики. Мы исследуем натуральные продукты myxobacteria как инновационный источник таких новых соединений. Одним из узких мест в этом процессе, как правило, является выяснение их способа действия. Недавно мы создали изотермальную микрокалориметрию в рамках обычного профилирования трубопровода. Эта технология позволяет исследовать влияние воздействия антибиотиков на общую бактериальную метаболическую реакцию, включая процессы, которые отделены от образования биомассы. Важно отметить, что бактериостатические и бактерицидные эффекты легко различимы без какого-либо вмешательства пользователя во время измерений. Тем не менее, изотермальная микрокалориметрия является довольно новым подходом, и применение этого метода к различным бактериальным видам обычно требует предварительной оценки подходящих условий измерения. Есть некоторые эталонные термограммы, доступные некоторых бактерий, значительно облегчая интерпретацию результатов. Поскольку пул справочных данных неуклонно растет, мы ожидаем, что методология будет иметь все большее влияние в будущем, и ожидаем, что она позволит продать углубленный анализ отпечатков пальцев, позволяющий дифференцировать классы антибиотиков.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Выяснение способа действия нового антибиотика является сложной задачей в процессе обнаружения наркотиков. Целью метода, описанного здесь, является применение изотермальной микрокалориметрии с использованием calScreener в антибактериальном профилировании для обеспечения дополнительного понимания взаимодействий между наркотиками и микробами.

Метаболическое профилирование для определения бактерицидных или бактериостатические эффекты новых натуральных продуктов с использованием изотермальной микрокалориметрии

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Понимание способа действия новых антибактериальных соединений является важной, но трудной задачей. Этот метод дает представление о таких механизмах, и его легко реализовать. Этот метод позволяет в режиме реального времени наблюдения антибактериальных эффектов в неинвазивной манере позволяет дальнейшего анализа выборки.Хотя практика с микробиологическими методами является необходимым условием, эксперимент легко выполнить. Принимая ваше время с анализом данных очень важно при выполнении микрокалориметрии в первый раз. Начните с использования спектрофотометра на длине волны 600 нанометров для измерения оптической плотности ночной культуры.Разбавить культуру в 5 раз от 10 до 5-й колонии формирования единиц на миллилитр свежей средней концентрации MHB и добавить 150 микролитров клеток на каждую 1,5 миллилитровую трубку антибиотика в концентрации интереса. Затем смешайте соединение с клетками вихрем. Чтобы подготовить вставки, добавьте 120 микролитров каждой бактерии антибиотик смеси в отдельных пластиковых вставок в соответствующих скважин 48-хорошо пластины и использовать пинцет, чтобы поместить все титановые флаконы в держатели.Аккуратно перенесите вставки в титановые флаконы в пластину держателя и свободно поместите титановые крышки на все флаконы. Когда все вставки были переданы, поместите держатель на назначенную область на выборочных станциях и используйте гаечный ключ, установленный на 40 сантиметрах, чтобы затянуть все крышки. В системном программном обеспечении, начать новый эксперимент и отказаться от образца вставки руку из инструмента.Поместите подготовку на мост с колонкой восемь лицом к образцу вставки открытия и осторожно нажмите пододержатель чашки в инструмент в позиции один. Подождите 10 минут, пока система стабилизируется перед маркировкой экспериментальных скважин. Затем нажмите на руку вставки образца, пока пододержатель чашки находится на положении два.После того, как система стабилизируется в течение 20 минут, нажмите на руку вставки образца, чтобы распоставить три и втягивать руку вставки образца, пока она не находится в бегущем положении. Выделите все скважины в программном обеспечении и выберите начало реакции, а затем запустите эксперимент до тех пор, пока тепловые выбросы не будут стабилизироваться на нуле. В конце анализа выберите стоп.Программное обеспечение будет спросить, если вы уверены. Выберите да и сохраните эксперимент для анализа данных. Затем вставьте образец вставки руку полностью в инструмент и заниматься магниты для получения подсюха.Для анализа данных откройте программное обеспечение и выберите открытый эксперимент. В всплывающем окне выберите интерес эксперимента и нажмите кнопку "Открыть". Нажмите выберите все и определите базовый уровень для нормализации данных в каждой позиции.В всплывающем окне выберите период времени более 30 минут в фазе задержки. После выбора базовый уровень в термограмме появится зеленым цветом. Закройте окно базового раздела, затем нажмите сохранить и закрыть программное обеспечение.Затем откройте веб-приложение для анализа калорий SymCel. Нажмите на просмотр, чтобы загрузить файл, представляющий интерес, и выберите эксперимент. Метаболические параметры будут автоматически рассчитаны для 32 образцов.Чтобы соответствовать данным о тепловом потоке в модели Gompertz и/или Richards Growth, нажмите функцию роста. Модели роста будут отображаться в кумулятивном разделе для сравнения с необработанными данными в разделе потока. Чтобы загрузить рассчитанные параметры, щелкните меры загрузки, выберите местоположение файла и нажмите сохранить.Файл будет экспортироваться в электронную таблицу для дальнейшего анализа. Здесь отображаются термограммы, полученные путем разоблачения A.baumannii DSM-30008 для ципрофлоксацина в серийном разбавлении. Концентрации от 0,005 до 0,1 микромолара имеют минимальное влияние на рост и обмен веществ A.baumannii.Лечение клеток 0,5 микромоляного ципрофлоксацина, однако, приводит к значительному сдвигу в продолжительности фазы задержки и к снижению максимального теплового потока. Эти два изменения вместе влияют на время пика, в результате чего увеличение примерно на шесть часов. На этом рисунке кумулятивное высвоеданное тепло построено со временем с эффектом каждой концентрации, отраженной наклоном склона.Количественная оценка наклона термограммы позволяет вычислить максимальную скорость обмена веществ A.baumannii при наличии ципрофлоксацина с сопутствующим снижением скорости обмена веществ, наблюдаемым в клетках, обработанных 0,5 микромоляным ципрофлоксацином. Лечение рифампицином имеет драматическое влияние на термограммы A.baumannii DSM-30008. Также наблюдается значительное снижение тепловых выбросов, коррелирующих со снижением метаболической активности.Обратите внимание на увеличение времени до пика для всех проверенных концентраций и снижение скорости обмена веществ, вызванное уменьшением склона для всех концентраций, которые обычно приписывают бактерицидный эффект. Чтобы обеспечить оптимальные результаты, используйте обратную трубу и предотвратить дополнительную жидкость по бокам вставки при передаче образца, а также убедитесь, что крышки должным образом закрыты.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Улучшенная Визуализация и количественный анализ на наркотики эффекты с помощью Micropatterned Клетки

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Количественное и размер-профилирование внеклеточной везикул с использованием перестраиваемый Резистивный Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Изготовление Nafion покрытием, снижение графена оксид/полианилин Chemiresistive датчик pH монитора в реальном времени во время микробной ферментации

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Стандартный метод испытаний ASTM D 7998-19 для развития прочности на сцепление древесных клеев

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Быстрая сборка многофункциональных конструкций с использованием модульного клонирования Золотых Ворот

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Жидкостная хроматография в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для профилирования метаболитов в бесклеточных системах на основе лизата

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...