Name: metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry
Uploaded: 2020-10-29T13:30:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Yazarlar verimli tartışmalar için Symcel ekibi teşekkür etmek istiyorum ve biz Ganna Oliynyk ve Wilhelm Paulander büyük destek kabul etmek istiyorum. Biz de usta teknik destek için doğal ürün ve Stefanie Schmidt sağlamak için Daniel Kohnhäuser teşekkür etmek istiyorum.

NOT: Cihazın sıcaklığı, sistemin stabilitesini sağlamak için en az bir gün önceden kullanılan bakteriye göre ayarlanmalıdır. Burada Acinetobacter baumannii DSM30008 numuneleri 30 °C'de çalıştırılır.
1. Kültür hazırlama
<ol><li>Bir CASO agar plakaüzerinde araştırma altında zorlanma çizgi (burada: A. baumannii) ve 30 °C statik bir kuluçka gece kuluçka.</li>
	<li>MHB 'de tek bir koloni (Mueller-Hinton suyu) aşılayarak bir gecede kültür hazırlayın ve 30 °C'de 180 rpm'de sallayarak bir kuluçka makinesine inkübatın.</li>
</ol>2. Örnek hazırlama
<ol><li>Seçilen ilacın veya bileşiğin konsantrasyon aralığını hazırlamak için 1,5 mL tüpler kullanın (örneğin, DMSO'da 100x stok çözeltisi 1,5 μL ekleyerek;</li>
	<li>MHB ortamda gece kültürünü seyreltin.<ol>
<li>600 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak gece kültürünün optik yoğunluğunu ölçün.</li>
		<li>Taze MHB ortamda 5 x 105 koloni oluşturan üniteler (CFU)/mL elde etmek için kültürü seyreltin. Bir OD600 yaklaşık 5 x 108 CFU/mL eşittir (örneğin, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii). NOT: Uygulanan culturing koşulları altında her bir bakteri suşu için dönüşüm faktörü OD600 CFU/mL kalibre etmek önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 2.1'de hazırlanan test tüplerine 150 μL'lik hücreleri ekleyerek test edilen ilacın veya bileşiğin doğru son konsantrasyonu ve doğru son hücre konsantrasyonu sağlar.</li>
	<li>Girdap tarafından hücreleri ile bileşik karıştırın. NOT: Örnek plaka (bkz. Malzemeler Tablosu)her biri sekiz kuyu, toplam 48 kuyu içeren altı satırdan olenmiştir; A ve Satır F termodinamik referansvardır. Bu nedenle, hiçbir örnek bu kuyulara yüklenebilir, ilgili ortam bu kuyulara yüklenir. B-E satırlarında kuyular kullanılarak her çalışma başına 32 test örneği ölçülebilir. Tek tek test örneği en az yinelenen olarak çalıştırılmalıdır (burada: tüm örnekler üç kat olarak çalıştırıldı). Büyüme kontrolleri dahil edilmelidir.</li>
</ol>3. Ekleme hazırlığı
<ol><li>Adım 2.4'te hazırlanan karışımdan 120 μL'yi plastik kesici uçlara aktarın. NOT: Plastik kesici uçların kenarlarına sıvı püskürtülmesini önlemek için 3.1 adımda ters pipetleme kullanın, bu da doğru sinyal okumalarıyla girişime yol açabilir.</li>
	<li>Tüm titanyum şişeleri tutucuların içine yerleştirin (bkz.</li>
	<li>Uçları yavaşça tutucu plakadaki titanyum şişelere aktarın.</li>
	<li>Tüm titanyum şişelere titanyum kapakları gevşek bir şekilde yerleştirin.</li>
</ol>4. Ekleme yükleme
<ol><li>Titanyum bardakile tutucuyu numune istasyonuna aktarın ve belirlenen alana yerleştirin.</li>
	<li>Tüm kapakları sıkmak için 40 cNm kuvvetine ayarlanmış tork anahtarını kullanın.</li>
</ol>5. Örneklerin çalıştırıl
<ol><li>calView yazılımında, yeni bir deneme başlatın(Ek Şekil 1).</li>
	<li>Numune ekleme kolunu aletten geri alın.</li>
	<li>Bardak tutucuyu "köprü"ye, örnek ekleme ye bakan 8 sütuna yerleştirin ve bardak tutucuyu belirtilen "Pozisyon 1"de yavaşça aletin içine itin. Sistemin sabitolması için 10 dakika bekleyin. Deneysel kuyuları etiketle.</li>
	<li>Numune ekleme kolunu, bardak tutucu belirlenen "Pozisyon 2"ye gelene kadar itin. Sistemin düzelmesi için 20 dakika bekleyin.</li>
	<li>Numune ekleme kolunu "Pozisyon 3"e doğru itin ve numune ekleme kolunu "Koşu pozisyonuna" gelene kadar geri alın. Yazılımdaki tüm kuyuları vurgulayın ve Reaksiyon Başlat 'ı seçin ( EkŞekil 4).</li>
	<li>Isı emisyonu okunan lar sıfıra inene kadar deneyi çalıştırın. NOT: Tüm kuyuların bu adımlar içinde benzer şekilde olduğundan emin olun. Ek Şekil 5, kuyuların doğru yüklenmesi durumunda nelere dikkat edilmesi gerektiğini göstermektedir. Yanlış yüklenirse, 5.2-5.4 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>6. Bardak tutucuyu çıkarın
<ol><li>Yazılımda Stop (Ek Şekil 6)seçeneğini belirleyin. Yazılım daha sonra "emin misiniz", Evet (Ek Şekil 7)seçin ve denemeyi veri analizi için bir sürücüye veya masaüstüne kaydedin(Ek Şekil 8).</li>
	<li>Numune ekleme kolunu tamamen aletin içine takın ve bardak tutucuyu almak için mıknatısları çalıştırın.</li>
	<li>Kapakları gevşetin, kesici uçları çıkarın ve şişeleri ve kapakları cam tutuculara yerleştirin ve 180 °C'de 4 saat boyunca yerleştirin ve ardından şişeleri ve kapakları kuru olduğundan emin olmak için kurubir kurutucuya yerleştirin.</li>
</ol>7. Verilerin analizi
<ol><li>Yazılımı açın (Ek Şekil 9), sol üst köşede deneyi aç'ı seçin (Ek Şekil 10). Açılır pencerede ilgi deneyini seçin ve Aç tuşuna basın (Ek Şekil 11). Uygulama varsayılan kuyugörünümünde denemeyi açar (Ek Şekil 12).</li>
	<li>Tümünü seçin veya Ctrl+A tuşuna basın (Ek Şekil 13).</li>
	<li>Temel Ii Tanımlatuşuna basın , bu parametre her konumdaki verileri normalleştirir (Ek Şekil 14). Açılır pencerede gecikme fazında bulunan >30 dk'lık bir süre seçin (ısı akışı düşük olmalı, sıfır ile on μW arasında; Ek Şekil 15). Taban çizgisi süresinin seçiminden sonra seçilen taban çizgisi termogramda yeşil olarak görünür. Taban Çizgisi Bölüm Tanımla penceresini kapatın.</li>
	<li>Kaydet veya Ctrl+S tuşuna basın ve yazılımı kapatın(Ek Şekil 16).</li>
	<li>Açık web tabanlı Symcel Kalorimetre analizi uygulaması (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).</li>
	<li>Dosyayı Kalorimetre analiz uygulamasına yüklemek için Gözat (Ek Şekil 17)tuşuna basın, deneyi seçin ve Aç tuşuna basın (Ek Şekil 18). Metabolik parametreler, web uygulamasındaki 32 örnek için otomatik olarak hesaplanacaktır (Ek Şekil 19).</li>
	<li>Isı Akışı verilerini Gompertz'e ve/veya Richard'ın büyüme modellerine sığdırmak için Büyüme Fonksiyonu'nutıklatın. Büyüme modelleri uygun bölümünde görüntülenir "Kümülatif", ayrıca bölümünde ham verilerle karşılaştırıldığında "Akış" (Ek Şekil 20).</li>
	<li>Hesaplanan tüm parametreleri indirmek için İndirme Ölçüleri'nebasın. Dosya konumunu seçin ve Kaydet (Ek Şekil 21)tuşuna basın. Dosya, daha sonraki hesaplamalar için bir elektronik tabloya dışa aktarılacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance</a> (2018)</li><li>Herrmann, J., Abou Fayad, A., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products+from+myxobacteria:+novel+metabolites+and+bioactivities.">Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities.</a> Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).</li><li>Cassar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+in+Drug+Discovery+Toxicology.">Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology.</a> Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).</li><li>Bhusnure, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Target+Screening+and+its+Validation+by+Zebrafish+as+a+Novel+Tool.">Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool.</a> Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).</li><li>Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+Deveopment,+and+Regulation+of+Natural+Products.">Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products.</a> Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).</li><li>Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Nature's+Hits:+Establishment+of+the+Zebrafish+as+a+Model+for+Screening+Antidiabetic+Natural+Products.">Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).</li><li>Antimicrobial Development. Symcel Available from: <a target="_blank" href="https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development">https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development</a> (2019)</li><li>Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Microbial+Energy+Metabolism+Measured+by+Nanocalorimetry+during+Growth+Phase+Transitions.">Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions.</a> Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).</li><li>Braissant, O., Wirz, D., G&#246;pfert, B., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+isothermal+microcalorimetry+to+monitor+microbial+activities.">Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities.</a> FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).</li><li>Braissant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+accurately+detects+bacteria,+tumorous+microtissues,+and+parasitic+worms+in+a+label-free+well-plate+assay.">Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay.</a> Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).</li><li>Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+detects+the+presence+of+persister+cells+in+a+Staphylococcus+aureus+biofilm+after+vancomycin+treatment.">Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).</li><li>Tellapragda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+microcalorimetry+minimal+inhibitory+concentration+testing+in+extensively+drug+resistant+Gram-negative+bacilli+-+A+multicenter+study.">Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study.</a> Clinical Microbiology and Infection. , (2020).</li><li>Abdillahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+VI+Contains+Multiple+Host+Defense+Peptides+with+Potent+In+Vivo+Activity.">Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity.</a> The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).</li><li>Astasov-Frauenhoffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharides+regulate+calcium+flow+in+cariogenic+biofilms.">Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms.</a> PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Gros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Treatment+Response+Assessment+for+Rare+Childhood+Tumors+Using+Microcalorimetry-Exemplified+by+Use+of+Carbonic+Anhydrase+IX+and+Aquaporin+1+Inhibitors.">Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).</li><li>Kriszt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+visualisation+of+thermogenesis+in+stimulated+single-cell+brown+adipocytes.">Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Wads&#246;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-plate+format+isothermal+multi-channel+microcalorimeter+for+monitoring+the+activity+of+living+cells+and+tissues.">A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues.</a> Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).</li><li>von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+micro+calorimetry+-+a+new+method+for+MIC+determinations:+results+for+12+antibiotics+and+reference+strains+of+E.+coli+and+S.+aureus.">Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus.</a> BMC Microbiology. 9 (106), (2009).</li><li>Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Microcalorimetric+Method+for+Determining+Drug+Susceptibility+in+Mycobacterium+Species.">Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).</li><li>Wads&#246;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Microcalorimetry:+Current+problems+and+prospects.">Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).</li><li>LeBel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciprofloxacin:+chemistry,+mechanism+of+action,+resistance,+antimicrobial+spectrum,+pharmacokinetics,+clinical+trials,+and+adverse+reactions.">Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions.</a> Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).</li><li>Chopra, I., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+antibiotics:+mode+of+action,+applications,+molecular+biology,+and+epidemiology+of+bacterial+resistance.">Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).</li><li>Allison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+chloramphenicol.+VII.+Growth+and+multiplication+of+Escherichia+coli+in+the+presence+of+chloramphenicol.">Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol.</a> Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).</li><li>Wehrli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampin:+mechanisms+of+action+and+resistance.">Rifampin: mechanisms of action and resistance.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).</li><li>Hancock, R. E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li></ol>

Proje Symcel, calScreener teknolojisigeliştiricisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi. Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İzotermal mikrokalorimtri bir numuneden yayılan enerjiyi zaman içinde ölçer ve bu enerji salınımı tüm biyolojik, fiziksel ve (biyo-) kimyasal süreçlerin bir sonucudur. Ölçülen ısı akışı, metabolik aktivitenin sürekli gerçek zamanlı izlenmesini sağladığından maddelerin antibakteriyel etkilerini değerlendirmek veya belirlemek için kullanılabilir.
Analiz için güvenilir veri elde etmek için, doğru başlangıç koloni oluşturma birimleri (CFU) kullanılan her tür veya gerginlik için ayrı ayrı belirlenmelidir. CFU sayısının çok düşük olması durumunda, sistemin tespit edilmesi için yeterli ısı üreten kritik miktarda biyokütleye ulaşması daha uzun sürdüğünden, bu durum uzun bir gecikme fazına yol açar. CFU sayısının çok yüksek olması durumunda gecikme fazı çok kısa olacaktır ve üretilen ısı miktarı komşu sensör hücrelerine (referans ve deneysel kuyular) ısı transferine ve termogramların bozulmasına neden olabilir. CFU yüksek sayıda da daha hızlı bir oksijen tükenmesi yol açacaktır ve anaerobik koşullara geçmek. Ayrıca, denemenin ilk 30 dakikası boyunca, sistem dengelendiğinde, veri toplamanın mümkün olmadığı ve efektlerin gerçek kaydının geciktiği de göz önünde bulundurulmalıdır. Buna ek olarak, yanlış CFU tayini yanlış MIC tayini yol açar, sonuçta deney etkileyen ve değişiklikler25gözlenen . Bir diğer kritik nokta da taban çizgisinin doğru belirlenmesidir. Genellikle, ısı akışı sinyali sıfır olduğunda ve ideal olarak, taban çizgisi tanımı için zaman aralığı >30 dk olduğunda, gecikme aşamasında temel sinyal seçilir. Ancak, bakterilerin ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için ihtiyaç duyduğu süre suşlar ve türler arasında farklılık gösterirken, bu her zaman mümkün değildir. Diğer türler veya türler ilk 30 dakika içinde ulaşırken bazı türler veya suşlar ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için 30 dakikadan fazla zaman alar. Bu durumda, tüm ısı sinyalleri sıfıra düştüğünde ve sabit kaldığında deney sonundaki temel sinyali seçmek mümkündür. Alternatif olarak, aynı bakteriyel suşu ile diğer deneylerden taban çizgileri kullanılabilir, ancak tavsiye edilmez.
Sistem, denemelerin ve sorun gidermelerin tasarım ve optimizasyonu açısından bazı esneklikler sağlar. Kullanılan hacimler, plastik kesici uçlar ve 100-600 μL plastik kesici uçlar olmadan titanyum kaplar kullanılırken 100-300 μL aralığındadır. Üretici tarafından önerilen çalışma hacmi 120 μL'dir. Yeni bir deneysel seri kurarken farklı hacimlerin kullanılması ve ölçümler için en uygun koşulların bulunması, esas olarak iki parametre üzerinde bir etkiye sahiptir. Daha düşük hacimler kullanılarak, gerekli test bileşiği miktarı azaltılabilir, bu da özellikle küçük miktarlarda bulunan bileşikler için önemlidir. Buna ek olarak, kullanılan hacim, ölçüm sırasında oksijen kullanılabilirliğini doğrudan etkiler ve daha düşük hacimlerde bakteri büyümesi için gerekli olan mevcut oksijen miktarını artırır. Oksijen tükenmesi, deneyin mümkün olan en uzun süreye katkıda bulunan ana faktörlerden biridir. Daha da önemlisi, sadece sıvı ortam değil, katı ortam da kullanmak mümkündür. Katı ve gaz fazı arasındaki arayüz üzerinde büyüme daha iyi oksijen erişimi sağlar gibi bu özellikle yavaş büyüyen mikroorganizmalar için önemlidir9.
IMC fizik, kimya ve biyoloji uygulamaları ile bilinmeyen süreçleri keşfetmek için yararlı bir analitik araçtır. Yöntem kapalı bir sistem içinde ısı alışverişini ölçer ve kaydedilen ısı değişiminin analizi her zaman standart yöntemlerle elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Mikrobiyoloji ve antibiyotik araştırmalarında, IMC'nin en büyük avantajlarından biri canlı, ölü ve persister veya uykuda hücreler arasında ayrım yeteneğidir, hangi standart bulanıklık yöntemleri kullanılarak mümkün değildir11. Buna ek olarak, IMC son derece hassastır ve 10-105 hücre9gibi az ısı emisyonu algılayabilir. Başka bir avantajı deneysel kurulum hızlı ve kolay olmasıdır, ve hiçbir kullanıcı müdahalesi en az ile sürekli, gerçek zamanlı izleme için izin verir. Ayrıca, IMC örneklerin daha fazla analiz edilmesini sağlayan tahribatsızdır. Veri analizi geç üstel veya erken sabit faz ve sabit fazda metabolik aktivite kadar biyokütle oluşumunun ayrıştırma sağlar.
Yukarıda bahsedilen roman ve heyecan verici uygulama özelliklerinin yanı sıra, bu yöntemin sakıncaları da vardır. En büyük sınırlama, IMC cihazlarının belirli bir sistem içinde üretilen ve serbest bırakılan ve spesifik olmayan sinyalleri de içeren toplam ısıyı ölçmesidir. Bu, ısı akışı9,20kayıt ile ölçülen ısı sinyali değişiklikleri değerlendirmek edebilmek için uygun kontroller ile deneysel planlama önemini vurgulamaktadır.
Elimizde, IMC yeni doğal ürünlerin antibakteriyel etkilerini incelemek ve etkili konsantrasyon aralıklarını belirlemek için önemli bir araçtır. Bakteriyostatik ve bakterisidal etkilerin farklıolması nın yanı sıra, gelecekte hedef tanımlama çalışmaları ve MoA tayini nin bir parçası olarak kullanılabilir. Bu burada görüntülenen yeni aktif bileşiklerin termogramlar farklı antibiyotik sınıfların termogramlar karşılaştırarak yapılabilir. Ancak, ölçülen verilerden çıkarılabilen bazı ölçülebilir parametrelerin bu tür karşılaştırmalar için yeterli olup olmadığı veya tam termogramlara dayalı parmak izi veren algoritmalar üzerinde çalışmak gerekip gerekmediği hala araştırılmalıdır. Antibiyotik araştırma alanında başka bir olası uygulama dirençli klonlar wildtype karşılaştırılması, tüm genom dizilimi ile birleştiğinde, hangi yeni antibakteriyellerin modu-direnç (MoR) açıklığa kavuşturulması yardımcı olabilir. Yöntemin statik doğası nedeniyle, biyofilm oluşumu nda veya halihazırda kurulmuş biyofilmlerde yeni ajanların etkinliğinin araştırılması biyolojik sürecin daha iyi anlaşılmasına ve seçilen ajanların uykunun farklı aşamalarında mikroplar üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. IMC, ısı şeklinde açığa çıkan toplam enerjiyi kaydeder ve transkripsiyonla birleşen aktif maddelerin alt inhibitör etkilerini araştırmak için uygun bir yöntem dir. Bu yöntem aynı zamanda klinik ortamlarda numunelerin kontaminasyonunu tespit etmek veya hastaların kesin tedavisine hızla karar vermeye yardımcı olan antibiyogramların belirlenmesi nde de kullanılabilir11.

Bu yöntemin amacı, yeni antibakteriyel bileşiklerin etki-hareket modu (MoA) profilinde orta iş gücü olarak isothermal mikrokalorimetri (IMC) uygulamaktır. Bu yöntem, bakteriler üzerindeki bileşiklerin aktivitesine ilişkin verileri ortaya çıkarır ve bileşiğin bakterisidal veya bakteriyostatik doğası hakkında bilgi sağlar.
Ortaya çıkan antimikrobiyal direncin yükselişi (AMR) küresel bir sorundur ve bilinen antibiyotikler ile yaygın enfeksiyonların daha az etkili tedavileryol açar1. Ancak, yeni bileşikler ve bilinen antibiyotikler ile birlikte çalışabilir veya birlikte çalışabilir ilaçlar için arama devam etmektedir ve bu çeşitli yaklaşımlar üzerine inşa edilmiştir. Doğal ürünler mevcut ilaç keşif kampanyalarında önemli bir oyuncu ve özellikle anti-enfektif ilaç keşif2. Ancak, antibiyotik gelişimi için yeni kurşun yapıları belirlenmesi uzun ve mali zorlu birsüreçtir 3. Bu nedenle, keşif erken adımları zaten erken bir aşamada en umut verici iskeleler filtre lemek için son derece önemlidir. Doğal ürün ilaç keşfinde ilk adımlar bir bileşiğin yapısını elde etmek, MoA ile birlikte in vitro aktiviteyi belirlemek ve hedef tanımlamayı içerir. Daha fazla gelişmeye uygun olan en başarılı bileşikler, uygun bir aktivite spektrumu (yani, antibakteriyeller durumunda geniş spektrumlu aktivite) ve önceden var olan AMR'nin üstesinden gelinebileceği yeni bir MoA göstermelidir. Umut verici iskeleler sonra genellikle ikincil tahliller taranır, hangi in vivo biyoyararlanım dahil, toksisite, ve metabolizma4. Mali endişelerin yanı sıra, doğal ürün ilaç keşif maliyetleri ve bileşik izolasyon ve arıtma ile ilgili teknik zorluklar ile ilgili daha fazla zorluklarla karşı karşıya, hangi, sırayla, zor keşif sürecinin erken aşamalarında multi-miligram veya hatta gram miktarları elde etmek için yapabilirsiniz5,6. Bu nedenle, yeni bir doğal ürünü klinik öncesi gelişim için erişilebilir hale getirmek için daha fazla yatırım hakkında iyi bilgilendirilmiş bir karar almak için en az bileşik miktarlarda en son teknolojiürünü birincil tarama yapabilmek doğal ürün araştırmalarında son derece önemlidir. Antibakteriyel profilleme için IMC kullanımı ile, gerekli bileşik miktarı önemli ölçüde standart yöntemlere göre azalır. Bu teknik aynı zamanda yeni ilaçların mikrobiyal topluluk7ile etkileşimi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlar.
IMC, biyolojik sistemdeki tüm biyolojik, fiziksel ve biyokimyasal süreçler ve reaksiyonlar sonucunda toplam enerjiyi ölçmek için kurulmuş bir yöntemdir. Bakteriyel enerji salınımı toplam metabolik reaksiyonlar ile orantılıdır8. Kullanılan mikrocalorimetre gibi kapalı bir sistem içinde, ısı düzeyleri bakterilerin metabolik kinetik incelemek için mikrowatt aralığında ölçülebilir9,10,11,12. Bakteriler tarafından salınan ısı (enerji) metabolizmalarının altında yatan ve hücresel biyokütle ile orantılı olmayan hücresel fonksiyonlarla bağlantılıdır.
Başlangıçta, mikrobiyolojik tahliller için isothermal kalorimetre uygulanabilirliği düşük iş hacmi ve yüksek test hacimleri nedeniyle sınırlı olmuştur. Ancak, kullanılan mikrocalorimetre artan iş gücü ve daha düşük bileşik gereksinimleri ile izomal kalorimetre avantajlarını birleştirir gibi benzersizdir, hangi ilaç keşif uygulamaları için değerli bir araç yapar10. Ayrıca, cihaz 600 nm optik yoğunluğuölçümü dayalı standart bulanıklık yöntemi gibi bakteri büyüme kinetik ölçmek için alternatif yöntemler üzerinde daha fazla avantaj sağlar (OD<600). OD600'ün ölçülmesi, artan optik yoğunluğun mikrobiyal büyümeye eşit olduğu varsayımına dayanır ve böylece canlı olmayan hücrelerin varlığını ihmal eder. Bu yöntem, küçük koloni varyantlarını ve persister hücreleri hariç olduğu için de eleştirilmiştir11. Buna karşılık, IMC canlı hücrelerin her türlü gerçek zamanlı gözlem sağlar. Hücreler hareketsiz ise, hala metabolik aktivite sergilerler ve böylece IMC tarafından tespit edilebilirler, oysa bu tür fenomenler standart bulanıklık yöntemi11ile saptanamaz. IMC'nin diğer avantajları arasında daha kısa bir antimikrobiyal duyarlılık test süresi, karmaşık bir topluluktaki ilaç etkileşimlerinin ölçülmesi ve standart analiz yöntemleri nin örnek7'yiyok etmeden yer alması yer almaktadır.
IMC teknolojisi mikrobiyolojitermogenez ve kanser biyolojisi13,14,,15,16,17arasında değişen çalışmalar geniş bir yelpazede uygulanmıştır.17 Mikrobiyal uygulamalar çeşitli bakteriyel suşlara karşı bileşiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIC) belirlenmesi içerir. Çeşitli çalışmalar yapılmıştır ve bakteri türlerinin çoğunluğu için izopekmal kalorimetre MIC veri daha hızlı elde edilebilir ve sonuçlar MIC tayini için diğer (standart) yöntemlere göre benzer olduğu sonucuna varılmıştır12,18,19. IMC'nin diğer uygulamaları arasında ilaçların etkileşiminin ve ilaç tedavilerinin biyofilm11gibi karmaşık bakteri topluluklarıyla birleştirilmesinin gözlemleni yer almaktadır. MoA profilleme odaklanan bir çalışma da mikrocalorimetre birinci ve ikinci nesil sefalosporinler bir fark tespit edebilirsiniz gösterdi, aynı MoA ile farklı antibiyotikler birbirlerine göre benzer bir ısı akış eğrisi sergilerken18.
Burada, yeni izomal mikrocalorimetri aleti kullanarak yeni doğal ürünlerin MoA profilleme için IMC kullanımını açıklar. Bu yöntem etkili antibiyotik konsantrasyonlarını belirlemek ve bakterilerin veya bakteriyostatik mekanizmalar açısından antibiyotiklerin özelliklerini tanımlamak için kullanılır. Yöntem moa bileşikprofilleme de yaygın olarak uygulanabilir ve standart mikrobiyolojik yöntemlerin yerini alabilir veya en azından tamamlayıcı olabilir. Gelecekteki çalışmalar, hedef mekanizmalara dayalı antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayacak derinlemesine parmak izi analizlerini içerecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii </td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>DSM-30008</td>
			<td>reference strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calPlate</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220093</td>
			<td>48-well plate for titanium cups to be inserted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calScreener</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1200001</td>
			<td>isothermal microcalorimetry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calView software</td>
			<td>Symcel</td>
			<td></td>
			<td>collection and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calWell</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1901004</td>
			<td>micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASO agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X937.1</td>
			<td>isolation and cultivation of microorganisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>1.5 mL cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculation loops</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>10 &#181;L inoculation loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL eppendorf safe-lock tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10428671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tubes</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride (HCL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10316380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70192</td>
			<td>liquid medium for antibiotic susceptibility studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton Broth II cation adjusted media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90922</td>
			<td>Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>LABSOLUTE</td>
			<td>7696404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 2 - 20 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000 L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 2 - 200 &#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>732028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0972</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>10 mL Nunc serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>6135 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filters</td>
			<td>Minisart</td>
			<td>16534----------K</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size sterile filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>NORM-JECT</td>
			<td>22778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium cups</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220089</td>
			<td>inserted in 48-well titanium calPlate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium lids</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1220091</td>
			<td>screwed and tightend to the titanium cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethroprim</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Symcel</td>
			<td>1900602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic profiling to determine bactericidal or bacteriostatic effects of new natural products using isothermal microcalorimetry

Artan antimikrobiyal direnç küresel tehdit nedeniyle, yeni antibiyotikler acilen ihtiyaç vardır. Bu tür yeni bileşiklerin yenilikçi bir kaynağı olarak Myxobacteria doğal ürünleri araştırmak. İşlemdeki bir darboğaz genellikle eylem tarzlarının açıklanmasıdır. Biz son zamanlarda rutin bir profilleme boru hattının bir parçası olarak izomal mikrocalorimetri kurdu. Bu teknoloji toplam bakteriyel metabolik yanıt antibiyotik maruziyetinin etkisini araştırmak için izin verir, biyokütle oluşumundan ayrılmış süreçler de dahil olmak üzere. Daha da önemlisi, bakteriyostatik ve bakterisidal etkiler ölçümler sırasında herhangi bir kullanıcı müdahalesi olmadan kolayca ayırt edilebilir. Ancak, izotermal mikrocalorimetri oldukça yeni bir yaklaşımdır ve bu yöntemi farklı bakteri türlerine uygulamak genellikle uygun ölçüm koşullarının ön değerlendirmesini gerektirir. Bazı bakterilerin bazı referans termogramlar mevcut, büyük ölçüde sonuçların yorumlanmasını kolaylaştıran vardır. Referans veri havuzu sürekli olarak büyürken, metodolojinin gelecekte artan bir etkiye sahip olmasını ve antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayan derinlemesine parmak izi analizlerine olanak sağlamasını bekliyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry at JoVE.com

Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry

Yeni bir antibiyotik modu-of-action açıklaması ilaç bulma sürecinde zor bir görevdir. Burada açıklanan yöntemin amacı ilaç-mikrop etkileşimleri içine ek fikir sağlamak için antibakteriyel profilleme calScreener kullanarak isothermal mikrocalorimetri uygulamasıdır.

Isothermal Mikrocalorimetri Kullanarak Yeni Doğal Ürünlerin Bakterisidal veya Bakteriyostatik Etkilerini Belirlemek Için Metabolik Profilleme

Due to the global threat of rising antimicrobial resistance, novel antibiotics are urgently needed. We investigate natural products from Myxobacteria as ...

Yeni antibakteriyel bileşiklerin eylem modunu anlamak önemli ama zor bir iştir. Bu yöntem, bu tür mekanizmalar hakkında öngörüler sağlar ve uygulanması kolaydır. Bu teknik, antibakteriyel etkilerin noninvaziv bir şekilde gerçek zamanlı olarak gözlemlemesini sağlayarak daha fazla numune analizi sağlar.Mikrobiyolojik tekniklerle pratik yapmak bir ön koşul olsa da, deneyi gerçekleştirmek kolaydır. Mikrokalorilimikrometreyi ilk kez yaparken veri analizi ile zaman ayırın çok önemlidir. Gece kültürünün optik yoğunluğunu ölçmek için 600 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak başlayın.Kültürü 5 kez 10 ila 5. Sonra girdap tarafından hücreleri ile bileşik karıştırın. Kesici uçları hazırlamak için, her bakteri antibiyotik karışımının 120 mikrolitresini 48 kuyulu bir plakanın uygun kuyularına tek tek plastik kesici uçlara ekleyin ve titanyum şişelerin tümlerini tutuculara yerleştirmek için cımbız kullanın.Uçları yavaşça tutucu plakadaki titanyum şişelere aktarın ve titanyum kapakları tüm şişelerin üzerine gevşek bir şekilde yerleştirin. Tüm kesici uçlar aktarıldığında, tutucuyu numune istasyonunun üzerinde belirlenen alana yerleştirin ve tüm kapakları sıkmak için 40 santimetreye ayarlanmış bir tork anahtarı kullanın. Sistem yazılımında, yeni bir deneme başlatın ve numune ekleme kolunu cihazdan geri alın.Numune ekleme açılışına bakan sekiz numaralı sütunla bardak tutucuyu köprüye yerleştirin ve bardak tutucuyu birinci pozisyonda yavaşça aletin içine itin. Deneysel kuyuları etiketlemeden önce sistemin stabilize olması için 10 dakika bekleyin. Daha sonra, numune ekleme kolunu, bardak tutucu ikinci pozisyonda olana kadar itin.Sistemin 20 dakika stabilize olmasına izin vererek, numune ekleme kolunu üç pozisyona itin ve numune ekleme kolunu çalışan konuma gelene kadar geri çekin. Yazılımdaki tüm kuyuları vurgulayın ve reaksiyon başlangıcını seçin, ardından ısı emisyonu okunan lar sıfıra inene kadar denemeyi çalıştırın. Çözümlemenin sonunda dur'u seçin.Yazılım daha sonra emin olup olmadığını soracaktır. Evet'i seçin ve denemeyi veri analizi için kaydedin. Daha sonra numune ekleme kolunu tamamen aletin içine takın ve bardak tutucuyu almak için mıknatısları çalıştırın.Verileri çözümlemek için yazılımı açın ve açık denemeyi seçin. Açılan pencerede, ilgi alanı denemesini seçin ve aç'ı tıklatın. Her konumdaki verileri normalleştirmek için tümünü seçin ve taban çizgisini tanımlayın.Açılır pencerede, gecikme aşamasında 30 dakikadan uzun bir süre seçin. Seçimden sonra, anaçizgi termogramda yeşil olarak görünür. Temel bölüm penceresini tanımla, ardından kaydet'i tıklatın ve yazılımı kapatın.Ardından, web tabanlı SymCel kalorimetre analizi uygulamasını açın. İlgi çekici dosyayı yüklemek ve denemeyi seçmek için göz atın'ı tıklatın. Metabolik parametreler 32 örnek için otomatik olarak hesaplanacaktır.Isı akışı verilerini Gompertz ve/veya Richards Growth modellerine sığdırmak için büyüme işlevini tıklatın. Büyüme modelleri, akış bölümündeki ham verilerle karşılaştırma küçlükk bölümünde görüntülenir. Hesaplanan parametreleri indirmek için indirme ölçülerini tıklatın, dosya konumunu seçin ve kaydet'i tıklatın.Dosya daha fazla analiz için bir elektronik tabloya dışa aktarılır. Burada A.baumannii DSM-30008'in seri seyreltmede siprofloksasin'e maruz bırakılarak elde edilen termogramlar görüntülenir. 0.005 ve 0.1 mikromolar arasındaki konsantrasyonlar A.baumannii büyüme ve metabolizma üzerinde minimal etkiye sahiptir.0.5 mikromolar siprofloksasin ile hücrelerin tedavisinde, ancak, gecikme faz süresi önemli bir kayma ve daha düşük bir maksimum ısı akışı yol açar. Bu iki değişiklik birlikte zirveye kadar olan zamanı etkiler ve yaklaşık altı saatlik bir artışa neden olabilir. Bu şekilde, kümülatif serbest ısı eğim eğimi ile yansıyan her konsantrasyonetkisi ile zamana karşı çizilir.Termogram eğiminin nicelleştirilmesi, 0.5 mikromolar siprofloksasin ile tedavi edilen hücrelerde gözlenen metabolik hızda eşlik eden bir azalma ile siprofloksasin varlığında A.baumannii maksimum metabolik hızının hesaplanmasına olanak sağlar. Rifampisin tedavisi A.baumannii DSM-30008 termogramları üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir. Metabolik aktivitede azalma ile ilişkili ısı emisyonu önemli bir azalma da görülmektedir.Test edilen tüm konsantrasyonlar için zirveye kadar zaman artışı ve genellikle bakterisidal etkiye atfedilen tüm konsantrasyonlar için eğim azalması nedeniyle metabolik hızında azalma dikkat edin. En iyi sonuçları elde etmek için ters pipetleme kullanın ve numuneyi aktarırken kesicinin yanlarında ek sıvı oluşmasını önleyin, ayrıca kapakların düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Nafion kaplı imalatı, mikrobiyal fermantasyon sırasında gerçek zamanlı monitör pH grafen oksit/Polyaniline Chemiresistive sensör azaltılmış

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Ahşap Yapıştırıcıların Yapışkan Mukavemet Gelişimi için Standart Test Yöntemi ASTM D 7998-19

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...