Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة جوليا فاين على أفكارها ومناقشتها أثناء عملية إنشاء البروتوكول ، وكذلك الدكتورة كاسوندرا فيرنييه على تعليقاتها المفيدة طوال التحرير. ساهمت هذه المواد في مشاريع دعمتها جزئيا مؤسسة أبحاث الأغذية والزراعة ، بموجب 549025 معرف المنحة.

1. خيار استخراج النحل الجماعي 1: الإزالة الذاتية لليرقات
<ol><li>قفص ملكة نحل العسل على إطار لانغستروث فارغ وممتد وأعادها إلى مستعمرتها. اسمح للملكة بوضع البيض على هذا الإطار لمدة 24 ساعة.<ol>
<li>تحقق من الإطار بعد 24 ساعة للتأكد من أن معظم خلايا المشط تحتوي على بيض تم وضعه حديثا. اعتمادا على الملكة...

لقد أوجزنا هنا طرقا تفصل كل خطوة من خطوات تضخيم الفيروس وعملية تحضير مخزون التلقيح ، بما في ذلك جمع اليرقات وانتشار الفيروس واستخراجه وتركيزه ، بالإضافة إلى العلاج الفيروسي في شكل تجارب تغذية الأقفاص. وتسمح هذه الطرق بإنتاج جزيئات فيروسية شبه نقية (الشكل 4)، يمكن قياس فعال?...

يلعب نحل العسل (Apis mellifera) دورا حاسما في المشهد الزراعي العالمي الحديث ولكنه يعاني حاليا من مزيج من الضغوطات الحيوية وغير الحيوية ، بما في ذلك التعرض لمبيدات الآفات والأعلاف الفقيرة والطفيليات ومسببات الأمراض 1,2. واحدة من أهم مسببات الأمراض المثيرة للقلق هي الفيروسات ، وكثير منها ينتقل بواسطة آخر من الضغوطات الرئيسية لنحل العسل ، سوس الفاروا الطفيلي (Varroa destructor). يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة من الآثار السلبية في نحل العسل بما في ذلك انخفاض بقاء الحضنة ، وعيوب النمو ، والشلل الذي يمكن أن يؤدي إلى انهيار الخلية الكلي قبل وبعد فترات الشتاء3،4،5. على الرغم من وجود تقدم واعد في تطوير التقنيات المستخدمة لمكافحة عدوى الفيروس6،7،8،9 ، إلا أن الديناميكيات التي تنتشر بها العديد من الفيروسات وتنتشر وتتفاعل داخل نحلة العسل أو المستعمرة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد 5,10 . إن فهم البيولوجيا الأساسية لنحل العسل وتفاعلات الفيروسات وعلاقاتها مع العوامل البيئية الأخرى أمر بالغ الأهمية لتطوير تقنيات فعالة لإدارة الفيروسات.
ومع ذلك ، فإن دراسة التفاعلات بين نحل العسل وفيروسه تشكل تحديات مع العديد من العوامل المعروفة وغير المعروفة التي تعقد العملية. وتشمل هذه التفاعلات مع النظام الغذائي11،12 ، والتعرض لمبيدات الآفات13 ، والخلفية الوراثية للنحل14،15. حتى عند التركيز على عدوى الفيروس وحدها ، فإن المضاعفات شائعة لأن مجموعات نحل العسل ، سواء المدارة أو البرية ، لديها دائما درجة معينة من عدوى الفيروس الخلفية ، على الرغم من أنها غالبا ما تكون دون إظهار أعراض حادة16,17 ، وآثار العدوى المشتركة للفيروس ليست مفهومة جيدا 18. وقد جعل هذا من الصعب فصل دراسة آثار فيروس نحل العسل.
استخدمت العديد من دراسات فيروس نحل العسل عدوى الفيروسات الظرفية للبحث عن التفاعلات مع الضغوطات الأخرى ، مع ملاحظة كيفية تغير العدوى الخلفية مع العلاجات الأخرى12،19،20،21. وفي حين أن هذا النهج كان ناجحا في تحديد الآثار الهامة، وخاصة اكتشاف كيفية تأثير مبيدات الآفات أو العلاجات الغذائية على مستويات الفيروس وتكراره، فإن التلقيح بعلاج الفيروس بمحتوى وتركيز معروفين أمر بالغ الأهمية للاختبار التجريبي لديناميات عدوى الفيروس. ومع ذلك ، فإن فصل العلاج التجريبي عن العدوى الخلفية يمكن أن يشكل أيضا تحديات. في الدراسات الميدانية ، قام الباحثون بالتمييز بين سلالات فيروس الجناح المشوه (DWV) لتقديم أدلة على انتقال الفيروس من نحل العسل إلى النحل الطنان22 ، ولكن استخدام هذا النهج سيكون صعبا داخل نحل العسل وحده. تعد الحيوانات المستنسخة المعدية للفيروسات أداة قوية ، ليس فقط لتتبع العدوى 23،24،25 ولكن لدراسات علم الوراثة العكسية لفيروسات نحل العسل ولأبحاث التفاعل بين الفيروس والمضيف 26،27،28. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، لا تزال هناك حاجة إلى استنساخ المعدية لتحقيق دورة العدوى داخل الخلايا لإنتاج الجسيمات. ويفضل استخدام هذه الجسيمات كلقاح للعلاجات التجريبية لأن عدويتها أعلى من الحمض النووي الريبي الفيروسي العاري والتلقيح بالجينوم المغلف يحاكي العدوى الطبيعية.
كما أن إنتاج لقاح فيروس نحل العسل النقي غير الملوث (سلالات الفيروسات من النوع البري أو تلك المشتقة من الحيوانات المستنسخة المعدية) يشكل أيضا تحديات. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الصعوبات في الحصول على خط خلايا نحل عسل موثوق به ومتكرر باستمرار وخال من الفيروسات لإنتاج فيروسات سلالة نقية29,30. وفي حين تم إنتاج بعض خطوط الخلايا، لا تزال هذه النظم غير كاملة؛ ومع ذلك ، هناك أمل في إمكانية إنتاج خط خلوي قابل للحياة29 ، مما سيسمح بتحكم أدق في إنتاج الفيروس والتحقيق فيه. وإلى أن يصبح هذا الخط متاحا على نطاق واسع، ستستمر معظم بروتوكولات إنتاج الفيروسات في الاعتماد على استخدام 18،31،32،33،34 في إنتاج وتنقية الفيروسات في الجسم الحي. تتضمن هذه الأساليب تحديد وتنقية جزيئات الفيروس ذات الأهمية (أو إنتاج استنساخ معدي) واستخدامها لإصابة نحل العسل ، عادة ما تكون شرانق. يتم حقن الشرانق مع الفيروس المستهدف ثم التضحية بها ، ويتم استخراج المزيد من الجسيمات وتنقيتها. ومع ذلك ، نظرا لعدم خلو النحل من الفيروسات في البداية ، فهناك دائما درجة معينة من التلوث من آثار الفيروسات الأخرى في أي مركز من هذا القبيل ، وبالتالي ، يجب توخي الحذر الشديد في اختيار النحل مع احتمال منخفض للإصابة بالعدوى في الخلفية. علاوة على ذلك ، فإن طرق إزالة الشرانق من خلايا المشط لاستخدامها في هذه البروتوكولات33 كثيفة العمالة للغاية ويمكن أن تحفز الإجهاد في النحل ، مما يحد من الإنتاج بهذه الوسائل 18,32. هنا ، نبلغ عن طريقة بديلة تسمح بإزالة اليرقات على نطاق واسع مع القليل من العمالة والضغط الميكانيكي الأقل على النحل.
بمجرد الحصول على الشرانق وحقنها بلقاح الفيروس المبتدئ ، يجب تحضينها لتوفير وقت الفيروس للتكاثر. في وقت لاحق ، يمكن معالجة جزيئات الفيروس المنتجة في شكل قابل للاستخدام لإصابة النحل التجريبي. هناك العديد من الطرق البسيطة لتحقيق ذلك ، بما في ذلك استخدام متجانس خام 35,36 أو الهيموليمف الناتج عن النحل المصاب بالفيروسات كمصدر للعدوى37. هذه الطرق فعالة ولكنها تواجه فرصة أكبر لإدخال متغيرات غير معروفة من الركيزة الخلفية (على سبيل المثال ، عوامل أخرى في متجانسات النحل الميت). بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن تركيز الجسيمات إذا كانت التجربة تتطلب إعطاء جرعة كبيرة ومعروفة من الفيروس في فترة زمنية قصيرة. لذلك ، من أجل تحكم أفضل ، من الأفضل استخدام طرق تسمح بمستوى معين من تنقية وتركيز جزيئات الفيروس. وعموما، ستؤدي سلسلة من خطوات هطول الأمطار والطرد المركزي إلى إزالة جميع مواد الفيروس غير المستهدفة المحتملة تقريبا33.
بعد إنتاج هذا اللقاح المركز ، من المفيد تحديد كمية العيار الفيروسي (qPCR) وتوصيفه بالفحوصات الحيوية في الجسم الحي لاختبار قدرته على البقاء وقدرته على التسبب في الوفيات ، وكذلك للتأكد من أنه يتم الحصول على عيار الفيروس المتزايد بعد الإصابة. يمكن تحقيق ذلك من خلال تجارب الحقن (إما في الشرانق أو البالغين) أو تجارب التغذية (في اليرقات أو البالغين). في حين أن كل هذه الأساليب ممكنة ، فإن التغذية لمجموعات من النحل البالغ في قفص غالبا ما تكون الأسرع والأبسط. تستخدم طريقة فحص القفص أيضا على نطاق واسع لاختبار مختلف العلاجات الأخرى على النحل بما في ذلك سمية المبيداتالحشرية 38 ، وتطور المبيض39 ، والتأثير الغذائي على السلوك40,41 ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أساسا جيدا للتجارب التي تربط عدوى الفيروس بعوامل أخرى 42.
هنا نصف طريقة موثوقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس شبه النقية وعالية التخصيب دون استخدام جهاز طرد مركزي فائق التكلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة الشرانق التي تقلل من العمالة والضغط الميكانيكي على النحل واختبار حيوي عالي الإنتاجية قابل للتكرار للغاية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. من خلال التحكم بإحكام في نقاء اللقاح الفيروسي ، يستطيع الباحثون تقليل التباين في الاستجابة الفيروسية لنحل العسل مقارنة بطرق التلقيح الفيروسي الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكن للفحص البيولوجي فحص التأثيرات الفيروسية على مستوى مجموعات صغيرة باستخدام وحدات تجريبية قابلة للتكرار للغاية قبل التوسع إلى إعدادات واقعية ميدانية ، والتي هي أكثر كثافة في العمالة لإدارتها. في تركيبة ، توفر هاتان الطريقتان الأدوات اللازمة للدراسات التي يمكن أن تساعد في تحسين فهمنا العام للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

يتمتع نحل العسل بأهمية بيئية وزراعية كبيرة في جميع أنحاء العالم ولكنه يخضع أيضا لمجموعة متنوعة من الضغوط التي تؤثر سلبا على صحة النحل ، بما في ذلك التعرض لمسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة واسعة من الآثار المدمرة ويمكن أن يكون من الصعب دراستها في كثير من الأحيان بسبب عوامل متعددة تجعل من الصعب فصل آثار العلاجات التجريبية عن عدوى الخلفية الموجودة مسبقا. نقدم هنا طريقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس إلى جانب فحص حيوي عالي الإنتاجية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. وبسبب النقص الحالي في خط خلايا نحل العسل المستمر والخالي من الفيروسات، يتم تضخيم الجسيمات الفيروسية في الجسم الحي باستخدام شرانق نحل العسل، والتي يتم استخراجها من الخلية بكميات كبيرة باستخدام منهجية الحد الأدنى من الإجهاد. يمكن بعد ذلك استخدام جزيئات الفيروس هذه في المقايسات الحيوية لأقفاص نحل العسل لاختبار صلاحية التلقيح ، بالإضافة إلى العديد من ديناميكيات عدوى الفيروس الأخرى ، بما في ذلك التفاعلات مع التغذية والمبيدات الحشرية ومسببات الأمراض الأخرى. ومن المزايا الرئيسية لاستخدام هذه الجسيمات أنها تقلل إلى حد كبير من فرص إدخال متغيرات غير معروفة في التجارب اللاحقة عند مقارنتها بالبدائل الحالية، مثل العدوى عن طريق هيموليمفاوية النحل المصابة أو المتجانسة، على الرغم من أنه لا يزال ينبغي توخي الحذر عند الحصول على النحل، لتقليل تلوث الفيروسات في الخلفية. واختبارات الأقفاص ليست بديلا عن التجارب الميدانية الواقعية واسعة النطاق التي تختبر آثار عدوى الفيروس على مستوى المستعمرة، ولكنها تعمل بدلا من ذلك كطريقة لإنشاء استجابات فيروسية أساسية يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة لدراسة الأبعاد المختلفة للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس العسل.

إن اتباع البروتوكولات بنجاح (الشكل 1) لحقن العذراء والاستخراج الفيروسي يجب أن ينتج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس. ومع ذلك ، فإن أخذ العينات وحقن الشرانق التي يتم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المستعمرات في نقاط زمنية متعددة يزيد من فرص الحصول على الفيروس المستهدف بتلوث منخفض. إ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

هنا نصف بروتوكولين: الأول لنشر واستخراج وتنقية وقياس كميات كبيرة من جزيئات فيروس نحل العسل غير المغلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة شرانق نحل العسل وثانيا لاختبار آثار العدوى الفيروسية باستخدام فحص حيوي قفص عالي التكرار وعالي الإنتاجية.

تحضير اللقاح المخصب بالفيروسات للعدوى الفموية لنحل العسل (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

بروتوكولات العدوى عن طريق الفم من اليرقات Lepidopteran مع الفيروسة العصوية

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

استخراج مكون من EPP EMG السطحي

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

إعداد خلايا البنكرياس عنيبية لغرض التصوير الكالسيوم، القياسات إصابة الخلية، وعدوى الفيروسة الغدانية

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

طرق لمقارنة العناصر الغذائية في خبز النحل الذي أدلى به Africanized والعسل النحل الأوروبي والتأثيرات على التتر البروتين الدملمف

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

تشريح ومراقبة من عسل النحل ظهري سفينة لدراسات وظيفة القلب

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

رصد آثار مستعمرة-مستوى التعرض لمبيدات الآفات المقاسة على نحل العسل

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

شفوي من العدوى البكتيرية وإلقاء في melanogaster المورفولوجية

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

تقييم المخاطر الكيميائية الزراعية لملكات نحل العسل المتزاوج

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

فحص كيميائي محسن للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...