Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Julia Fine for hendes ideer og diskussion under protokoloprettelsesprocessen samt Dr. Cassondra Vernier for hendes nyttige kommentarer under hele redigeringen. Disse materialer bidrog til projekter, der delvist blev støttet af Fonden for Fødevare- og Jordbrugsforskning under bevilling ID 549025.

1. Mulighed for ekstraktion af masselever 1: selvfjernelse af larver
<ol><li>Bur en honningbidronning på en tom, langtrukken Langstroth-ramme og returner hende til sin koloni. Lad dronningen lægge æg på denne ramme i 24 timer.<ol>
<li>Kontroller rammen efter 24 timer for at sikre, at de fleste kamceller indeholder nylagte æg. Afhængigt af dronningen og kolonien lægges æg undertiden ikke særlig godt i de første 24 timer. Hvis dette sker, skal du tillade yderligere 24 timer og justere tiden efter behov.</li>
	<...

Her har vi skitseret metoder, der beskriver hvert trin i virusforstærknings- og inokulumbestandsforberedelsesprocessen, herunder indsamling af larver og virusformering, ekstraktion og koncentration samt viral behandling i form af burfodringsforsøg. Disse metoder gør det muligt at producere halvrene viruspartikler (figur 4), hvis effektivitet konsekvent kan kvantificeres ved dosis-respons-dødelighedstest for vira, der er dødelige for voksne (figur 5). Efter ...

Honningbier (Apis mellifera) spiller en afgørende rolle i det moderne globale landbrugslandskab, men lider i øjeblikket af en kombination af biotiske og abiotiske stressfaktorer, herunder pesticideksponering, dårligt foder, parasitter og patogener 1,2. Et af de vigtigste patogener, der er bekymrende, er vira, hvoraf mange er vektoreret af en anden af de største honningbi-stressorer, den parasitære Varroa-mide (Varroa destructor). Disse vira kan forårsage en række negative virkninger hos honningbier, herunder nedsat yngleoverlevelse, udviklingsfejl og lammelse, der kan føre til total bikubekollaps både før og efter overvintringsperioder 3,4,5. Selvom der har været lovende fremskridt i udviklingen af teknologier, der bruges til at bekæmpe virusinfektion 6,7,8,9, er den dynamik, hvormed mange vira formerer sig, spredes og interagerer inden for en honningbi eller koloni, stadig dårligt forstået 5,10 . Forståelse af den grundlæggende biologi af honningbi- og virusinteraktioner og deres forhold til andre miljøfaktorer er afgørende for at udvikle effektive virushåndteringsteknikker.
At studere honningbi-virus-interaktioner udgør imidlertid udfordringer med mange kendte og ukendte faktorer, der komplicerer processen. Disse omfatter interaktioner med kost11,12, pesticideksponering13 og bigenetisk baggrund14,15. Selv når man fokuserer på virusinfektion alene, er komplikationer almindelige, fordi honningbipopulationer, både styrede og vilde, altid har en vis grad af baggrundsvirusinfektion, men ofte uden at manifestere akutte symptomer16,17, og virkningerne af virusseksfektion er ikke godt forstået18. Dette har gjort undersøgelsen af honningbiviruseffekter vanskelige at adskille.
Mange honningbivirusundersøgelser har brugt omstændelige virusinfektioner til at lede efter interaktioner med andre stressfaktorer og observere, hvordan baggrundsinfektioner ændres med andre behandlinger 12,19,20,21. Mens denne tilgang har haft succes med at identificere vigtige effekter, især at opdage, hvordan pesticid- eller diætbehandlinger påvirker virusniveauer og replikation, er podning med en virusbehandling af kendt indhold og koncentration afgørende for eksperimentel test af virusinfektionsdynamik. Alligevel kan det også give udfordringer at adskille eksperimentel behandling fra baggrundsinfektion. I feltstudier har forskere differentieret stammer af deformeret vingevirus (DWV) for at give bevis for virusoverførsel fra honningbier til humlebier22, men det ville være vanskeligt at bruge denne tilgang inden for honningbier alene. Virusinfektiøse kloner er et kraftfuldt værktøj, ikke kun til sporing af infektion 23,24,25, men til omvendte genetikundersøgelser af honningbivirus og til virus-værtsinteraktionsforskning 26,27,28. I de fleste tilfælde kræves der dog stadig infektiøse kloner for at opfylde infektionscyklussen inde i celler for at producere partikler. Sådanne partikler foretrækkes som inokuler til eksperimentelle behandlinger, fordi deres smitsomhed er højere end det nøgne virale RNA, og podning med indkapslede genomer efterligner en naturlig infektion.
Produktionen af ren, uforurenet honningbivirus inocula (vildtypevirusstammer eller dem, der stammer fra infektiøse kloner) giver også udfordringer. Disse skyldes primært vanskelighederne med at opnå en pålidelig, kontinuerligt replikerende, virusfri honningbicellelinje til fremstilling af rene stammevirus29,30. Mens nogle cellelinjer er blevet produceret, forbliver disse systemer ufuldkomne; Der er stadig håb om, at der kan produceres en levedygtig cellelinje29, hvilket ville give mulighed for finere kontrol med virusproduktion og -undersøgelse. Indtil en sådan linje bliver bredt tilgængelig, vil de fleste virusproduktionsprotokoller fortsat være afhængige af brugen af in vivo-virusproduktion og -rensning 18,31,32,33,34. Disse tilgange indebærer at identificere og rense viruspartikler af interesse (eller producere en infektiøs klon) og bruge dem til at inficere honningbier, normalt som pupper. Pupperne injiceres med målvirussen og ofres derefter, og yderligere partikler ekstraheres og renses. Men fordi ingen bier er virusfrie til at begynde med, er der altid en vis grad af forurening fra spor af andre vira i et sådant koncentrat, og derfor skal der udvises stor omhu ved valg af bier med lav sandsynlighed for baggrundsinfektioner. Endvidere er metoder til fjernelse af pupperne fra kamcellerne til brug i disse protokoller33 meget arbejdskrævende og kan fremkalde stress hos bierne, hvilket begrænser produktionen på disse måder18,32. Her rapporterer vi om en alternativ metode, der giver mulighed for storstilet fjernelse af larver med lidt arbejde og mindre mekanisk belastning på bierne.
Når pupper er opnået og injiceret med startvirusinokulumet, skal de inkuberes for at give virussen tid til at replikere. Efterfølgende kan producerede viruspartikler forarbejdes til en form, der kan bruges til at inficere eksperimentelle bier. Der er flere enkle metoder til at opnå dette, herunder anvendelse af et råhomogenat 35,36 eller hæmolymfe genereret fra viralt inficerede bier som en kilde til infektion37. Disse metoder er effektive, men løber ind i en større chance for at indføre ukendte variabler fra baggrundssubstratet (f.eks. Andre faktorer i de døde bi-homogenater). Derudover er det ønskeligt at koncentrere partiklerne, hvis et forsøg kræver at give en stor, kendt dosis af en virus på kort tid. For bedre kontrol foretrækkes det derfor at anvende metoder, der muliggør en vis grad af oprensning og koncentration af viruspartiklerne. Generelt vil en række nedbørs- og centrifugeringstrin resultere i fjernelse af næsten alt muligt virusmateriale uden for målet33.
Efter fremstilling af dette koncentrerede inokulum er det gavnligt at kvantificere de virale titre (qPCR) og karakterisere det med in vivo-bioassays for at teste dets levedygtighed og evne til at forårsage dødelighed samt at bekræfte, at øgede virustitre opnås efter infektion. Dette kan opnås gennem injektionsforsøg (enten i pupper eller voksne) eller fodringsforsøg (i larver eller voksne). Mens alle disse tilgange er mulige, er fodring til grupper af voksne bier i et bur ofte den hurtigste og enkleste. Buranalysemetoden anvendes også i vid udstrækning til at teste forskellige andre behandlinger på bier, herunder pesticidtoksicitet38, æggestokudvikling39 og ernæringsmæssig indflydelse på adfærd40,41 og kan derfor danne et godt grundlag for eksperimenter, der forbinder virusinfektion med andre faktorer42.
Her beskriver vi en pålidelig metode til fremstilling af store mængder halvrene, højt berigede viruspartikler uden brug af en dyr ultracentrifuge, herunder en metode til fjernelse af pupper, der reducerer arbejdskraft og mekanisk belastning på bierne og et meget repeterbart bioassay med høj gennemstrømning til test af virusinfektion og effekter. Ved nøje at kontrollere renheden af den virale inokuula er efterforskere i stand til at reducere variationen i honningbi viral respons i forhold til andre virale podningsmetoder. Desuden kan bioassay screene for virale effekter på et lille gruppeniveau ved hjælp af meget repeterbare eksperimentelle enheder, før de skaleres til feltrealistiske indstillinger, hvilket er langt mere arbejdskrævende at administrere. I kombination giver disse to metoder de nødvendige værktøjer til undersøgelser, der kan bidrage til at forbedre vores overordnede forståelse af honningbi-virus fysiologiske interaktioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honningbier er af stor økologisk og landbrugsmæssig betydning rundt om i verden, men er også udsat for en række pres, der påvirker biernes sundhed negativt, herunder eksponering for virale patogener. Sådanne vira kan forårsage en lang række ødelæggende virkninger og kan ofte være udfordrende at studere på grund af flere faktorer, der gør det vanskeligt at adskille virkningerne af eksperimentelle behandlinger fra allerede eksisterende baggrundsinfektion. Her præsenterer vi en metode til masseproduktion af store mængder viruspartikler sammen med et bioassay med høj gennemstrømning for at teste virusinfektion og effekter. Nødvendiggjort af den nuværende mangel på en kontinuerlig, virusfri honningbicellelinje forstærkes virale partikler in vivo ved hjælp af honningbipupper, der ekstraheres fra bikuben i store mængder ved hjælp af minimalt stressende metode. Disse viruspartikler kan derefter anvendes i honningbibur bioassays til at teste inokula levedygtighed, samt forskellige andre virusinfektionsdynamikker, herunder interaktioner med ernæring, pesticider og andre patogener. En stor fordel ved at bruge sådanne partikler er, at det i høj grad reducerer chancerne for at indføre ukendte variabler i efterfølgende eksperimenter sammenlignet med nuværende alternativer, såsom infektion via inficeret bi-hæmolymfe eller homogenat, selvom man stadig skal være forsigtig, når man køber bierne, for at minimere baggrundsvirusforurening. Buranalyserne er ikke en erstatning for store, feltrealistiske eksperimenter, der tester virusinfektionseffekter på koloniniveau, men fungerer i stedet som en metode til at etablere baseline virale responser, der i kombination med de halvrene viruspartikler kan tjene som vigtige værktøjer til at undersøge forskellige dimensioner af honningbivirus fysiologiske interaktioner.

En vellykket opfølgning af protokollerne (figur 1) for puppeinjektion og viral ekstraktion bør producere store mængder viruspartikler. Prøveudtagning og injektion af pupper hentet fra en række kolonier på flere tidspunkter maksimerer imidlertid chancerne for at erhverve målvirus med lav forurening. Den dynamik, hvormed vira replikerer og interagerer med hinanden inden for en honningbi, forstås ikke godt; kombineret med sandsynligheden for allerede eksisterende infektion er der ingen garanti for, ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Her beskriver vi to protokoller: for det første at formere, udtrække, rense og kvantificere store mængder honningbi-ikke-indhyllede viruspartikler, herunder en metode til fjernelse af honningbipupper og for det andet at teste virkningerne af virusinfektion ved hjælp af et meget repeterbart burbioassay med høj gennemstrømning.

Fremstilling af virusberiget inokulum til oral infektion af honningbier (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Udarbejdelse af pancreas acinarceller til brug ved Calcium Imaging, celleskade Målinger og adenovirusinfektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Metoder til Sammenligning Næringsstoffer i Beebread Lavet af Africanized og europæiske honningbier og virkningerne på hæmolymfe Protein Titere

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone medium: Forberedelse og bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Dissektion og Observation af Honey Bee Dorsal Vessel for Studier af hjertefunktion

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Overvågning koloni-niveau virkninger i subletale pesticid eksponering på honningbier

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Mundtlige bakterieinfektion og kaste i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Vurdering agrokemisk risiko for parrede honningbi dronninger

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Et forbedret kemotaxisassay til hurtig identifikation af rhizobakterielle kemotiltrapitter i rodexsudater

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...