Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

We willen Dr. Julia Fine bedanken voor haar ideeën en discussie tijdens het proces van het maken van het protocol, evenals Dr. Cassondra Vernier voor haar nuttige opmerkingen tijdens het bewerken. Deze materialen droegen bij aan projecten die mede werden ondersteund door de Foundation for Food and Agriculture Research, onder subsidie ID 549025.

1. Massale bijenextractie optie 1: larvale zelfverwijdering
<ol><li>Kooi een honingbijenkoningin op een lege, uitgesponnen Langstroth-frame en breng haar terug naar haar kolonie. Laat de koningin 24 uur lang eieren leggen op dit frame.<ol>
<li>Controleer het frame na 24 uur om er zeker van te zijn dat de meeste kamcellen nieuw gelegde eieren bevatten. Afhankelijk van de koningin en kolonie worden eieren soms niet goed gelegd in de eerste 24 uur. Als dit gebeurt, houd dan rekening met een extra 24 uur en pas de tijd ind...

Hier hebben we methoden beschreven die elke stap van het virusversterkings- en entmateriaalbereidingsproces beschrijven, inclusief het verzamelen van larven en virusvermeerdering, extractie en concentratie, evenals virale behandeling in de vorm van kooivoedingsexperimenten. Deze methoden maken de productie van semi-zuivere virusdeeltjes mogelijk (figuur 4), waarvan de effectiviteit consequent kan worden gekwantificeerd door dosis-respons mortaliteitstests voor virussen die dodelijk zijn voor...

Honingbijen (Apis mellifera) spelen een cruciale rol in het moderne wereldwijde landbouwlandschap, maar lijden momenteel aan een combinatie van biotische en abiotische stressoren, waaronder blootstelling aan pesticiden, slecht ruwvoer, parasieten en pathogenen 1,2. Een van de belangrijkste pathogenen van zorg zijn virussen, waarvan er vele worden overgedragen door een andere van de belangrijkste honingbijstressoren, de parasitaire Varroamijt (Varroa destructor). Deze virussen kunnen een reeks negatieve effecten bij honingbijen veroorzaken, waaronder verminderde broedoverleving, ontwikkelingsstoornissen en verlamming die kunnen leiden tot totale ineenstorting van de korf, zowel voor als na overwinteringsperioden 3,4,5. Hoewel er veelbelovende vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling van technologieën die worden gebruikt om virusinfecties te bestrijden 6,7,8,9, is de dynamiek waarmee veel virussen zich verspreiden, verspreiden en interageren binnen een honingbij of kolonie nog steeds slecht begrepen 5,10 . Het begrijpen van de basisbiologie van honingbij- en virusinteracties en hun relaties met andere omgevingsfactoren is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van effectieve virusbeheertechnieken.
Het bestuderen van interacties tussen honingbijen en virussen vormt echter uitdagingen met tal van bekende en onbekende factoren die het proces bemoeilijken. Deze omvatten interacties met dieet11,12, blootstelling aan pesticiden13 en genetische achtergrond bijen14,15. Zelfs wanneer ze zich alleen richten op virusinfectie, komen complicaties vaak voor omdat honingbijenpopulaties, zowel beheerd als wild, altijd een zekere mate van achtergrondvirusinfectie hebben, hoewel vaak zonder acute symptomen te manifesteren16,17, en de effecten van virus-co-infectie zijn niet goed begrepen18. Dit heeft de studie van honingbijviruseffecten moeilijk te ontwarren gemaakt.
Veel honingbijvirusstudies hebben circumstantial virusinfecties gebruikt om te zoeken naar interacties met andere stressoren, waarbij wordt waargenomen hoe achtergrondinfecties veranderen met andere behandelingen 12,19,20,21. Hoewel deze aanpak succesvol is geweest bij het identificeren van belangrijke effecten, met name het ontdekken hoe pesticiden of dieetbehandelingen de virusniveaus en replicatie beïnvloeden, is inenting met een virusbehandeling met bekende inhoud en concentratie van cruciaal belang voor het experimenteel testen van de dynamiek van virusinfecties. Toch kan het scheiden van experimentele behandeling van achtergrondinfectie ook uitdagingen opleveren. In veldstudies hebben onderzoekers stammen van het misvormde vleugelvirus (DWV) gedifferentieerd om bewijs te leveren voor virusoverdracht van honingbijen naar hommels22, maar het gebruik van deze aanpak zou moeilijk zijn bij honingbijen alleen. Virus infectieuze klonen zijn een krachtig hulpmiddel, niet alleen voor het volgen van infectie 23,24,25 maar ook voor omgekeerde genetische studies van honingbijvirussen en voor virus-gastheer interactie onderzoek 26,27,28. In de meeste gevallen zijn infectieuze klonen echter nog steeds nodig om de infectiecyclus in cellen te vervullen om deeltjes te produceren. Dergelijke deeltjes hebben de voorkeur als inocula voor experimentele behandelingen omdat hun infectiviteit hoger is dan het naakte virale RNA en inenting met ingekapselde genomen een natuurlijke infectie nabootst.
De productie van zuivere, niet-verontreinigde inencula uit het honingbijenvirus (virusstammen van het wilde type of stammen die zijn afgeleid van infectieuze klonen) vormt ook een uitdaging. Deze zijn voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden bij het verkrijgen van een betrouwbare, continu replicerende, virusvrije honingbijencellijn om zuivere stamvirussen te produceren29,30. Hoewel sommige cellijnen zijn geproduceerd, blijven deze systemen onvolmaakt; toch is er hoop dat er een levensvatbare cellijn kan worden geproduceerd29, die een fijnere controle van de virusproductie en -onderzoek mogelijk zou maken. Totdat een dergelijke lijn op grote schaal beschikbaar komt, zullen de meeste virusproductieprotocollen blijven vertrouwen op het gebruik van in vivo virusproductie en -zuivering 18,31,32,33,34. Deze benaderingen omvatten het identificeren en zuiveren van virusdeeltjes van belang (of het produceren van een infectieuze kloon) en het gebruik ervan om honingbijen te infecteren, meestal als poppen. De poppen worden geïnjecteerd met het doelvirus en vervolgens opgeofferd, en verdere deeltjes worden geëxtraheerd en gezuiverd. Omdat echter geen bijen om te beginnen virusvrij zijn, is er altijd een zekere mate van besmetting van sporen van andere virussen in een dergelijk concentraat, en daarom moet grote zorg worden besteed aan het kiezen van bijen met een lage kans op achtergrondinfecties. Verder zijn methoden voor het verwijderen van de poppen uit de kamcellen voor gebruik in deze protocollen33 zeer arbeidsintensief en kunnen ze stress bij de bijen veroorzaken, waardoor de productie op deze manier wordt beperkt18,32. Hier rapporteren we een alternatieve methode die grootschalige verwijdering van larven mogelijk maakt met weinig arbeid en minder mechanische stress op de bijen.
Zodra poppen zijn verkregen en geïnjecteerd met het beginnende virus entmateriaal, moeten ze worden geïncubeerd om het virus de tijd te geven zich te vermenigvuldigen. Vervolgens kunnen geproduceerde virusdeeltjes worden verwerkt tot een vorm die bruikbaar is om experimentele bijen te infecteren. Er zijn verschillende eenvoudige methoden om dit te bereiken, waaronder het gebruik van een ruw homogenaat35,36 of hemolymfe gegenereerd door viraal geïnfecteerde bijen als een bron van infectie37. Deze methoden zijn effectief, maar lopen op een grotere kans om onbekende variabelen uit het achtergrondsubstraat te introduceren (bijvoorbeeld andere factoren in de dode bijenhomogenaten). Bovendien is het wenselijk om de deeltjes te concentreren als een experiment vereist dat in korte tijd een grote, bekende dosis van een virus wordt gegeven. Daarom heeft het voor een betere controle de voorkeur om methoden te gebruiken die een zekere mate van zuivering en concentratie van de virusdeeltjes mogelijk maken. Over het algemeen zal een reeks neerslag- en centrifugeringsstappen resulteren in de verwijdering van bijna al het mogelijke niet-doelvirusmateriaal33.
Na de productie van dit geconcentreerde entmateriaal is het gunstig om de virale titers (qPCR) te kwantificeren en te karakteriseren met in vivo bioassays om de levensvatbaarheid en het vermogen om sterfte te veroorzaken te testen, en om te bevestigen dat verhoogde virustiters worden verkregen na infectie. Dit kan worden bereikt door injectie-experimenten (in poppen of volwassenen) of voedingsexperimenten (in larven of volwassenen). Hoewel al deze benaderingen mogelijk zijn, is het voeren aan groepen volwassen bijen in een kooi vaak de snelste en eenvoudigste. De kooitestmethode wordt ook veel gebruikt voor het testen van verschillende andere behandelingen op bijen, waaronder pesticidentoxiciteit38, ovariumontwikkeling39 en voedingsinvloed op gedrag40,41 en kan daarom een goede basis vormen voor experimenten die virusinfectie koppelen aan andere factoren42.
Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het produceren van grote hoeveelheden semi-zuivere, hoogverrijkte virusdeeltjes zonder een dure ultracentrifuge te gebruiken, inclusief een methode voor het verwijderen van poppen die arbeid en mechanische stress op de bijen vermindert en een zeer herhaalbare, high-throughput bioassay voor het testen van virale infectie en effecten. Door de zuiverheid van het virale entapparaat strak te controleren, kunnen onderzoekers de variatie in de virale respons van honingbijen verminderen ten opzichte van andere virale inentingsmethoden. Bovendien kan de bioassay screenen op virale effecten op een niveau van kleine groepen met behulp van zeer herhaalbare experimentele eenheden voordat wordt geschaald naar veldrealistische instellingen, wat veel arbeidsintensiever is om te beheren. In combinatie bieden deze twee methoden de nodige hulpmiddelen voor studies die kunnen helpen ons algehele begrip van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te verbeteren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honingbijen zijn van groot ecologisch en agrarisch belang over de hele wereld, maar zijn ook onderhevig aan een verscheidenheid aan druk die de gezondheid van bijen negatief beïnvloedt, waaronder blootstelling aan virale pathogenen. Dergelijke virussen kunnen een breed scala aan verwoestende effecten veroorzaken en kunnen vaak een uitdaging zijn om te bestuderen vanwege meerdere factoren die het moeilijk maken om de effecten van experimentele behandelingen te scheiden van reeds bestaande achtergrondinfectie. Hier presenteren we een methode om grote hoeveelheden virusdeeltjes massaal te produceren, samen met een bioassay met hoge doorvoer om virale infecties en effecten te testen. Noodzakelijk door het huidige gebrek aan een continue, virusvrije cellijn van honingbijen, worden virale deeltjes in vivo versterkt met behulp van honingbijpoppen, die in grote hoeveelheden uit de korf worden geëxtraheerd met behulp van minimaal stressvolle methodologie. Deze virusdeeltjes kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays van honingbijenkooien om de levensvatbaarheid van inentcula te testen, evenals verschillende andere virusinfectiedynamiek, waaronder interacties met voeding, pesticiden en andere pathogenen. Een groot voordeel van het gebruik van dergelijke deeltjes is dat het de kans op het introduceren van onbekende variabelen in latere experimenten aanzienlijk vermindert in vergelijking met de huidige alternatieven, zoals infectie via geïnfecteerde bijenhemolymfe of homogenaat, hoewel er nog steeds voorzichtig moet worden omgegaan bij het vinden van de bijen, om achtergrondvirusbesmetting te minimaliseren. De kooitests zijn geen vervanging voor grootschalige, veldrealistische experimenten die virusinfectie-effecten op kolonieniveau testen, maar functioneren in plaats daarvan als een methode om baseline virale reacties vast te stellen die, in combinatie met de semi-zuivere virusdeeltjes, kunnen dienen als belangrijke hulpmiddelen om verschillende dimensies van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te onderzoeken.

Het succesvol volgen van de protocollen (figuren 1) voor popinjectie en virale extractie zou grote hoeveelheden virusdeeltjes moeten produceren. Het bemonsteren en injecteren van poppen afkomstig uit verschillende kolonies op meerdere tijdstippen maximaliseert echter de kans op het verkrijgen van doelvirus met een lage besmetting. De dynamiek waarmee virussen zich binnen een honingbij vermenigvuldigen en met elkaar interageren, is niet goed begrepen; in combinatie met de waarschijnlijkheid van reeds best...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protocollen voor orale infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Extractie van de EVP-component van de Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Methoden voor het vergelijken Voedingsstoffen in beebread Gemaakt door Africanized en Europese honingbijen en de Effecten op Hemolymfe Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone Geconditioneerd Medium: Voorbereiding en Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Dissectie en observatie van Honey Bee Dorsale Vessel voor Studies van de hartfunctie

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Toezicht op de gevolgen van de kolonie-niveau van blootstelling van de subletale bestrijdingsmiddelen voor bijen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Mondelinge bacteriële infectie en Shedding bij Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...