Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Nous tenons à remercier la Dre Julia Fine pour ses idées et ses discussions au cours du processus de création du protocole, ainsi que la Dre Cassondra Vernier pour ses commentaires utiles tout au long de l’édition. Ces documents ont contribué à des projets qui ont été soutenus en partie par la Fondation pour la recherche sur l’alimentation et l’agriculture, dans le cadre de la subvention ID 549025.

1. Option d’extraction massive des abeilles 1 : auto-élimination larvaire
<ol><li>Mettez en cage une reine des abeilles sur un cadre Langstroth vide et étiré et ramenez-la dans sa colonie. Laissez la reine pondre des œufs sur ce cadre pendant 24 h.<ol>
<li>Vérifiez le cadre après 24 h pour vous assurer que la plupart des cellules du peigne contiennent des œufs nouvellement pondus. Selon la reine et la colonie, les œufs ne sont parfois pas très bien pondus dans les premières 24 heures. Si cela se produit, pr...

Ici, nous avons décrit des méthodes détaillant chaque étape du processus d’amplification du virus et de préparation du stock d’inoculum, y compris la collecte des larves et la propagation, l’extraction et la concentration du virus, ainsi que le traitement viral sous la forme d’expériences d’alimentation en cage. Ces méthodes permettent de produire des particules virales semi-pures (figure 4), dont l’efficacité peut être quantifiée de manière cohérente par des tests de...

Les abeilles mellifères (Apis mellifera) jouent un rôle essentiel dans le paysage agricole mondial moderne, mais souffrent actuellement d’une combinaison de facteurs de stress biotiques et abiotiques, notamment l’exposition aux pesticides, le mauvais fourrage, les parasites et les agents pathogènes 1,2. L’un des agents pathogènes les plus préoccupants sont les virus, dont beaucoup sont vecteurs par un autre des principaux facteurs de stress des abeilles mellifères, l’acarien parasite Varroa (Varroa destructor). Ces virus peuvent causer une série d’effets négatifs chez les abeilles mellifères, y compris une réduction de la survie de la couvée, des défauts de développement et une paralysie qui peuvent entraîner l’effondrement total de la ruche avant et après les périodes d’hivernage 3,4,5. Bien qu’il y ait eu des progrès prometteurs dans le développement de technologies utilisées pour lutter contre l’infection virale 6,7,8,9, la dynamique par laquelle de nombreux virus se propagent, se propagent et interagissent au sein d’une abeille ou d’une colonie mellifère est encore mal comprise 5,10 . Il est essentiel de comprendre la biologie de base des interactions entre les abeilles mellifères et les virus et leurs relations avec d’autres facteurs environnementaux pour mettre au point des techniques efficaces de gestion des virus.
Cependant, l’étude des interactions abeilles-virus pose des défis avec de nombreux facteurs connus et inconnus compliquant le processus. Il s’agit notamment des interactions avec l’alimentation 11,12, l’expositionaux pesticides 13 et le fond génétique desabeilles 14,15. Même en se concentrant uniquement sur l’infection virale, les complications sont fréquentes parce que les populations d’abeilles mellifères, à la fois gérées et sauvages, ont toujours un certain degré d’infection virale de fond, bien que souvent sans manifester de symptômes aigus 16,17, et les effets de la co-infection virale ne sont pas bien compris 18. Cela a rendu l’étude des effets du virus de l’abeille mellifère difficile à démêler.
De nombreuses études sur le virus de l’abeille mellifère ont utilisé des infections virales circonstancielles pour rechercher des interactions avec d’autres facteurs de stress, en observant comment les infections de fond changent avec d’autres traitements 12,19,20,21. Bien que cette approche ait réussi à identifier des effets importants, en particulier la découverte de la façon dont les pesticides ou les traitements diététiques affectent les niveaux et la réplication du virus, l’inoculation avec un traitement par virus dont le contenu et la concentration connus est essentielle pour tester expérimentalement la dynamique de l’infection virale. Malgré cela, séparer le traitement expérimental de l’infection de fond peut également poser des défis. Dans les études sur le terrain, les chercheurs ont différencié les souches du virus des ailes déformées (DWV) pour fournir des preuves de la transmission du virus des abeilles mellifères aux bourdons22, mais l’utilisation de cette approche serait difficile chez les abeilles mellifères seules. Les clones infectieux de virus sont un outil puissant, non seulement pour le suivi de l’infection 23,24,25, mais aussi pour les études de génétique inverse des virus des abeilles mellifères et pour la recherche sur l’interaction virus-hôte 26,27,28. Cependant, dans la plupart des cas, des clones infectieux sont toujours nécessaires pour remplir le cycle d’infection à l’intérieur des cellules pour produire des particules. De telles particules sont préférées comme inocula pour les traitements expérimentaux parce que leur infectiosité est supérieure à celle de l’ARN viral nu et que l’inoculation avec des génomes encapsidés imite une infection naturelle.
La production d’inocula pur et non contaminé du virus de l’abeille mellifère (souches virales de type sauvage ou dérivées de clones infectieux) pose également des défis. Celles-ci sont principalement dues aux difficultés d’obtenir une lignée cellulaire d’abeilles mellifères fiable, se répliquant en continu et sans virus pour produire des virus de souche pure29,30. Bien que certaines lignées cellulaires aient été produites, ces systèmes restent imparfaits; Néanmoins, il y a de l’espoir qu’une lignée cellulaire viable puisse être produite29, ce qui permettrait un contrôle plus fin de la production et de l’investigation du virus. Jusqu’à ce qu’une telle ligne devienne largement disponible, la plupart des protocoles de production de virus continueront de reposer sur l’utilisation de la production et de la purification de virus in vivo 18,31,32,33,34. Ces approches consistent à identifier et à purifier les particules virales d’intérêt (ou à produire un clone infectieux) et à les utiliser pour infecter les abeilles mellifères, généralement sous forme de pupes. Les nymphes sont injectées avec le virus cible, puis sacrifiées, et d’autres particules sont extraites et purifiées. Cependant, comme aucune abeille n’est exempte de virus au départ, il y a toujours un certain degré de contamination par des traces d’autres virus dans un tel concentré et, par conséquent, il faut faire très attention au choix des abeilles présentant une faible probabilité d’infections de fond. En outre, les méthodes d’élimination des nymphes des cellules du peigne pour les utiliser dans ces protocoles33 nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent induire un stress chez les abeilles, limitant la production par ces moyens18,32. Ici, nous rapportons une méthode alternative qui permet l’élimination à grande échelle des larves avec peu de travail et moins de stress mécanique sur les abeilles.
Une fois que les nymphes sont obtenues et injectées avec l’inoculum du virus de départ, elles doivent être incubées pour donner au virus le temps de se répliquer. Par la suite, les particules virales produites peuvent être transformées en une forme utilisable pour infecter les abeilles expérimentales. Il existe plusieurs méthodes simples pour y parvenir, notamment l’utilisation d’un homogénat brut35,36 ou d’une hémolymphe générée par des abeilles infectées par le virus comme source d’infection37. Ces méthodes sont efficaces, mais elles ont plus de chances d’introduire des variables inconnues à partir du substrat de fond (p. ex., d’autres facteurs dans les homogénats d’abeilles mortes). De plus, il est souhaitable de concentrer les particules si une expérience nécessite de donner une forte dose connue d’un virus dans un court laps de temps. Par conséquent, pour un meilleur contrôle, il est préférable d’utiliser des méthodes qui permettent un certain niveau de purification et de concentration des particules virales. En général, une série d’étapes de précipitation et de centrifugation entraînera l’élimination de presque tout le matériel viral non ciblé possible33.
Après avoir produit cet inoculum concentré, il est bénéfique de quantifier les titres viraux (qPCR) et de le caractériser avec des essais biologiques in vivo pour tester sa viabilité et sa capacité à causer la mortalité, ainsi que pour corroborer que des titres de virus accrus sont obtenus après l’infection. Cela peut être réalisé par des expériences d’injection (soit chez des pupes ou des adultes) ou des expériences d’alimentation (chez des larves ou des adultes). Bien que toutes ces approches soient possibles, nourrir des groupes d’abeilles adultes dans une cage est souvent le plus rapide et le plus simple. La méthode de dosage en cage est également largement utilisée pour tester divers autres traitements sur les abeilles, y compris la toxicité des pesticides38, le développement des ovaires39 et l’influence nutritionnelle sur le comportement40,41 et, par conséquent, peut constituer une bonne base pour des expériences liant l’infection virale à d’autres facteurs42.
Nous décrivons ici une méthode fiable pour produire de grandes quantités de particules virales semi-pures et hautement enrichies sans utiliser une ultracentrifugeuse coûteuse, y compris une méthode d’élimination des pupes qui réduit le travail et le stress mécanique sur les abeilles et un essai biologique hautement reproductible et à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. En contrôlant étroitement la pureté de l’inocula viral, les chercheurs sont en mesure de réduire la variation de la réponse virale des abeilles mellifères par rapport à d’autres méthodes d’inoculation virale. En outre, le bioessai peut dépister les effets viraux au niveau de petits groupes à l’aide d’unités expérimentales hautement reproductibles avant d’être mis à l’échelle vers des paramètres réalistes sur le terrain, ce qui nécessite beaucoup plus de main-d’œuvre. En combinaison, ces deux méthodes fournissent les outils nécessaires pour les études qui peuvent aider à améliorer notre compréhension globale des interactions physiologiques abeilles-virus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Les abeilles mellifères sont d’une grande importance écologique et agricole dans le monde entier, mais sont également soumises à diverses pressions qui affectent négativement la santé des abeilles, y compris l’exposition à des agents pathogènes viraux. De tels virus peuvent causer une grande variété d’effets dévastateurs et peuvent souvent être difficiles à étudier en raison de multiples facteurs qui rendent difficile la séparation des effets des traitements expérimentaux de l’infection de fond préexistante. Nous présentons ici une méthode pour produire en masse de grandes quantités de particules virales ainsi qu’un essai biologique à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. Rendues nécessaires par l’absence actuelle d’une lignée cellulaire continue et exempte de virus, les particules virales sont amplifiées in vivo à l’aide de pupes d’abeilles mellifères, qui sont extraites de la ruche en grands volumes en utilisant une méthodologie peu stressante. Ces particules virales peuvent ensuite être utilisées dans les essais biologiques en cage d’abeilles mellifères pour tester la viabilité de l’inocula, ainsi que diverses autres dynamiques d’infection virale, y compris les interactions avec la nutrition, les pesticides et d’autres agents pathogènes. Un avantage majeur de l’utilisation de telles particules est qu’elle réduit considérablement les chances d’introduire des variables inconnues dans les expérimentations ultérieures par rapport aux alternatives actuelles, telles que l’infection par l’hémolymphe ou l’homogénat d’abeille infectée, bien qu’il faille toujours faire attention lors de l’approvisionnement des abeilles, à minimiser la contamination virale de fond. Les essais en cage ne remplacent pas les expériences réalistes à grande échelle qui testent les effets de l’infection virale au niveau de la colonie, mais fonctionnent plutôt comme une méthode pour établir des réponses virales de base qui, en combinaison avec les particules virales semi-pures, peuvent servir d’outils importants pour examiner diverses dimensions des interactions physiologiques entre les abeilles mellifères et les virus.

Le respect réussi des protocoles (figures 1) pour l’injection nymphale et l’extraction virale devrait produire de grandes quantités de particules virales. Cependant, l’échantillonnage et l’injection de pupes provenant de diverses colonies à plusieurs moments maximisent les chances d’acquérir le virus cible avec une faible contamination. La dynamique par laquelle les virus se répliquent et interagissent les uns avec les autres au sein d’une abeille mellifère n’est pas bien comprise; e...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.

Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

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