Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Wir möchten Dr. Julia Fine für ihre Ideen und Diskussionen während des Protokollerstellungsprozesses sowie Dr. Cassondra Vernier für ihre hilfreichen Kommentare während der Bearbeitung danken. Diese Materialien trugen zu Projekten bei, die zum Teil von der Foundation for Food and Agriculture Research unter der Förderkennung 549025 unterstützt wurden.

1. Massenbienenextraktionsoption 1: Selbstentfernung der Larven
<ol><li>Käfig einer Honigbienenkönigin auf einem leeren, langgezogenen Langstroth-Rahmen und bringen Sie sie in ihre Kolonie zurück. Lassen Sie die Königin 24 Stunden lang Eier auf diesen Rahmen legen.<ol>
<li>Überprüfen Sie den Rahmen nach 24 Stunden, um sicherzustellen, dass die meisten Kammzellen neu gelegte Eier enthalten. Je nach Königin und Kolonie werden Eier in den ersten 24 h manchmal nicht sehr gut gelegt. In diesem Fall sollten Sie zusät...

Hier haben wir Methoden beschrieben, die jeden Schritt der Virusamplifikation und des Impfbestandsvorbereitungsprozesses detailliert beschreiben, einschließlich der Larvensammlung und Virusvermehrung, -extraktion und -konzentration sowie der Virusbehandlung in Form von Käfigfütterungsexperimenten. Diese Methoden ermöglichen die Herstellung von halbreinen Viruspartikeln (Abbildung 4), deren Wirksamkeit durch Dosis-Wirkungs-Mortalitätstests für Viren, die für Erwachsene tödlich sind, k...

Honigbienen (Apis mellifera) spielen eine entscheidende Rolle in der modernen globalen Agrarlandschaft, leiden aber derzeit unter einer Kombination aus biotischen und abiotischen Stressfaktoren, einschließlich Pestizidbelastung, schlechtem Futter, Parasiten und Krankheitserregern 1,2. Einer der wichtigsten Krankheitserreger sind Viren, von denen viele von einem anderen der wichtigsten Honigbienenstressoren, der parasitären Varroa-Milbe (Varroa destructor), übertragen werden. Diese Viren können eine Reihe von negativen Auswirkungen bei Honigbienen verursachen, darunter ein vermindertes Brutüberleben, Entwicklungsdefekte und Lähmungen, die sowohl vor als auch nach Überwinterungsperioden zu einem totalen Bienenstockkollaps führenkönnen 3,4,5. Obwohl es vielversprechende Fortschritte bei der Entwicklung von Technologien zur Bekämpfung von Virusinfektionen gegeben hat 6,7,8,9, ist die Dynamik, durch die sich viele Viren innerhalb einer Honigbiene oder eines Honigvolkes ausbreiten, verbreiten und interagieren, immer noch wenig verstanden 5,10 . Das Verständnis der grundlegenden Biologie von Honigbienen- und Virusinteraktionen und ihrer Beziehungen zu anderen Umweltfaktoren ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Virusmanagementtechniken.
Die Untersuchung von Honigbienen-Virus-Interaktionen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da zahlreiche bekannte und unbekannte Faktoren den Prozess erschweren. Dazu gehören Wechselwirkungen mit der Ernährung 11,12, die Pestizidbelastung 13 und der genetische Hintergrundder Bienen 14,15. Selbst wenn man sich nur auf die Virusinfektion konzentriert, sind Komplikationen häufig, da Honigbienenpopulationen, sowohl verwaltete als auch wilde, immer ein gewisses Maß an Hintergrundvirusinfektion aufweisen, wenn auch oft ohne akute Symptome zu manifestieren16,17, und die Auswirkungen der Viruskoinfektion sind nicht gut verstanden 18. Dies hat es schwierig gemacht, die Auswirkungen des Honigbienenvirus zu entwirren.
Viele Honigbienenvirusstudien haben Indizienvirusinfektionen verwendet, um nach Wechselwirkungen mit anderen Stressfaktoren zu suchen und zu beobachten, wie sich Hintergrundinfektionen mit anderen Behandlungenändern 12,19,20,21. Während dieser Ansatz erfolgreich bei der Identifizierung wichtiger Effekte war, insbesondere bei der Entdeckung, wie sich Pestizide oder diätetische Behandlungen auf das Virusniveau und die Replikation auswirken, ist die Inokulation mit einer Virusbehandlung mit bekanntem Inhalt und bekannter Konzentration entscheidend für experimentelle Tests der Virusinfektionsdynamik. Dennoch kann die Trennung der experimentellen Behandlung von der Hintergrundinfektion auch Herausforderungen mit sich bringen. In Feldstudien haben Forscher Stämme des deformierten Flügelvirus (DWV) differenziert, um Beweise für die Virusübertragung von Honigbienen auf Hummeln22 zu liefern, aber die Verwendung dieses Ansatzes wäre bei Honigbienen allein schwierig. Virusinfektiöse Klone sind ein leistungsfähiges Werkzeug, nicht nur für die Verfolgung von Infektionen 23,24,25, sondern auch für umgekehrte genetische Studien von Honigbienenviren und für die Virus-Wirt-Interaktionsforschung26,27,28. In den meisten Fällen sind jedoch immer noch infektiöse Klone erforderlich, um den Infektionszyklus in Zellen zu erfüllen, um Partikel zu produzieren. Solche Partikel werden als Impfmittel für experimentelle Behandlungen bevorzugt, da ihre Infektiosität höher ist als die nackte virale RNA und die Impfung mit verkapselten Genomen eine natürliche Infektion nachahmt.
Die Produktion von reinen, nicht kontaminierten Honigbienenvirus-Inokula (Wildtyp-Virusstämme oder solche, die von infektiösen Klonen stammen) stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Diese sind in erster Linie auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, eine zuverlässige, kontinuierlich replizierende, virusfreie Honigbienenzelllinie zur Herstellung von Reinstammviren zu erhalten29,30. Während einige Zelllinien produziert wurden, bleiben diese Systeme unvollkommen; Dennoch besteht die Hoffnung, dass eine lebensfähige Zelllinie produziert werdenkann 29, die eine feinere Kontrolle der Virusproduktion und -untersuchung ermöglichen würde. Bis eine solche Linie allgemein verfügbar ist, werden die meisten Virenproduktionsprotokolle weiterhin auf die Verwendung von In-vivo-Virusproduktion und -reinigung angewiesen sein 18,31,32,33,34. Diese Ansätze beinhalten die Identifizierung und Reinigung von Viruspartikeln von Interesse (oder die Herstellung eines infektiösen Klons) und deren Verwendung zur Infektion von Honigbienen, normalerweise als Puppen. Die Puppen werden mit dem Zielvirus injiziert und dann geopfert, und weitere Partikel werden extrahiert und gereinigt. Da jedoch keine Bienen von vornherein virenfrei sind, gibt es immer ein gewisses Maß an Kontamination durch Spuren anderer Viren in einem solchen Konzentrat, und daher muss bei der Auswahl von Bienen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von Hintergrundinfektionen große Sorgfalt angewendet werden. Darüber hinaus sind Methoden zur Entfernung der Puppen aus den Kammzellen zur Verwendung in diesen Protokollen 33 sehr arbeitsintensiv und können Stress bei den Bienen auslösen, wodurch die Produktion auf diese Weise begrenztwird 18,32. Hier berichten wir über eine alternative Methode, die eine großflächige Entfernung von Larven mit wenig Arbeit und weniger mechanischer Belastung der Bienen ermöglicht.
Sobald Puppen erhalten und mit dem Startvirus-Inokulum injiziert wurden, müssen sie inkubiert werden, um dem Virus Zeit zu geben, sich zu replizieren. Anschließend können produzierte Viruspartikel zu einer Form verarbeitet werden, die zur Infektion experimenteller Bienen verwendet werden kann. Es gibt mehrere einfache Methoden, um dies zu erreichen, einschließlich der Verwendung eines rohen Homogenats 35,36 oder Hämolymph, das von viral infizierten Bienen als Infektionsquelle erzeugtwird 37. Diese Methoden sind effektiv, haben aber eine größere Chance, unbekannte Variablen aus dem Hintergrundsubstrat einzuführen (z. B. andere Faktoren in den toten Bienenhomogenaten). Darüber hinaus ist es wünschenswert, die Partikel zu konzentrieren, wenn ein Experiment eine große, bekannte Dosis eines Virus in kurzer Zeit erfordert. Daher ist es für eine bessere Kontrolle vorzuziehen, Methoden zu verwenden, die ein gewisses Maß an Reinigung und Konzentration der Viruspartikel ermöglichen. Im Allgemeinen führt eine Reihe von Fällungs- und Zentrifugationsschritten zur Entfernung fast aller möglichen Nichtzielvirenmaterialien33.
Nach der Herstellung dieses konzentrierten Inokulums ist es vorteilhaft, die viralen Titer (qPCR) zu quantifizieren und mit In-vivo-Bioassays zu charakterisieren, um ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit, Mortalität zu verursachen, zu testen und zu bestätigen, dass nach der Infektion erhöhte Virustiter erhalten werden. Dies kann durch Injektionsexperimente (entweder in Puppen oder Erwachsene) oder Fütterungsexperimente (in Larven oder Erwachsene) erreicht werden. Während all diese Ansätze möglich sind, ist die Fütterung von Gruppen erwachsener Bienen in einem Käfig oft die schnellste und einfachste. Die Käfiguntersuchungsmethode wird auch häufig zum Testen verschiedener anderer Behandlungen an Bienen verwendet, einschließlich Pestizidtoxizität38, Eierstockentwicklung39 und Ernährungseinfluss auf das Verhalten 40,41 und kann daher eine gute Grundlage für Experimente bilden, die eine Virusinfektion mit anderen Faktorenverbinden 42.
Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Herstellung großer Mengen halbreiner, hochangereicherter Viruspartikel ohne Verwendung einer teuren Ultrazentrifuge, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Puppen, die den Arbeitsaufwand und die mechanische Belastung der Bienen reduziert, und eines hochgradig wiederholbaren Hochdurchsatz-Bioassays zum Testen von Virusinfektionen und -wirkungen. Durch die strenge Kontrolle der Reinheit der viralen Impfung sind die Forscher in der Lage, die Variation der Virusreaktion von Honigbienen im Vergleich zu anderen viralen Impfmethoden zu reduzieren. Darüber hinaus kann der Bioassay auf der Ebene kleiner Gruppen mit hochgradig wiederholbaren experimentellen Einheiten nach viralen Effekten suchen, bevor er auf feldrealistische Einstellungen skaliert wird, was weitaus arbeitsintensiver zu handhaben ist. In Kombination bieten diese beiden Methoden die notwendigen Werkzeuge für Studien, die dazu beitragen können, unser allgemeines Verständnis der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honigbienen sind weltweit von großer ökologischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, unterliegen aber auch einer Vielzahl von Belastungen, die sich negativ auf die Bienengesundheit auswirken, einschließlich der Exposition gegenüber viralen Krankheitserregern. Solche Viren können eine Vielzahl von verheerenden Auswirkungen verursachen und können aufgrund mehrerer Faktoren, die es schwierig machen, die Auswirkungen experimenteller Behandlungen von einer bereits bestehenden Hintergrundinfektion zu trennen, oft schwierig zu untersuchen sein. Hier stellen wir eine Methode zur Massenproduktion großer Mengen von Viruspartikeln zusammen mit einem Hochdurchsatz-Bioassay vor, um Virusinfektionen und -effekte zu testen. Aufgrund des derzeitigen Fehlens einer kontinuierlichen, virusfreien Honigbienenzelllinie werden die Viruspartikel in vivo mit Honigbienenpuppen verstärkt, die mit einer minimal-stressigen Methodik in großen Mengen aus dem Bienenstock extrahiert werden. Diese Viruspartikel können dann in Bioassays für Honigbienenkäfige verwendet werden, um die Inokula-Lebensfähigkeit sowie verschiedene andere Virusinfektionsdynamiken zu testen, einschließlich Wechselwirkungen mit Ernährung, Pestiziden und anderen Krankheitserregern. Ein großer Vorteil der Verwendung solcher Partikel besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, unbekannte Variablen in nachfolgende Experimente einzuführen, im Vergleich zu aktuellen Alternativen, wie z. B. einer Infektion über infizierte Bienenhämolymphe oder Homogenat, erheblich verringert wird, obwohl bei der Beschaffung der Bienen immer noch darauf geachtet werden sollte, die Kontamination mit Hintergrundviren zu minimieren. Die Käfigassays sind kein Ersatz für groß angelegte, feldrealistische Experimente, die die Auswirkungen von Virusinfektionen auf Kolonieebene testen, sondern dienen stattdessen als Methode zur Etablierung grundlegender viraler Reaktionen, die in Kombination mit den halbreinen Viruspartikeln als wichtige Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Dimensionen der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus dienen können.

Die erfolgreiche Befolgung der Protokolle (Abbildungen 1) für die Puppeninjektion und die Virusextraktion sollte große Mengen an Viruspartikeln erzeugen. Die Probenahme und Injektion von Puppen, die zu mehreren Zeitpunkten aus einer Vielzahl von Kolonien stammen, maximiert jedoch die Chancen, Zielviren mit geringer Kontamination zu erwerben. Die Dynamik, durch die sich Viren innerhalb einer Honigbiene replizieren und miteinander interagieren, ist nicht gut verstanden; In Verbindung mit der Wahrscheinli...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Forschung

Biologie

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Extraction der EVP-Komponente aus dem Oberflächen-EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Überwachung der Kolonie-Ebene Auswirkungen der subletalen Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung auf Honigbienen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Ein verbesserter Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktantien in Wurzelexsudaten

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...